驯鹿β-防御素-1(reBD-1)基因的原核表达及蛋白活性的鉴定

旨在构建驯鹿β防御素-1(Reindeerβ-defensin-1,reBD-1)基因的原核表达载体pET-32a(+ )/reBD-1,诱导reBD-1融合蛋白在大肠杆菌中表达,并对其表达产物的生物学活性进行评价.利用RT-PCR技术扩增reBD-1前原肽.从重组克隆载体PMD19T/reBD-1中扩增reBD-1成熟肽编码基因,并克隆入pET-32a(+)中,在大肠杆菌BL21 (DE3)中用IPTG诱导表达reBD-1融合蛋白.表达的融合蛋白扩大培养,进一步纯化后进行体外抑菌试验.结果表明,reBD-1前原肽和成熟肽扩增产物大小分别为215和138 bp,目的基因的序列与驯鹿防御素-1 mRNA序列同源性为100％.前原肽和成熟肽融合蛋白分子量分别为28和24 ku.利用琼脂糖扩散法表明,0.08 mg·mL-1的纯化成熟肽蛋白对金黄色葡萄球菌及大肠杆菌的活性有明显抵抗作用.结果显示,reBD-1前原肽及成熟肽在大肠杆菌中得到了高效表达,其成熟肽对革兰氏阳性菌和阴性菌的活性有抗性.     

猪肌肉生长抑制素基因的克隆及原核表达

本试验旨在通过基因工程方法获得重组肌肉生长抑制素蛋白。根据基因库肌肉生长抑制素基因序列设计合成特异性引物,引物两端分别加上EcoRⅠ和SalⅠ酶切位点及保护碱基,提取汉普夏猪的骨骼肌总RNA,用RT-PCR方法扩增肌肉生长抑制素全长基因,并将其克隆到pMD18-T载体上,测序后EcoRⅠ和SalⅠ双酶切,克隆到pET-30a( )中,构建原核表达载体pET-30a-M,将重组表达质粒转化至E.coliBL21(DE3)中,诱导表达。结果表明,成功扩增出肌肉生长抑制素全长基因;克隆载体经过DNA序列测定,所得基因与国外报道的完全一致;成功构建原核表达载体pET-30a-M;经IPTG诱导,表达出了6×His-M融合蛋白,用组氨酸标签抗体做Western印记证明产物大约48 ku,与预期大小相符,肌肉生长抑制素蛋白在大肠杆菌中成功的进行了表达。     

福氏志贺菌外输调节蛋白基因marA的原核表达载体构建及其鉴定

目的构建志贺菌外输调节蛋白基因marA的原核表达载体并对其表达的蛋白进行鉴定。方法采用PCR从志贺菌基因组DNA中扩增得到志贺菌外输调节蛋白基因marA,并将其定向克隆到原核表达载体pET-30a,构建原核表达重组质粒pET-30a-marA,重组子经限制性内切酶分析、PCR及测序鉴定后,转化宿主菌BL21,IPTG诱导表达,产物进行SDS-PAGE电泳、免疫印迹分析鉴定。结果经鉴定证实原核表达载体pET-30a-marA构建成功,且在大肠杆菌BL21中获得了MarA与His的融合表达,且表达蛋白产物的分子质量大小与预期值一致,并可被特异性抗体所识别。结论MarA在大肠杆菌中获得了高效的表达,为进一步研究其免疫学特性和功能奠定了基础。     

重组鲢鱼抗菌肽parasinⅠ原核表达、纯化与抗菌活性

本文旨在构建抗菌肽parasinⅠ大肠杆菌重组表达载体,表达人工重组parasinⅠ,并检测其抑菌活性。根据parasinⅠ的成熟肽序列和大肠杆菌密码子偏好性,人工合成1段57 bp的基因编码cDNA,通过PCR技术构建大肠杆菌重组表达质粒pET32-ParaⅠ,并在parasinⅠ基因5’-端引入Xa因子酶切位点。重组载体转化大肠杆菌Rosetta(DE3)菌株后,在不同温度(37和20℃)条件下对阳性转化子进行异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。结果表明:IPTG成功诱导了1个21 ku的融合蛋白表达,重组蛋白占菌体总蛋白质的45%～50%。在低温条件下产生的融合蛋白主要以可溶性形式存在。可溶性重组蛋白经亲和层析纯化后,用Χa因子进行酶切,酶切产物经琼脂孔扩散法抑菌活性检测,结果显示其对金黄色葡萄球菌有一定抑制作用。本试验实现了parasinⅠ的重组表达,表达产物经Χa因子酶切后具抑菌活性。     

兔防御素基因NP-1的克隆及其在大肠杆菌中的表达

选用大肠杆菌偏嗜性的密码子对兔防御素基因NP-1进行改造,人工合成编码NP-1成熟肽的基因片段,并将其克隆到T-easy载体上,再经双酶切后重组于原核表达载体pMAL-p2X。经IPTG诱导后,在大肠杆菌TB1中融合表达出兔防御素NP-1成熟肽。     

牛抗精子抗体11E基因的原核表达及其活性研究

抗精子抗体11被认为在雄性生殖道的先天免疫及生殖方面起着重要的作用,牛抗精子抗体11E(SPAG11E)主要存在睾丸、附睾等生殖道中。本实验根据GenBank中牛SPAG11E基因序列(登录号:DQ838983.1)设计特异性引物,提取牛睾丸组织总RNA,经RT-PCR获得SPAG11E基因序列,构建原核表达载体,并转入BL21(DE3),利用IPTG诱导表达,同时检测了重组蛋白体外抑菌活性。结果显示,成功扩增了牛SPAG11E基因的CDS序列,其与GenBank公布序列相一致;正确构建了原核表达载体pET-32a(+)-SPAG11E,最佳表达条件为IPTG终浓度1.0mmol/L、诱导时间4h;重组蛋白对检测的6种菌没有明显的抑菌作用。     

金黄色葡萄球菌噬菌体裂解酶LysK的表达及其多克隆抗体的制备

将噬菌体与细菌孵育25min提取噬菌体感染细菌的总RNA,通过逆转录的方法获得cDNA,以此为模板进行PCR扩增得到目的片段,以pET-15b为载体构建重组质粒pET-15b-lysK并转入大肠杆菌BL21中,IPTG诱导表达金黄色葡萄球菌噬菌体K裂解酶基因lysK,表达产物蛋白经镍柱纯化后,测定LysK的裂解活性、裂解谱,并免疫家兔制备多克隆抗体。结果表明,成功诱导表达可溶性LysK并获得重组蛋白,酶谱试验证明LysK对金黄色葡萄球菌具有裂解活性,LysK比噬菌体K裂解谱广。制备的兔多克隆抗体能够与LysK发生特异性反应且具有较高效价,为后续进行LysK体内治疗研究打下了基础。     

金黄色葡萄球菌噬菌体裂解酶LysK的表达及其多克隆抗体的制备

将噬菌体与细菌孵育25min提取噬菌体感染细菌的总RNA,通过逆转录的方法获得cDNA,以此为模板进行PCR扩增得到目的片段,以pET-15b为载体构建重组质粒pET-15b—lysK并转入大肠杆菌BL21中,IPTG诱导表达金黄色葡萄球菌噬菌体K裂解酶基因lysK,表达产物蛋白经镍柱纯化后,测定LysK的裂解活性、裂解谱,并免疫家兔制备多克隆抗体。结果表明,成功诱导表达可溶性LysK并获得重组蛋白,酶谱试验证明LysK对金黄色葡萄球菌具有裂解活性,LysK比噬菌体K裂解谱广。制备的兔多克隆抗体能够与LysK发生特异性反应且具有较高效价,为后续进行LysK体内治疗研究打下了基础。     

牛碱性成纤维细胞生长因子基因在大肠杆菌中的表达及其表达产物的生物学活性

采用巢式PCR方法克隆了牛18ku-bFGF基因完整的编码序列,并构建了原核表达载体pET-28a-bFGF,将其转化大肠杆菌BL21,在25℃低温条件下,用0.5 mmol/L IPTG诱导表达5 h,用Ni-NTA亲和纯化细胞裂解上清液,经Western-blotting检测,结果显示,在特定的诱导条件下,重组牛bFGF基因在大肠杆菌中获得了表达,并且主要以可溶性状态存在于细胞中。经检测,纯化后的重组蛋白能显著促进成纤维细胞的增殖（P〈0.05）,其活性与商品用重组人18ku-bFGF没有差异（P〉0.05）。表明,所获得的可溶性重组牛18ku-bFGF蛋白具有较高的生物学活性,可用于后续研究工作。     

粤北三黄鸡β-防御素基因的表达及其生物活性研究

采用RT-PCR 方法从三黄鸡肝脏中扩增β-防御素 Gal-6基因的 cDNA 片段,构建重组表达质粒pGEX-6p-1-GAL-6,将重组质粒转化至大肠杆菌BL21进行原核表达。结果表明,成功获得201 bp的鸡β-防御素基因,SDS-PAGE 电泳分析表明,原核表达的重组鸡融合蛋白分子质量约为32 kD。此外,表达的该重组蛋白对金黄色葡萄球菌有较高抗菌活性。     

边缘无浆体膜表面蛋白1a(MSP1a)的克隆与原核表达

为了给牛边缘无浆体的诊断和基因工程疫苗的研制提供理论依据,试验以牛边缘无浆体基因组DNA为模板,采用PCR技术对其膜表面蛋白1a(MSP1a)基因进行扩增,将扩增产物转入克隆载体和表达载体中进行克隆和表达,用重组表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),利用免疫印迹分析鉴定MSP1a基因表达产物的免疫活性。结果表明:MSP1a基因PCR扩增产物与GenBank上的PR1株MSP1a基因的序列同源性达98.3%,编码氨基酸的同源性为98.7%;将该基因亚克隆入原核表达载体pET-28a中,构建了重组原核表达载体;将其转化到DH5α大肠杆菌中,用IPTG进行诱导表达,实现了融合表达,表达产物的分子质量为49 ku;经SDS-PAGE电泳和免疫印迹检测,MSP1a基因在表达载体中得到高效表达,且表达产物具有免疫活性。     

猪日本脑炎病毒NS3蛋白的基因克隆、原核表达及纯化

提取猪日本脑炎病毒(JEV)上海分离株的基因组RNA,反转录合成cDNA,RT-PCR扩增JEV的NS3基因片段,亚克隆到原核表达载体pET-28(a)上,酶切鉴定和PCR鉴定重组原核表达质粒pET-28(a)-JEV-NS3,转化大肠埃希菌BL21(DE3)菌株,IPTG诱导表达重组His-JEV-NS3蛋白,SDS-PAGE分析重组蛋白的表达,his-band试剂盒纯化重组蛋白。获得了1.8kb NS3基因片段,成功构建重组原核表达质粒pET-28(a)-JEV-NS3。IPTG诱导获得分子质量为64ku的His-JEV-NS3蛋白,该蛋白主要以包涵体形式表达,表达量占总菌体蛋白的30%以上,纯化后获得高纯度重组蛋白,其占总蛋白比例达70%以上。     

鸡膜联蛋白A2的原核表达与纯化

试验旨在对鸡膜联蛋白A2(ANXA2)基因进行原核表达与纯化。利用鸡ANXA2基因特异性引物从鸡卵泡细胞cDNA中扩增ANXA2基因,亚克隆至原核表达载体p ET-32a(+)构建重组原核表达载体pET-32a-chANXA2。将其转化到大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导表达,并分析重组蛋白的表达形式;利用含Ni2+琼脂球对重组蛋白进行纯化,并利用Western blot进行鉴定。结果显示:成功构建重组原核表达载体pET-32a-chANXA2,重组蛋白His-chANXA2在0.1 mmol/L IPTG、诱导表达5 h和30℃诱导温度条件下表达量高,其在上清和包涵体中均有表达,但主要以包涵体形式存在。利用含Ni2+琼脂球从诱导菌裂解物上清中得到了纯度较高的重组蛋白,Western blot检测到与预期大小相符的重组蛋白条带。研究结果为后续开展ANXA2调控鸡卵泡发育的分子机制研究奠定基础。     

乙型脑炎病毒SXBJ07株E基因的克隆及原核表达

为构建乙型脑炎病毒(JEV)SXBJ07株E基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中进行高效表达;根据JEV SXBJ07株基因组全序列设计1对特异性引物,RT-PCR扩增E基因全长;将目的基因插入pGEM-T连接载体,筛选出阳性重组质粒;将该质粒克隆至原核表达载体pET32α中,再转化入大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达后对其产物进行SDS-PAGE电泳分析和Western-blot检测。结果表明:扩增到了全长为1 500 bp的JEV SXBJ株E蛋白基因;重组质粒pET-32α-E构建成功;融合蛋白可以与乙脑阳性血清抗体特异性结合。说明在大肠杆菌中成功表达了JEV E蛋白。     

鲤春病毒(SVCV)糖蛋白基因的原核表达

通过将鲤春病毒血症病毒(Spring Viremia of Carp Virus,SVCV)糖蛋白(Glycoprotein,G)基因截短后构建重组表达载体,实现体外高效表达G蛋白,为有关原核诱导蛋白提供参考。以质粒pEGFP-G为模板设计引物,分别扩增G基因的不同片段,与密码子优化后的G基因分别插入pET-32a表达载体,构建重组表达载体pET-32a-GX和pET-32a-OG。经过鉴定后,将重组质粒分别转入大肠杆菌BL21(DE3),通过适宜条件的诱导表达,获得诱导产物并进行SDS-PAGE和Western blotting检测。构建了重组表达载体pET-32a-GX与含密码子优化后G基因的重组表达载体pET-32a-OG;经适宜条件诱导表达了G蛋白后的SDS-PAGE和Western Blotting检测,表明G蛋白成功表达,且含截短片段的重组载体pET-32a-G2的蛋白表达量最高,与原G序列有相同的免疫原性。成功构建截短后的原核表达载体pET-32aGX与密码子优化后的重组表达载体pET-32a-GX,并实现体外大量诱导SVCV的G蛋白。     

水牛抑制素α亚基基因的克隆与原核表达

采用RT-PCR方法从水牛卵巢总RNA中扩增抑制素α亚基基因,并克隆入pMD18-T载体,进行PCR、双酶切及测序鉴定.序列分析结果表明:水牛抑制素α亚基基因编码序列长为1 083 bp,编码360个氨基酸,与牛、人、猪抑制素α亚基基因CDS成熟蛋白氨基酸的同源性分别为96%、80%、87%,表明抑制素α亚基是一组在进化上高度保守的蛋白质.将水牛抑制素α亚基基因CDS克隆到pET-30a表达载体中,转化宿主菌BL21(DE3)进行原核表达.在1 mmol/L IPTG 中,37 ℃诱导表达4 h后抑制素α亚基基因重组蛋白可成功获得表达.将表达产物进行SDS-PAGE分析,结果表达产物主要以包涵体形式存在,分子质量约为40 ku.     

单增李斯特氏菌溶血素基因的克隆及原核表达

参考GenBank收录的单增李斯特菌Hly基因序列,设计1对引物,采用PCR技术扩增出单增李斯特氏菌的溶血素基因Hly(不含有信号肽部分),得到一条1590bp的条带。将其连入pMD18-T载体,经酶切、PCR鉴定和序列测定法进行鉴定。测序正确后,将该基因插入到pET-28a中构建原核表达载体pET-28a-sHly,将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,将诱导产物用SDS-PAGE和Western-blot鉴定。结果显示,Hly基因可以在大肠杆菌中获得表达,表达产物分子质量约为65kU,与预期蛋白质分子质量大小一致。经Western-blotting鉴定可知,诱导表达产物以可溶形式存在,可被兔抗LM阳性血清特异识别,具有较好的抗原活性,为进一步研制基于溶解素蛋白的诊断抗原和特异性单克隆抗体,开展LM的致病与免疫机理研究奠定基础。     

日本脑炎病毒NS1基因在大肠杆菌中的高效表达

提取日本脑炎病毒弱毒株SA14-14-2的基因组RNA,用RT-PCR扩增其NS1基因cDNA,将其克隆到原核表达载体pET-30b(+)中,转化大肠杆菌BL-21(DE3),经IPTG诱导,NS1基因获得高效表达.SDS-PAGE分析显示,表达的融合蛋白表观相对分子质量约为46 000,重组NS1蛋白占菌体总蛋白的30.8%.Western blotting分析表明,重组蛋白具有良好的免疫原性.     

牛β-防御素BNBD5基因在毕赤酵母中的表达

本研究在本实验室成功构建的奶牛乳房炎抗性相关cDNA文库的基础上,旨在通过对牛β-防御素基因的分析,进一步揭示乳房炎抗性的分子机理.以牛β-防御素BNBD5基因作为乳房炎抗性的候选基因,通过克隆该基因的编码区,成功构建了毕赤酵母表达载体pPICZαA/BNBD5,并采用毕赤酵母表达系统表达了BNBD5蛋白.该结果为今后BNBD5抗体的制备奠定了基础.     

巴马香猪氨基肽酶N截短基因的克隆与原核表达

为获得猪流行性腹泻病毒(PEDV)受体猪氨基肽酶N(pAPN)抗原,提取巴马香猪小肠绒毛上皮的总RNA,PCR扩增获得pAPN基因的主要抗原区片段,并将其克隆至原核表达载体pET-32a中,将重组质粒pET-32a-pAPN转化大肠埃希菌BL21,通过不同浓度的IPTG、不同诱导时间进行诱导表达,以确定目的蛋白表达的最佳条件。经SDS-PAGE和抗组氨酸标签的单抗进行Western blot检测重组蛋白在大肠埃希菌中的表达,结果显示,原核表达产物在诱导温度37℃、IPTG浓度为0.8mmol/L,诱导4h可获得最佳表达,产物分子质量约为45ku,获得的目的蛋白大小与预期一致。