鸭、鹅Gal-6的克隆与序列分析

根据GenBank公布的鸡β-防御素Gal-6基因序列设计2对引物，应用反转录-聚合酶链式反应技术，从鸭、鹅不同组织中扩增了β-防御素基因片段，大小为250bp。选取鸭16个组织和鹅的肝脏检测其表达情况，结果表明，除在肾、皮肤、法氏囊外，其他组织均检测为阳性。经筛选获得重组质粒并测序，从重组质粒中扩增出成熟肽，大小约150bp。克隆的多肽由67个氨基酸组成，分别是20个氨基酸残基的信号肽、5个氨基酸的原片段、42个氨基酸的成熟肽。BLAST分析表明，鸭基因序列与基因库中已公布的序列相差1个碱基，鹅基因序列则完全相同。     

鸡β-防御素Gal-1 cDNA的克隆及序列分析

利用细胞总RNA提取试剂盒,从1月龄SPF鸡白细胞中分离提取总RNA,经过反转录PCR(RT-PCR)扩增出鸡β-防御素(Gal-1)cDNA片段。PCR产物经凝胶回收纯化后与pMD18-T载体连接,转化感受态JM109细胞,在含X-gal、IPTG的LB平板上筛选阳性克隆,经菌落PCR与质粒限制性酶切鉴定后,对目的片段进行测序。结果表明RT-PCR扩增出的cDNA片段ORF大小为198bp,用Blast程序进行检索比较表明该序列与Genbank中发表的鸡Gal-1 cDNA编码区序列同源性高达99.5%。该cDNA序列编码65个氨基酸,包括信号肽、前片段和成熟肽,成熟肽由40个氨基酸残基组成。     

鸡β-防御素CDNA的克隆与序列分析

使用总RNA提取试剂盒,从1月龄粤黄鸡骨髓细胞中分离提取总RNA,经过反转录PCR(RT-PCR)扩增出鸡β-防御素(Gal-2)cDNA片段.PCR产物经凝胶回收纯化,加A尾后与载体pGEM-T Easy相连,然后转化感受态细胞DH-5α在含X-gal、IPTG的LA平板上筛选阳性克隆,经菌落PCR与提取质粒作限制性酶切鉴定后,对目的片段进行测序.结果表明RT-PCR扩增出的cDNA片段碱基数为195bp,用Blast程序进行检索比较表明此扩增序列与Genbank中发表的鸡Gal-2 cDNA编码区序列100%相同.该cDNA编码64个氨基酸,包括信号肽、前片段和成熟肽,成熟肽由36个氨基酸残基组成.     

鸡β-防御素Gallinacin-8基因片段的克隆与序列分析

本试验从鸡的肝脏中提取总RNA,根据GenBank公布的鸡β-防御素Gallinacin-8(简称gal-8)基因序列设计2对引物,运用RT-PCR技术扩增出大小为20lbp的鸡β-防御素gal-8的基因片段.通过序列分析得知其由66个氨基酸组成,包括20个氨基酸残基的信号肽、5个氨基酸的原片肽及41个氨基酸的成熟肽.BLAST分析表明与GenBank中已公布的序列相比较缺失2个碱基,其同源性达到98%.将该基因克隆进pGEM-T Easy载体中,并转化大肠杆茵感受态DH5α,经筛选和测序鉴定获得了阳性重组质粒.从重组质粒中扩增出的成熟肽,大小约123 bp.试验为进一步构建重组核蛋白及表达具有广谱抗微生物活性的防御素提供了实验基础.     

粤北三黄鸡β-防御素基因的表达及其生物活性研究

采用RT-PCR 方法从三黄鸡肝脏中扩增β-防御素 Gal-6基因的 cDNA 片段,构建重组表达质粒pGEX-6p-1-GAL-6,将重组质粒转化至大肠杆菌BL21进行原核表达。结果表明,成功获得201 bp的鸡β-防御素基因,SDS-PAGE 电泳分析表明,原核表达的重组鸡融合蛋白分子质量约为32 kD。此外,表达的该重组蛋白对金黄色葡萄球菌有较高抗菌活性。     

山地乌骨鸡β防御素Gal-2基因的克隆及酵母表达载体的构建

为了构建山地乌骨鸡β防御素Gal-2基因酵母表达载体,试验根据GenBank中鸡β防御素Gal-2基因序列设计引物,采用RT-PCR技术从山地乌骨鸡骨髓细胞中扩增出Gal-2基因,经PCR和酶切鉴定后测序,并采用DNAStar软件进行生物信息学分析;再根据毕赤酵母偏爱密码子和山地乌骨鸡β-防御素Gal-2成熟肽编码基因序列设计并合成1对引物,采用PCR技术从重组质粒pMD18-T-Gal-2扩增出其成熟肽编码基因,并将其插入载体pPICZaA,构建重组质粒pPICZaA-Gal-2,将pPICZaA-Gal-2线性化,通过电击转入毕赤酵母菌株GS115,用1%甲醇诱导表达120 h,表达产物纯化后进行Tricine-SDS-PAGE电泳鉴定。结果表明:山地乌骨鸡β防御素Gal-2基因克隆成功;山地乌骨鸡β-防御素Gal-2成熟肽编码基因重组真核表达载体构建成功;山地乌骨鸡Gal-2基因在酵母中得到表达。     

鸡β-防御素-1cDNA的克隆及在毕赤酵母中的表达

从鸡骨髓细胞中分离提取总RNA，经过反转录PCR（RT-PCR）扩增出鸡β-防御素-1（Gallinacin-1，Gal-1）cDNA，将扩增产物与pGEM—T Easy载体相连，经克隆测序表明扩增出的cDNA碱基数为198bp，与报道的Gal—1cDNA编码区碱基序列完全相同。分析核苷酸序列表明Gal-1与火鸡异嗜性白细胞肽-1（Turkey heterophil peptides，THP-1）具有85．4％同源性。氨基酸序列方面Gal-1与THP-1同源性最高，为72．7％。将Gal-1基因成熟肽片段插入到酵母表达载体pPIZα-C，构建重组表达载体pPICZα-C-gal-1，电转入表达宿主菌X-33，Zeocin抗性筛选重组菌株。挑取阳性菌株经甲醇诱导表达，Tricine-SDS-PAGE电泳发现在约4．5ku位置出现预期条带。对其抗菌活性检测发现具有抗大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等细菌的活性。反相高效液相色谱表明阳性菌株表达产物与标准品在层析柱中保留时间一致。     

福建黄兔卵泡抑制素βA亚基cDNA的克隆与序列分析

从性成熟的福建黄兔母兔脑垂体中提取总RNA,经RT-PCR扩增目的片段,获得长为1 275 bp的黄兔卵泡抑制素βA亚基cDNA片段.将扩增的片段与pMD18-T载体连接,转化至DH5α感受态细胞中.随机挑选阳性重组子进行鉴定、测序,将测序结果与包括人、大猩猩、奶牛、绵羊、小鼠在内的多种哺乳动物基因序列进行同源性比对分析,相似度在85％以上,同时遗传进化分析结果表明兔形目的INHBA基因与灵长目动物的亲缘性相近.黄兔INHBA基因cDNA序列编码424个氨基酸,整个蛋白包括1段20个氨基酸的信号肽和404个氨基酸的成熟肽,该蛋白还同时存在2个结构域,分别为TGFβ和TGFβ前体肽结构域.     

丝羽乌骨鸡β-防御素基因的克隆和序列分析

用设计的特异性引物,采用RT-PCR技术特异性地扩增到丝羽乌骨鸡β-防御素基因Gal-1(Gallinacin-1),Gal-1(a)(Gallinacin-1(a)),Gal-2(Gallinacin-2),Gal-4(Gallinacin-4)～Gal-13(Gallinacin-13)基因共13个基因编码区全长片段。通过克隆、测序获得13个基因的cDNA核苷酸序列,并提交到GenBank,丝羽乌骨鸡β-防御素Gal-1,Gal-1(a),Gal-2,Gal-4～Gal-13基因的登录号为:DQ677632￣DQ677644。将丝羽乌骨鸡13种β-防御素Gal-1～Gal-13基因分别与GenBank中收录的防御素基因比对分析,其氨基酸序列的相似性均在95.5%～100%之间。利用DNAStar软件对所获得的13种丝羽乌骨鸡β-防御素基因进行系统发育树分析,结果Gal-1、5、12在同一分支上,Gal-1(a)、4、8在同一分支上,Gal-1、2、9在同一分支,Gal-6、7在同一分支,Gal-13独在一分支上。     

骆驼β-防御素caBD-1全长cDNA的扩增

获得全长cDNA 序列是研究基因结构、基因表达和基因功能的前提.我们根据已获得的骆驼β-防御素caBD-1 cDNA的已知序列设计一条上游引物,反转录引物中的部分序列即3′末端序列.另外,采用反向嵌套PCR RACE法,根据caBD-1 cDNA的已知序列,设计一条5′末端磷酸化的特异性反转录引物和两对特异性反向嵌套PCR引物,首先进行反转录(RT),然后将mRNA反转录成的cDNA 进行环化,最后进行反向嵌套巢式PCR,成功的克隆了骆驼β-防御素caBD-1 cDNA的5′末端序列.本研究扩增出的caBD-1 cDNA序列全322 bp,其中包含一个由192 bp组成的开放读码框(ORF),该ORF编码64个氨基酸残基的前原caBD-1肽.     

和田羊Myostatin蛋白成熟肽的基因克隆及原核表达

为了克隆和田羊肌肉生长抑制素（Myostatin）蛋白成熟肽编码基因片段,并对其进行原核表达,试验根据绵羊Myostatin蛋白成熟肽基因序列从GenBank（登录号为NM₀01009428）中设计并合成1对引物。以塔里木大学动物基因工程实验室构建的和田羊Myostatin基因全序列的克隆载体为模板,采用PCR方法特异性扩增和田羊Myostatin蛋白成熟肽基因片段;将其克隆到pMD18-T载体中,构建克隆质粒pMD18-T-Ms;经PCR和双酶切分析鉴定,将阳性克隆送上海生工生物工程技术服务有限公司测序验证;测序验证后双酶切pMD18-T-Ms克隆质粒和pET-28a（+）表达质粒,进一步构建pET-28a（+）-Ms重组表达质粒。将重组表达质粒转化至大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中,经异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）诱导后表达Myostatin蛋白成熟肽,通过SDS-PAGE电泳分析鉴定表达的重组蛋白。结果表明:PCR特异性扩增出1条长度约为330 bp的条带;序列测定分析显示和田羊Myostatin蛋白成熟肽基因片段长327 bp,与GenBank上绵羊Myostatin蛋白成熟肽编码基因从799～1 125 bp片段的核苷酸同源性为100%,所表达的Myostatin蛋白成熟肽分子质量约为14.7 ku。试验成功克隆和田羊Myostatin蛋白成熟肽编码基因片段,构建了其克隆质粒pMD18-T-Ms和重组表达质粒pET-28a（+）-Ms,并在大肠杆菌中获得有效表达。     

重叠延伸PCR法体外重建鸡主要组织相容性复合体Ⅰ

本研究旨在体外重建鸡主要组织相容性复合体Ⅰ类分子（MHCⅠ）重链（α链）胞外区与轻链（β2m）成熟肽的重组嵌合分子。采用RT—PCR法分别扩增鸡MHCⅠ的重链胞外区和轻链的成熟肽序列；采用重叠延伸PCR（Splicing overlap extension PCR method，SOE-PCR）把通过45个碱基的链连接的鸡MHCⅠ重链胞外区基因和轻链成熟肽基因重组到可溶性表达质粒pMAL-p2X进行可溶性表达。经琼脂糖凝胶电泳证明RT—PCR可分别扩增出鸡MHCⅠα链胞外区基因和β2m成熟肽基因，大小符合预期。采用MHCⅠα链胞外区序列的反义引物与β2m成熟肽基因正义引物有15个碱基重叠的两对引物，以MHCⅠα链胞外区序列与β2m成熟肽序列PCR产物的混合物作为模板，进行重叠延伸获得了预期大小的连接片段；测序显示重组质粒上MHCⅠα链胞外区序列与轻链β2m成熟肽基因的靶序列由一柔性的linker相连，阅读框正确且无移码。本研究表明SOE-PCR是体外重构鸡MHCⅠ的一种简捷可行方法。     

广西10个地方优质品种鸡γ-干扰素基因的克隆与序列分析

根据基因库中鸡γ-干扰素的基因序列设计了1对特异性引物，应用反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）技术，从ConA诱导培养的广西10个地方优质品种鸡外周血淋巴细胞RNA中扩增了γ-干扰素基因，结果，均得到了大小为520 bp的特异性片段。将扩增产物纯化并克隆到pMD18-T载体上，获得重组质粒，经PCR和EcoRⅠ＋SalⅠ双酶切鉴定后测序。序列分析结果表明，广西10个地方优质品种鸡γ-干扰席基因均编码145个氨基酸的成熟蛋白，分子质量约为16．8ku，与哺乳动物和其他品种鸡的核苷酸序列同源性分别为38．8％～39．0％和99．2％～100％，氨基酸序列同源性分别为23．69／6～24．8％和97．6％～99．4％。     

重组鸡β-防御素6基因的表达和生物学特性的研究

从鸡骨髓细胞中分离提取总RNA,经过RT-PCR扩增出鸡β-防御素-6(AvBD6)基因.经克隆测序表明扩增出的cDNA碱基数为204 bp,编码68个氨基酸残基.根据已发现的禽β-防御素和鼠β-防御素-6的氨基酸序列构建系统进化树.发现鸡AvBD6氨基酸序列与鸡AvBD7氨基酸序列同源性最高,为62.7%.将该基因克隆到大肠杆菌原核表达载体pGEX-6p-1上,进行原核表达.SDS-PAGE电泳表明,表达的重组鸡AvBD6融合蛋白分子量约为32 ku.对该重组蛋白进行纯化与体外抗菌活性的测定.结果表明,重组鸡AvBD6融合蛋白对多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽胞杆菌有较高抗菌活性,对大肠杆菌的抗菌活性较弱,对猪霍乱沙门氏菌无抗菌活性.重组鸡AvBD6蛋白对上述细菌的最小抑菌浓度范围为31.25μg/mL～250 μg/mL.此外,重组鸡AvBD6蛋白对温度和酸碱度有较高的稳定性.     

佳米驴β防御素aBD-1基因克隆及序列分析

为获得佳米驴β防御素-1(aBD-1)的全长cDNA序列,为开发其药用功能积累资料。从佳米驴舌黏膜上皮组织中提取总RNA,采用RT-PCR技术扩增出aBD-1(ass-βdefensin-1)cDNA的中间片段后,再采用RACE法,扩增佳米驴β防御素aBD-1的cDNA全序列。aBD-1 cDNA全序列长为360 bp,其中包含192 bp的开放阅读框,37 bp的5′非翻译区(5′UTR),102 bp的3′非翻译区(3′UTR)以及poly(A)26。在GenBank上注册号为EU265778,测序结果和序列生物信息学分析结果表明,其与马β防御素eBD-1、牛的β防御素TAP、绵羊的β防御素sBD-1、猪的β防御素pBD-1和人的β防御素hBD-2的同源性分别为92%、68%、75%、75%和68%。aBD-1全长cDNA是β防御素家族中的一个新基因。     

荷斯坦牛中性粒细胞β-防御素基因克隆及其原核表达质粒的构建

根据已发表的牛β-防御素基因序列设计引物,从具有临床乳腺炎症状的荷斯坦奶牛血液中性粒细胞中提取RNA,克隆牛β-防御素基因并插入到原核表达载体pQE-30中,构建了原核表达质粒pQE-30/β-defesion。测序结果表明,克隆的目的基因长189bp,编码1个氨基酸,与已报道的牛β-防御素氨基酸序列同源性达95.6%。本研究为牛乳腺防御素的表达及功能、活性的研究奠定了一定的基础。     

蒙古绵羊β-防御素-1cDNA的扩增及其序列分析

为了获得蒙古绵羊β-防御素-1（sBD-1）的cDNA序列,从蒙古绵羊瘤胃的上皮组织中提取总RNA,采用RT-PCR技术扩增出sBD-1的cDNA。结果 sBD-1的cDNA长为300bp,该cDNA包含由192bp组成的开放读码框（ORF）,ORF编码64个氨基酸的前原防御素。经过DNA序列分析。证实所扩增的cDNA为sBD-1。     

奶牛乳房炎抗性基因TAP cDNA克隆及序列分析

采用RT-PCR方法从奶牛乳腺组织中扩增气管抗菌肽(TAP)基因,重组到pMD19-T Simple载体中,并进行序列分析。序列分析结果显示,克隆的TAP基因包含完整的开放阅读框(ORF)195 bp,与牛TAP基因同源性达93.8%;该ORF编码的64个氨基酸,含有β-防御素特征性结构即6个在特定位置上的保守半胱氨酸残基。TAP基因cDNA完整开放阅读框的克隆,为进一步开发应用重组牛β-防御素奠定了基础。     

奶牛乳房炎抗性基因TAP cDNA克隆及序列分析

采用RT-PCR方法从奶牛乳腺组织中扩增气管抗菌肽(TAP)基因,重组到pMD19-T Simple载体中,并进行序列分析。序列分析结果显示,克隆的TAP基因包含完整的开放阅读框(ORF) 195 bp,与牛TAP基因同源性达93.8%;该ORF编码的64个氨基酸,含有β-防御素特征性结构即6个在特定位置上的保守半胱氨酸残基。TAP基因cDNA完整开放阅读框的克隆,为进一步开发应用重组牛β-防御素奠定了基础。     

Gal-13成熟肽基因在毕赤酵母中的表达与抑菌活性分析

扩增鸡β-防御素-13(Gal-13)成熟肽基因序列,构建酵母重组表达载体pPICZαA-Gal-13,通过SacⅠ限制性内切酶线性化处理后,电击转化毕赤酵母X-33,并对利用甲醇诱导后的重组菌株表达产物进行表达规律分析和抑菌活性研究。结果表明,扩增到的Gal-13成熟肽基因序列为108bp,共编码36个氨基酸;筛选到的重组菌株均为Mut+表型,其诱导表达上清经Tricine-SDS-PAGE凝胶电泳后,发现其在约5 900的位置出现目的条带,抑菌试验发现其对沙门菌(CVCC534)和金黄色葡萄球菌(ATCC25923)具有抑菌活性。