白菜型冬油菜温敏不育系PK3-12S育性转换的差异蛋白质组学分析

为揭示温敏不育系PK3-12S育性转换机制,本研究以白菜型冬油菜温敏不育系PK3-12花药为材料,采用2-DE和LC-MS/MS质谱鉴定等差异蛋白组学方法,分离鉴定了PK3-12在不育/可育条件下花药差异表达蛋白质,并对差异表达蛋白进行了生物信息学分析;进而采用RT-PCR检测了PK3-12在不育/可育条件下花蕾发育进程中差异蛋白编码基因表达量变化。结果表明,高温不育条件下, PK3-12花药形态瘪小,药室有少量败育花粉,育性转换受1对隐性基因控制,表达变化量在2倍以上差异蛋白质点31个,其中增量表达蛋白质点6个,减量表达蛋白质点11个,表达完全抑制蛋白点12个,不育花药特异表达蛋白点2个。质谱鉴定出15个差异蛋白质,参与信号转导通路、二羧基乙醛酸代谢、糖酵解代谢、次生合成代谢、氨基酸生物合成、分支酸生物合成、碳代谢途径等细胞过程。Rubisco亚基连接蛋白编码基因BrrbcL开放读码框(open reading frame, ORF)长度为1095 bp,编码364个氨基酸;与可育花蕾相比,发育进程中不育花蕾BrrbcL基因、膜联蛋白基因(ANN)、BetVI过敏原家族基因(BetVI)表达明显下调,表明上述基因可能参与了温敏不育系PK3-12S育性的转换。     

甘蓝型油菜NCa细胞质雄性不育系统花药败育前期的基因差异表达

采用cDNA-AFLP技术研究了甘蓝型油菜NCa不育系、保持系和可育F1花药败育前期的基因差异表达谱。用224对引物对不育系、保持系及育性恢复F₁等3个材料的cDNA进行AFLP分析。回收、克隆可能与花药育性有关的差异条带,筛除假阳性,获得41条阳性差异条带（TDFs）;经测序、同源比对、功能预测,归并为35个非重复的TDFs。大多数TDFs在甘蓝型油菜中属首次报道。将已知功能的28个TDFs按其推测功能分为2大类10小类,82%的TDFs与细胞形态建成和降解、蛋白质合成、加工和转运、能量代谢、信号传导有关;基本涵盖花药发育相关的关键代谢过程。对其中7个TDFs基因进行了RT-PCR分析。结果表明,果胶甲酯酶基因和氨基酸通透酶基因都在不育系花蕾中大量表达,果胶甲酯酶基因在不育系叶片、保持系的花蕾、叶片中都没有检测到;而氨基酸通透酶基因有微量表达。驱动蛋白和乙醛脱氢酶主要在保持系花蕾中大量表达,而在不育系花蕾、叶片以及保持系叶片中都只有微量表达。玉米黄素环氧化酶（ZEP）和单脱氧抗坏血酸还原酶则在保持系花蕾、叶片和不育系叶片中大量表达,而在不育系花蕾中微量表达。花粉油体蛋白在不育系和保持系的花蕾中都有表达,不过保持系花蕾中的表达量约2倍于不育系花蕾;但是在两者的叶片组织中都没有检测到。本试验获得的差异表达基因对于了解油菜花药育性形成的调控机制提供了重要的分子信息。     

亚麻花蕾发育相关基因的表达研究

为进一步揭示显性核不育亚麻不育分子机理,以显性核不育亚麻不育株分离的可育花蕾和不育花蕾为研究材料,采用实时定量PCR技术和原位杂交技术,开展了G-E07-830、G-E07-330和G-E07-100这3个花蕾发育相关基因在亚麻花蕾中的时空表达模式。结果表明:原位杂交中G-E07-830、G-E07-330和G-E07-100基因在亚麻可育和不育花蕾绒毡层中表达特异性信号;实时定量PCR得出在早期不育亚麻花蕾中表达量显著大于其他发育时期的花蕾。     

红麻HcMS1基因的克隆、表达与功能分析

为挖掘红麻雄性不育核基因,解释红麻花蕾败育的分子机理,通过分析转录组数据,利用同源克隆的方法从红麻花药中克隆出拟南芥MALE STERILITY1(MS1)的同源不育基因,并命名为HcMS1基因。利用生物信息学方法对HcMS1蛋白进行结构、理化性质及亲缘关系等分析,并通过qRT-PCR分析HcMS1基因在红麻不育系、保持系不同时期的表达水平;构建过表达载体,利用叶盘法转化本氏烟草并对转基因烟草进行表型观察。HcMS1基因序列开放阅读框(ORF)为1 950 bp,编码649个氨基酸。生物信息学分析显示,HcMS1蛋白为亲水蛋白,定位在细胞核上且含有典型PHD-finger结构域,没有信号肽和跨膜区结构,与陆地棉MS1蛋白亲缘关系最近,其次为木槿MS1蛋白。qRT-PCR结果表明,HcMS1基因的表达量在保持系和不育系中均呈现先上升、后下降的趋势,且在红麻花蕾的四分体至单核期表达量最高,这与拟南芥中MS1基因表达模式一致;另外在保持系中基因的表达水平显著高于不育系,推测红麻败育与HcMS1基因的低量表达相关。通过遗传转化试验发现,HcMS1转基因烟草株型较矮,花萼大小不一,花筒长度缩短,并出现自交不结实的现象,说明红麻HcMS1基因的异源表达有影响本氏烟草正常育性的功能。从红麻花药中成功克隆出核不育相关基因HcMS1,并对其进行功能分析,为后续红麻雄性不育育种工作提供了一定的理论依据与基础。     

大白菜育性相关基因1F203片段的分离与表达分析

杂种优势的利用是提高白菜类作物产量的一个重要途径,也是遗传育种工作者集中研究的领域。为克服常规制种缺点,本课题组长期致力于雄性不育材料的创制,并积极在细胞和分子水平上分析其遗传规律。本次试验以大白菜核基因控制的雄性不育甲型两用系"AB01"(本课题组自主创制)可育植株和不育植株各级花蕾为材料,利用抑制消减杂交方法构建正反cDNA文库,并从中筛选出一个大白菜育性相关基因1F203片段;并利用白菜数据库及NCBI对该片段进行同源比对分析,确定其为SKS基因家族中的一员;同时利用RT-PCR技术对该片段进行了时空表达分析,明确其在可育植株成熟花粉中有较高表达。为接下来克隆该片段对应基因的全长序列,分析其生物学信息,研究其蛋白质功能提供帮助。     

白菜GRF转录因子家族全基因组鉴定、进化及表达模式分析

生长调控因子是植物中一类重要的转录因子,在白菜的生长、发育过程发挥重要作用。本研究利用生物信息学技术对白菜全基因组中的GRFs进行鉴定与分析,利用生物信息学方法分析白菜基因组中的15个GRF转录因子的蛋白质理化性质、基因结构、保守基序等,进一步研究其系统进化和表达模式。结果表明,15个BraGRF蛋白长度为347～538 aa,分子量为37.99～60.83 kD;保守基序motif 1、motif 2、motif 3是GRF蛋白中最保守的基序,BraGRF02、BraGRF03、BraGRF04、BraGRF11和BraGRF13是15个白菜GRF家族中活跃度最低的成员。白菜、拟南芥和水稻的GRFs可分为4个亚类,且同属于双子叶植物的白菜和拟南芥GRF转录因子亲缘关系更近;GRF家族成员在角果和茎中表达水平较高,其中Bra000575 (BraGRF08)和Bra011781 (BraGRF09)这2个基因在茎组织中的表达活性最高。通过对白菜GRF基因家族的生物信息学分析,揭示了白菜GRF转录因子在进化中的特点以及不同组织的表达特性,为后续进一步了解白菜GRF功能验证提供依据。     

甜菜雄性不育系及其保持系花蕾期差异蛋白分析

甜菜是重要的糖料作物之一,利用雄性不育系配制杂交种是甜菜育种的主要途径。为探索甜菜雄性不育形成机理,本研究以甜菜不育系(N9849)和保持系(960766)的现蕾期花蕾为试材,采用双向电泳、质谱鉴定、生物信息学分析方法,进行差异蛋白质组学研究。结果表明:不育系和保持系间差异表达蛋白21个,涉及8个功能类别,其中胁迫响应、碳水化合物代谢、花粉发育等功能类别所占比例较大。谷胱甘肽-S-转移酶、过氧化氢酶等在不育系中显著低表达,活性氧的清除能力弱,酶保护系统遭到破坏,代谢紊乱,可能导致了花粉败育;蔗糖合酶在不育系中表达量较低,碳水化合物代谢强度低,能量代谢匮乏促进了花粉不育的发生;Ⅲ型聚酮合酶A在保持系中显著高表达,可能是保持系维持育性的重要原因。本研究为解析甜菜雄性不育机理提供科学依据。     

温光敏核不育小麦C412S的育性转换及其APRT基因的表达

以选育的小麦(Triticum aestivum L.)温光敏核不育系C412S为试材,以C412S回交转育时的受体亲本C412为常规品系对照,通过分期播种试验研究了其育性转换特性。用涂抹压片法观察减数分裂和小孢子发育进程,用半定量RT-PCR技术分析不育与可育条件下不同发育时期的幼穗中腺嘌呤磷酸核糖基转移酶基因(APRT)的表达水平。结果表明,通过调整播种期改变雄性发育的温光条件,C412S表现出完全不育—高不育—半不育—正常可育的育性转换特性。C412S花粉败育的高峰在单核小孢子晚期,主要表现圆败型不育。C412S的育性敏感期是从花粉母细胞形成期到成熟花粉期,其中最敏感的时段是花粉母细胞形成期到减数分裂期。与对照相比,C412S的APRT1基因序列有个别碱基变异,但编码氨基酸序列没有变化。在花粉母细胞形成期至单核期,与晚播可育条件相比,早播不育的C412S幼穗中APRT基因转录水平下调,因此认为,其育性转换与幼穗中APRT基因转录水平有一定关系。     

油菜育性相关多聚半乳糖醛酸酶基因MF6的获得及表达分析

本研究目的在于利用化学杀雄剂"化杀灵WP1"诱导甘蓝型油菜R121产生雄性不育,并对花蕾中的差异表达基因进行分离、筛选及定量表达分析。首先,通过抑制消减杂交技术(SSH)和反向Northern斑点杂交技术,分离和筛选出在雄性不育花蕾中差异表达的基因片段。然后,将差异片段测序后在NCBI数据库中进行同源性比对及功能分析。最后,对差异表达基因进行反转录荧光定量表达(RT-QPCR)分析。本研究从筛选出来的6个阳性克隆中获得一个与多聚半乳糖醛酸酶基因(MF6)100%同源的基因片段,该基因被认为与花粉生长发育及花粉成熟密切相关。对MF6基因在不同长度及不同育性花蕾中的表达量进行了定量分析,结果显示,MF6基因在雄性可育花蕾中的表达量均高于雄性不育花蕾,且在蕾长1.00mm～1.50mm和3.50mm～4.00mm时分别达到了18.53倍和43.15倍的差异。因此,我们推测"化杀灵WP1"主要通过抑制花粉母细胞减数分裂时期中MF6基因的表达,使花粉产生败育;同时,MF6基因的表达可能也与花丝的伸长生长有关。     

一个与小麦雄性不育育性转换相关的MADS-box转录因子基因

为了揭示YS型小麦温敏雄性不育育性转换的基础, 构建了该类型不育系A3017的不育和可育幼穗正、反杂交的两个SSH-cDNA文库。经文库比较, 在不育文库中筛选出一个与MADS-box基因同源的EST序列(GenBank登录号: 36925702)。以该EST序列的同源性比对和拼接结果为依据, 设计引物对该基因在可育和不育幼穗中的表达进行了RT-PCR分析, 结果表明, 该基因在不育幼穗中表达量较高, 可育幼穗中表达量很低。对不育幼穗中扩增出的cDNA片段进行克隆测序, 获得了666 bp的cDNA序列。序列分析表明, 该片段编码160个氨基酸, 具有MADS-box转录因子的典型结构域K-box, 被定名为TaMS-MADSbox, 与一个小麦MADS box转录因子基因WAG的氨基酸序列的相似性为94%。进一步以3种不同类型的小麦雄性不育系和保持系的幼穗cDNA为材料, 利用半定量RT-PCR对该基因的表达模式分析发现也存在类似差异, 该基因在不育系幼穗中表达量较高, 而保持系幼穗中表达量较低。以上分析表明, 该MADS-box转录因子基因的表达与小麦雄性不育系的育性转化相关, 表达量高时表现雄性不育, 表达量低时表现雄性可育。     

甘蓝型油菜NCa CMS育性相关候选线粒体基因及其恢复基因的转录调控

用10个线粒体基因为探针，对NCa不育系、保持系和可育F1幼蕾的线粒体RNA进行了Northern检测。结果表明，atp6、atp1、cox1、cox2、cob、rrn5S和rnn26S等7个线粒体基因探针在不育系、保持系、可育F1中的转录没有差异，只有orf222、orf139和atp9等3个探针检测到转录本的差异。orf222和orf139分别在不育系和可育F1中产生相同大小和丰度的转录本，但是在保持系中没有检测到转录本；orf222检测到的3条转录本分别为1．1、0．9和0．6kb，orf139检测到0．8和0．6kb2条带。atp9探针在不育系和保持系中都检测到1条0．6kb转录本，而在可育F1中检测到0．6和1．2kb的转录本。NCaCMS不育的形成可能与orf222、orf39和atp9基因的表达有关。讨论了恢复基因在F1育性恢复过程中对育性相关候选基因的可能调控方式。     

水稻育性调控相关基因RNAi载体的构建及其表型鉴定

利用RNAi干扰技术研究不同基因对花粉发育、卵细胞发育和合子胚发育的影响是一种重要的手段。本研究通过筛选水稻在生殖发育过程中的9个重要调控基因,构建基因的RNAi表达载体,分析转基因植株育性及相关性状表型,以期探明RNAi表达载体对靶标性状的干扰效应。其中,AT61~AT63、AT64~AT66、AT67~AT69表达载体分别靶标花粉育性、卵细胞发育以及合子胚发育的调控。结果表明,除RNAi表达载体AT64没有获得转基因植株外,其余8个RNAi表达载体均获得了转基因植株;对T0代转基因植株的花粉育性、结实率以及潮霉素筛选(40 mg/L)发芽率检测的统计结果显示,RNAi表达载体AT62(花粉发育调控)、AT65(卵细胞发育调控)和AT67(合子胚发育调控)的干扰效应较强。本研究结果将为创制新型水稻基因工程不育系提供策略和选择。     

水稻光敏核不育基因相关蛋白产物初步研究

寻找与光敏不育基因表达特异相关的蛋白产物是近年来对光敏核不育水稻研究的热点之一。光敏核不育现象是外界环境因子中光周期、温度、光周期与温度互作等多因子参与调控的综合结果。目前通常以花粉败育度及自交结实率来判定败育程度,但这两者仅为植株整体水平的和生理过程最终的表现型。所以,利用发育生物学的研究方法,探知特定时空点光敏不育基因的分子水平表型,即特异相关蛋白产物,才能较准确地判断在其表达的生理进程中     

黏类小麦育性相关基因SSH文库的构建

为了深入研究黏类小麦雄性不育的分子遗传机制, 利用抑制差减杂交技术构建了黏类小麦育性相关基因的cDNA文库。文库质量检测表明, 差减杂交效率较高, 质量较好。在不育和可育cDNA文库中随机挑选120个阳性克隆进行测序, 获得100余条高质量的表达序列标签(EST)。对序列进行BLAST比对及功能注释, 比较了不育和可育cDNA文库的基因表达谱, 发现在可育cDNA文库中参与能量代谢的基因出现频率较高, 在不育cDNA文库中检测到了与花发育调控相关的MADS-box转录因子、细胞凋亡相关的泛素结合酶及阻遏淀粉合成的腺苷二磷酸葡萄糖磷酸化酶等相关基因。这些基因很可能与育性相关。     

抑制消减杂交法研究复等位基因遗传的

AB01是本课题组培育的复等位基因遗传的核雄性不育大白菜甲型“两用系”,目前已建立了一套该材料的应用技术体系,但其不育分子机制尚不明确。本研究以AB01的不育株和可育株为材料,利用抑制差减杂交技术构建了正反抑制差减cDNA文库,并通过测序及生物信息学手段寻找育性相关基因,以此来推断该材料的不育分子机制。研究中共找到27个差异表达基因,其中25个基因在NCBI数据库中均有同源序列,这些基因中7个与花发育相关,5个与脂类代谢相关,3个与活性氧及能量代谢相关,3个与光合作用及叶绿体合成相关,其余7个为功能未知基因。由此推测复等位基因遗传的核雄性不育大白菜不育的发生与脂类、能量代谢及光合作用有关。     

大白菜育性相关基因BRLSP-55的获得与验证

雄性不育的利用是大白菜制种的重要手段,获得大量育性相关基因可为了解大白菜雄性不育分子机制提供线索。采用cDNA-AFLP技术寻找差异条带,利用RT-PCR经序列比对并推测其功能。利用cDNA-AFLP方法从大白菜雄性不育两用系“AB01”的不育和可育花蕾中找到一个仅在可育花蕾中表达,而在不育花蕾中不表达的差异片段;经测序分析表明所得序列大小为351 bp,将其命名为BRLSP-55;并通过RT-PCR方法得到了验证;经序列比对初步判定该基因与拟南芥硫堇蛋白(Thionin Protein)的亲缘关系较近,所获得育性相关基因BRLSP-55可能为一种硫堇蛋白,在大白菜雄性不育机制中可能起重要作用。     

黏类小麦细胞质雄性不育相关基因cMDH的克隆与表达分析

为深入研究黏类小麦雄性不育的分子遗传机制,利用抑制差减杂交技术构建了黏类小麦育性相关基因的二核期SSH文库.经文库筛选后,得到一个在可育文库中表达的与胞质苹果酸脱氢酶基因同源的EST序列.以该EST序列为信息探针,经电子克隆、RT-PCR、PCR克隆与序列分析,获得了小麦胞质苹果酸脱氢酶(cytosolic malate dehydrogenases,cMDH)基因的cDNA与DNA序列,利用荧光定量PCR技术对该基因在不育株和可育株花药中的表达进行了分析,并比较了MDH在小麦不育株和可育株中的活性变化.结果表明,该基因的cDNA序列长1213 bp,编码333个氨基酸;DNA序列长2 908 bp,含有7个外显子和6个内含子;该基因在不育株和可育株花药发育3个时期(单核、二核和三核)的表达均表现为先升后降的模式,而且该基因在不育株花药发育的二核期和三核期的表达相对于可育株被明显抑制;MDH在小麦不育株和可育株中的活性变化趋势与定量结果一致.推测该基因在花粉发育早期表达,它的下调表达可能影响了小麦雄蕊发育过程中的能量供应而导致雄性不育.     

小麦K-型细胞质雄性不育系COI1基因的克隆与表达分析

COI1(coronatine-insensitive 1)基因是茉莉素信号传导中起关键作用的基因,与植物的抗病性、花粉育性密切相关。为探讨COI1与小麦K型细胞质雄性不育性之间的关系,本研究从小麦K型细胞质雄性不育系豫麦3号中同源克隆得到COI1基因的三个拷贝。该基因大小为2.8 kb,开放阅读框为1 761 bp,编码586个氨基酸残基的蛋白,含有COI1蛋白典型的F-box和LRR保守结构域。进化分析结果表明COI1基因的三个拷贝分别与来自小麦祖先种乌拉尔图小麦、拟斯卑尔脱山羊草和粗山羊草、大麦以及短柄草的COI1亲缘关系较近,而与拟南芥、大豆、黄瓜等的COI1亲缘关系较远。利用中国春缺体四体系统进行染色体定位分析,发现它们分别定位于小麦4A、4B、4D染色体上。对COI1基因在小麦品种中国春的根、茎、叶和幼穗中的表达模式分析发现三个拷贝呈组成型表达,但幼穗中Ta COI1A的表达量明显高于Ta COI1B和Ta COI1D。在不育系、保持系和F1代不同发育时期的花药中,COI1基因的三个拷贝在不育系单核期花药的表达量明显高于保持系,在二核期至三核期(不育系花粉败育的关键时期),Ta COI1B和Ta COI1D在不育系和保持系中的表达趋势一致,而Ta COI1A在不育系中的表达呈上调趋势,在保持系和F1代中的表达呈下调趋势,说明Ta COI1A基因在不育系和可育系(保持系和F1代)花药中的表达有明显差异,可能跟不育系的花粉败育有关。     

青花菜脂质转移蛋白基因的克隆与表达特征分析

脂质转移蛋白是植物生命活动中重要的活性蛋白质,在花粉发育中起着重要作用。本研究以青花菜保持系‘WN12-95B’为试验材料,采用RT-PCR技术获得脂质转移蛋白(LTP)基因c DNA序列。通过生物信息学分析,结果表明:该基因含有一个360 bp的开放阅读框,推导编码119个氨基酸,预测蛋白分子量12.47 k D,p I值7.48,属疏水性蛋白。青花菜LTP蛋白氨基酸序列含有24个氨基酸长度的信号肽,α-螺旋和不规则卷曲是其二级结构的主要成分,三级结构则具有典型的LTP蛋白结构特征。分子进化分析表明该基因与油菜亲缘关系最近,相似性最高,其次为芥菜和芜菁。时空表达特性分析显示,青花菜LTP基因特异表达于花蕾中,且表达丰度较高。保持系和Ogu不育系不同发育阶段花蕾LTP基因的表达丰度差异明显,表达量随花蕾发育呈下降趋势。本研究可为深入研究LTP基因在青花菜绒毡层和小孢子发育过程中的作用提供一定的理论基础。     

甘蓝型隐性核不育杂交油菜制种中父本和可育株花粉授精竞争力的研究

用花时指示性状作父本，隐性核不育系1601A（圆叶）作母本，父母本行比为1：10，在花期不拔除可育株让其父本和母本中可有株花粉对其不育株自由授粉，其父本花蕾总数占该群体可育株花蕾总数的17.3%的情况下，父本花粉授精竞争能力较强，不育株所结种子花叶株率达34.94%，父本花粉授精竞争力为1.02。其中，靠近父本的不育株所结种子花叶株率达80%，竞争力达3.63。母本可育花蕾虽占总花蕾的82.7%，但不育株所结种子中圆叶株率略只占65%，其母本中的可育株花粉授精竞争力为-0.27,而且即使母本中的可育株所结的种子，在靠迫父本的数行中，其父本花粉的竞争力仍为正值，强子可育株本身花粉的竞争力。