饲用纤维素酶活力的测定方法

由于测定纤维素酶系的多种酶的酶活方法之间是相互联系的和复杂,使得确定酶活力测定的标准化方法非常困难。为给不同目的纤维素酶酶活力测定方法的选择提供借鉴,本文对测定纤维素酶酶活的一般方法,包括滤纸法、内切葡聚糖酶酶活法、纤细二糖酶酶活测定、外切葡聚糖酶酶活测定等方法进行了综述。     

底物类型及含水量对瘤胃真菌固体发酵产酶活性的影响

试验采用二因素试验设计,研究不同底物类型及含水量对瘤胃真菌固态发酵产纤维素酶活的影响。发酵底物粗料类型分别为菌糠、花生蔓和玉米秸,含水量分别为30%、40%、50%和60%。试验进行10 d,每2 d取发酵样品测试,监测其中的羧甲基纤维素酶、微晶纤维素酶、β-葡萄糖苷酶和滤纸酶的酶活。试验结果表明:在菌糠、花生蔓及玉米秸3种粗料底物中,花生蔓效果最好,可显著提高羧甲基纤维素酶、微晶纤维素酶和β-葡萄糖苷酶酶活(P0.05)。含水量对纤维素酶活影响明显,含水量为40%时对羧甲基纤维素酶、微晶纤维素酶、β-葡萄糖苷酶和滤纸酶酶活均有显著影响(P0.05)。不同底物类型与含水量的互作对4种酶的酶活影响显著(P0.05)。滤纸酶发酵8 d达到峰值,羧甲基纤维素酶、微晶纤维素酶和β-葡萄糖苷酶均为发酵4~6 d时酶活最高。综合各试验因素,试验以花生蔓为底物粗料,含水量40%,培养发酵4~6 d,纤维素酶活最佳。     

滤纸法测定饲用纤维素酶酶活的研究

本文采用滤纸法研究了影响饲用纤维素酶酶活测定的因素.结果表明:在37℃、pH 5.5条件下,滤纸法测定纤维素酶酶活的适宜波长是540 nm,DNS添加量为2 mL,沸水浴显色时间为5 min,显色后吸光值在15～90min内保持稳定.     

一株纤维降解菌β-葡萄糖苷酶基因的克隆与表达及酶学性质分析

试验对1株娄彻氏链霉菌(B5)的β-葡萄糖苷酶(高活性纤维降解酶)基因进行克隆,通过构建高效表达的载体实现基因表达,对所得表达产物的酶学性质进行测定分析,为饲用纤维素酶的开发利用提供参考。通过PCR扩增B5的Egl基因的完整CDS序列,构建pET-32a-egl表达载体,转化到BL21(DE3)大肠杆菌感受态细胞。试验成功构建了高产β-葡萄糖苷酶的基因工程大肠杆菌,实现了β-葡萄糖苷酶的分泌表达,其分子量约4.1×10-4 U,酶学特性分析表明,在40℃、pH值8、底物浓度为3.0×10~(-2) mol/L时,酶活力最高,为1 085 U/mL。     

纤维素酶活力测定条件研究

用DNS法测定纤维素酶活力,分析测定条件对测定结果的影响。在不同的条件下测定酶活力会得到不同的纤维素酶活力测定值。其中,酶液用量、酶解反应时间、温度对测定结果影响较大,酶液的稀释度、DNS显色时间对测定结果也有一定影响。测定纤维素酶活力的最适条件为:酶解反应时间为30min,最适温度40℃,DNS用量2.5ml,显色时间5min。     

精料类型及精粗比对瘤胃真菌固体发酵产纤维素酶的影响

试验采用二因素试验设计,研究固体发酵底物中精料类型及精粗比对瘤胃真菌产纤维素酶的影响。固体发酵底物精料类型为麦麸和玉米,精料与粗料花生蔓30∶70、40∶60、50∶50、60∶40和70∶30。试验进行10 d,每2 d采一次发酵样品,监测其中的微晶纤维素酶和β-葡萄糖苷酶、羧甲基纤维素酶和滤纸酶酶活。试验结果表明,麦麸作为精料底物可显著提高微晶纤维素酶、羧甲基纤维素酶和β-葡萄糖苷酶酶活(P0.05)。精粗比为70∶30的产β-葡萄糖苷酶和滤纸酶酶活显著高于其他各精粗比(P0.05)。试验条件下,麦麸为固体发酵底物精料,精粗比为70∶30,发酵时间为4~6 d获得较高的酶活。     

瘤胃4株纤维降解细菌的分离鉴定及其纤维降解特性

作者从蒙古绵羊瘤胃内容物中筛选出四株纤维素降解细菌并进行鉴定,将其编号为H1、H2、N1、N2,对菌株生长特性和纤维素酶活力进行测定,以期为后续试验提供试验材料。通过生理生化特征、DNA序列分析对分离菌株进行鉴定,比浊法测定细菌生长曲线,用还原糖法测定四株细菌的滤纸酶活、羧甲基纤维素酶活、水杨苷酶活和微晶纤维素酶活力。结果表明:经鉴定,四株菌中H1、H2为黄色瘤胃球菌(Ruminococcus flavefaciens),N1、N2为链球菌(Streptococcus);生长曲线测定表明菌株H1生长延迟期为4h,H2、N1、N2均为3h,黄色瘤胃球菌最大菌体浓度出现在28h,链球菌为14h;四株细菌均具有良好的纤维降解特性,其中H2滤纸酶活力、羧甲基纤维素酶活力、微晶纤维素酶活力显著高于菌株H1、N1、N2(P0.05),H1滤纸酶活力最低,为0.08μmol·(mL·min)-1。本试验利用hungate滚管法分离出4株具有纤维素酶活力的细菌,可以满足后续试验需要。     

芦丁对奶牛瘤胃内固相和液相降解纤维素相关酶活性的影响

本试验旨在研究芦丁对奶牛瘤胃纤维素酶活的影响。选择体重600 kg左右、体况良好、安装有永久性瘤胃瘘管的中国荷斯坦奶牛5头,采集瘤胃内容物制取固相和液相酶液,分别添加芦丁0(对照组)、0.02、0.04、0.06 mg/mL,采用DNS(3,5-二硝基水杨酸)还原法测定降解纤维素的相关酶活。结果表明:添加芦丁(0.02、0.04、0.06 mg/mL)的试验组与对照组相比较,奶牛瘤胃内容物固相和液相滤纸酶、β-葡萄糖苷酶、羧甲基纤维素酶、微晶纤维素酶酶活均有显著提高(P<0.05),而果胶酶与木聚糖酶同对照组相比差异不显著(P>0.05),各组固相酶活都明显高于液相酶活。     

饲用细菌纤维素酶的发酵条件优化与性质研究

对从四川卧龙中国保护大熊猫研究中心提供的野外放归大熊猫“祥祥”的粪样中分离到的产纤维素酶菌株JF-1116进行摇瓶产酶培养。试验结果表明,以0.5%羧甲基纤维素钠(CMC-Na)为碳源,1%蛋白胨为氮源,3%麸皮为添加物,在28℃,20%装液量,摇床振荡培养24h后,其发酵液滤纸酶活(FPA)可达111.5U/mL。通过对其粗酶液的性质进行测定,该菌所产纤维素酶粗酶液中的FPA、CMCase和β-葡萄糖苷酶的最适产酶温度分别为50、50、55℃。其中CMCase在pH值4.2～5.4酶活较高,其最适反应pH值为4.8,经50℃处理1h后,可保持原活力的93.5%。     

多粘类芽孢杆菌β-葡萄糖苷酶bglA、bglB和bgl基因在大肠杆菌中的表达

为了有效地提高β-葡萄糖苷酶的活性,本实验将多粘类芽孢杆菌(Bacillus polymyxa)β-葡萄糖苷酶bglA、bglB和bgl(bglA和bglB基因)基因分别连接在pET-28a上并在大肠杆菌C41中表达。将这3株重组菌分别命名为EA、EB及共表达菌株EAB,并将构建好的工程菌EA和EB按1∶1,1∶2,2∶1进行混合培养,分别比较单一酶组分、共表达及混合表达菌株的酶活。SDS-PAGE电泳图显示BglA和BglB的大小都为50ku,EA和EB混合培养的蛋白大小也为50ku,Bgl大小为100ku,表明BglA和BglB在体外不能形成蛋白复合物,只有在生物体内才能形成Bgl复合蛋白。酶活测定结果表明共表达Bgl与多粘类芽孢杆菌的酶活差异不显著,但显著高于其他组分酶活(P0.05)。刚果红染色结果也表明Bgl酶活比单一酶组分的酶活明显提高。本实验为纤维素酶多组分人工组装及集成生物工艺菌种的构建奠定实验基础。     

湿地土壤中纤维素降解菌的分离筛选研究

为了得到更高效地分解堆肥中纤维素成分的细菌,以羧甲基纤维素钠为碳源,从土壤样品中初步分离能降解纤维素的细菌,对其进行革兰染色和16S rDNA序列分析;通过纤维素刚果红水解圈测定、滤纸条降解试验和纤维素酶活力测定对已分离保存的菌株做进一步筛选。结果表明,以羧甲基纤维素钠为碳源,初步分离得到土壤中纤维素降解菌41株,进一步筛选到具有刚果红水解圈菌株6株,6株菌中可以更好地降解滤纸条的有3株,分别为XQ-8、XQ-10和XQ-11,经16S rDNA鉴定该3株菌中有2株为吉氏纤维素菌（Cellulomonas gilvus）,1株为恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）,且该3株菌的纤维素酶活力分别为（28.95±1.48）、（54.70±1.56）、（58.85±3.75）U/mL。该研究从土壤中筛选得到了3株具有较高纤维素酶活力的细菌,可以作为有效降解纤维素的潜力菌株进行粪污堆肥发酵剂的研制。     

产纤维素酶细菌的分离筛选与鉴定

通过筛选获得高产纤维素酶细菌菌株,为纤维素酶制剂研制及纤维素酶工程菌构建提供试验材料。采用刚果红平板从牛羊粪便及腐败的玉米秸秆和木屑中分离产纤维素酶菌株,以DNS法测定酶活,根据酶活复筛产纤维素酶分离菌株;观察分离菌株的形态、染色与培养特性;应用16S rDNA通用引物扩增菌株基因组DNA,测序结果提交GenBank数据库进行Blast比对分析和相似性搜索,作出复筛菌株种的鉴定。结果表明:分离获得16株纤维素酶产量较高的细菌菌株,均为革兰氏阳性菌,菌体呈短杆状、具中央芽孢,经16S rDNA序列比对分析和相似性搜索,鉴定为10株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、6株解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。     

超高效液相色谱-串联质谱法检测动物肌肉组织中19种β-受体激动剂残留

建立了猪、牛和羊肌肉组织中吡布特罗、西马特罗、特步他林、齐帕特罗、沙丁胺醇、西布特罗、克伦塞罗、克伦丙罗、羟甲基克伦特罗、氯丙那林、莱克多巴胺、克伦特罗、妥布特罗、福莫特罗、溴布特罗、克伦潘特、班布特罗、马布特罗和马喷特罗等19种β-受体激动剂残留检测的超高效液相色谱-串联质谱方法.猪、牛和羊肌肉组织样品用乙腈和异丙醇（8：2,V/V）提取,加入NaC1、Na2SO4和MgSO4盐析去杂质.待测药物经BEH C18色谱柱分离,以0.1％甲酸乙腈溶液和0.1％甲酸水溶液为流动相进行梯度洗脱.同位素内标法和基质匹配标准溶液外标法定量.19种β-受体激动剂在系列浓度范围内呈现良好线性关系,相关系数r2均大于0.99;19种药物在肌肉组织中的检测限为0.25 μg/kg,定量限为0.5μg/kg.从0.5、1和5μg/kg三个添加浓度检测结果可以看出,19种药物的回收率为73.7％ ～ 114.1％,批内批间相对标准偏差均小于20％.结果表明,该方法简便快捷、灵敏度高、定性准确,适用于该类药物残留的检测.     

一株纤维素酶产生菌SWU6菌株的筛选鉴定

为寻找高效纤维素降解菌,用于蚕沙及桑树废弃枝条等的加工处理,本研究以羧甲基纤维素钠(CMC-Na)为唯一碳源,从西南大学校园土壤中分离纤维素降解菌。结合测定菌株在羧甲基纤维素钠平板上形成水解圈直径与其菌落直径的比值,及胞外酶活测定法(DNS法)筛选获得一株纤维素酶高产菌株SWU6。该菌株24h发酵液上清液经DNS法检测纤维素酶活力达到136.24U/mL。菌种鉴定结果表明SWU6菌株为革兰氏阳性芽孢杆菌;过氧化氢酶、硝酸盐还原呈阳性;能水解淀粉、液化明胶。基于16SrDNA的系统发育分析结果表明SWU6菌株与登录号为NR 116240的甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)处于进化树的同一最小分支。综合菌体及菌落形态特征、生理生化实验结果以及基于16SrDNA的系统发育分析,将SWU6菌株鉴定为甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)。     

放牧强度对土壤水分影响的对应分析

为了解不同放牧利用强度对荒漠草原土壤水分含量的影响,采用随机区组设计,研究轻度（LG）、中度（MG）、重度（HG）放牧对短花针茅荒漠草原土壤水分含量的影响。不同放牧强度的载畜率分别为O．93（LG）、1．82（MG）、2．71（HG）sheep／（hm^2half year）,放牧羊只数分别为4、8、12只,放牧期为6个月／年。采用对应分析法比较不同放牧强度下近地表层0～10cm、10～20cm、20～30cm土壤的水分含量。结果表明,不同放牧梯度条件下,土壤含水量总体变化规律为LG〉CK〉MG〉HG．不同土层土壤含水量总体变化规律为0~10cm〉20-30cm〉10-20cm。各放牧强度对总特征值贡献率大小趋势为CK〉MG〉HG〉LG。随着放牧强度的增加,土壤含水量差异明显且呈梯度下降趋势。0-10cm土层土壤含水量受放牧强度的影响最大,其次为10～20cm和20～30cm土层．     

11株瘤胃源芽孢杆菌生理学特性研究

试验对已筛选的11株瘤胃源芽孢杆菌的产酶活力、耐酸、耐胆盐和抑菌活性及菌株间相容性进行研究。采用3,5-二硝基水杨酸法（DNS法）测定纤维素酶的活力,涂布平板计数法测定菌株的耐酸性、耐胆盐等特性,牛津杯法测定抑菌活性,滤纸片法进行室内相容性试验。结果显示,菌株T-2、T-3和T-10产纤维素酶的酶活力较高;菌株T-2、T-5、T-7、T-8和T-9表现较强的耐酸能力;菌株T-4、T-5、T-9和T-11表现较强的耐胆盐能力。菌株T-4和T-7对副溶血弧菌的抑菌活性较强,T-7对产气杆菌的抑菌活性最强,T-5、T-9、T-10对大肠杆菌抑菌活性较强,而T-3对藤黄八叠球菌指示菌的抑菌性最强。室内相容性试验结果表明,11株芽孢杆菌部分菌株之间存在颉颃作用,由此筛选出优良菌株的复配组合,抑菌可能的最优复配组合为T-3、T-4、T-5;T-3、T-4、T-10;T-4、T-5、T-10;T-3、T-7、T-10。纤维素酶活力较强时可能的最优复配组合为T-2、T-3、T-5;T-2、T-3、T-10;T-2、T-5、T-10;T-3、T-5、T-6;T-3、T-5、T-10。本试验可为动物饲料的研究和开发提供一定的参考依据。     

酶制剂对水稻秸秆青贮发酵品质及体外消化特性的影响

为探讨纤维素酶、木聚糖酶及两种酶组合添加对水稻秸秆青贮过程中结构性、水溶性碳水化合物组分含量及体外消化特性和发酵品质的影响，试验设4个处理组：1）0.3%蒸馏水（对照组，CO）；2）0.3%纤维素酶（CE）；3）0.3%木聚糖酶（XE）；4）0.15%纤维素酶+0.15%木聚糖酶（组合酶组，CX），分别于青贮3、7、14、30 d后取样分析。结果表明，与CO相比，CE、XE和CX组显著提高了乳酸、葡萄糖、果糖和蔗糖含量，显著降低了pH值、氨态氮、总挥发性脂肪酸、酸性洗涤纤维、中性洗涤纤维、纤维素和半纤维素含量，减少了干物质损失（P<0.05）。酶制剂显著提高了水稻秸秆青贮饲料24、48和72 h时的累积产气量和干物质体外消化率（P<0.05）。青贮末期CX组有最高的乳酸含量（34.13 g·kg^-1 DM）、体外产气量（68.27 mL）、干物质体外消化率（61.31%）和最低的pH值（4.36）。与CE和XE相比，CX组水溶性碳水化合物（葡萄糖、果糖和蔗糖）含量更高。综上所述，添加酶制剂可促进结构性碳水化合物的降解，提高水溶性碳水化合物的含量，改善水稻秸秆青贮发酵品质及体外消化率，与CE和XE相比，CX组发酵品质、碳水化合物的降解转化和体外消化特性更好。     

玉米专用菌肥研制及其部分替代化肥施用对玉米生长的影响

通过对前期分离自玉米根际优良促生菌（PGPR）菌株生长速度、固氮酶活性、溶磷量及分泌IAA 能力的测定,筛选获得7株优良 PGPR 菌株,将其制成玉米专用菌肥,于2013年进行田间试验,测定菌肥配施化肥对玉米叶面积与干物质积累的影响。结果表明,研制的玉米专用菌肥符合《微生物肥料》NY227-94标准。菌肥配施化肥减量15%~30%,在开花期前对玉米单株叶面积影响表现为全量化肥（A）〉85%化肥＋菌肥处理（B）〉70%化肥＋菌肥（C）〉100%菌肥（D）〉不施肥（E）;开花期后表现为：B〉A〉C〉D〉E。对干物质积累量影响在开花期前表现为：A〉B〉C〉D〉E,开花期后表现为：B〉A〉C〉D〉E。在玉米整个生育期菌肥配施减量化肥对玉米叶面积和干物质积累的影响变化是一致的。成熟期经济产量表现为：处理 B 显著高于其他处理（P 〈0.05）,比全量化肥显著提高2.7%;干草产量处理 A、B、C 间差异不显著,表现为：B〉A〉C,处理 B 比全量化肥干草产量提高2.1%;经济产量及干草产量处理 C 与 A 相比均有所下降,但差异不显著。     

刈割对羊草草甸草原生物量及牧草品质的影响

为明确刈割对羊草草甸草原生物量及品质的影响,确定适宜的刈割时间和合理的留茬高度,以科尔沁草原区羊草草甸草原为研究对象,于2016年利用刈割时间和留茬高度2个因素进行了随机区组试验研究,其中,刈割时间设3个水平,留茬高度设4个水平。结果表明,8月15日刈割的群落盖度、密度、地上生物量和羊草地上生物量显著高于8月1日刈割（P〈0．05）;随着刈割时间的推迟,群落和羊草cP含量逐渐下降,群落ADF和NDF含量逐渐增加,且8月1日刈割与9月1日刈割间差异显著（P〈0．05）,但与8月15日刈割无显著差异（P〉0．05）;羊草ADF和NDF含量呈增加趋势,各处理间无显著差异（P〉0．05）;0-10cm、10-20cm和20-30cm土层群落地下生物量呈逐渐增加趋势,羊草根茎生物量呈逐渐降低趋势。留茬高度2cm处理的群落地上生物量显著高于留茬高度8cm处理（P〈0．05）．与留茬高度5cm间无显著差异（P〉0．05）,留茬高度2cm、5cm和8cm处理间的群落CP含量无显著差异（P〉0．05）。科尔沁草原区羊草草甸草原适宜刈割时间为8月15日左右,以留茬高度2-5cm为宜。