家蚕5龄幼虫后部丝腺细胞酶基因表达的比较分析

基于了解家蚕后部丝腺细胞分泌丝素蛋白基因的表达调控信息,阐明蚕茧高产的机理,根据EST分析结果,分析了家蚕5龄幼虫不同发育时期后部丝腺细胞中酶基因的表达谱特征。发现家蚕5龄幼虫第1天和第5天的生理生化反应涉及氧化还原酶的数量最多,达到30个,转移酶数量达28个,水解酶数量达22个,合成酶数量达12个,裂合酶数量达6个,异构酶数量最少,只有4个。这6种酶基因在家蚕5龄第1天和第5天之间表达差异不大,表达频率超过10次的酶只有细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ、细胞色素C氧化酶亚基Ⅲ、S腺苷甲硫氨酸合成酶和肽基脯氨酸顺反异构酶。上述结果暗示家蚕5龄不同时期,丝素蛋白合成能力的差异与酶分子的数量关系不密切。     

家蚕变态期酚氧化酶原基因PPO1的表达谱分析

酚氧化酶在昆虫的变态发育和免疫防御机制中起着非常重要的作用。利用GenBank上登录的家蚕酚氧化酶原基因PPO1的cDNA序列设计正反向特异引物,通过半定量反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测了家蚕变态期(从5龄第3天到化蛾)雌、雄个体酚氧化酶原基因PPO1的转录活性。家蚕雌性变态期的PPO1基因仅在5龄第4天和上蔟第0、12、24、36、48、60小时及第3、4、5、6、8、10天有表达,其中上蔟第48小时和上蔟第3天的表达量最高;而在雄性家蚕变态期,该基因仅在5龄第4、5、6天及上蔟第36、48小时与第3、5、9、10天和蛾期有表达,其中上蔟第5天的表达量最高。家蚕PPO1基因的转录表达具有时空特异性,推测其在家蚕雌、雄个体变态发育的不同时期中执行不同的功能。     

家蚕5龄幼虫不同时期中部丝腺细胞蛋白质双向电泳分析

对5龄家蚕不同发育时期的中部丝腺细胞蛋白质变化进行分析研究,有利于发现与丝胶蛋白分泌有关的功能蛋白质。采用蛋白质双向电泳和图像分析技术,发现同一区段的家蚕中部丝腺细胞在5龄第2天、第4天和熟蚕期的蛋白质组成具有显著差异:中部丝腺前部区段5龄第2天表达的特异性蛋白质斑点有8个,第4天有16个,熟蚕期有24个;中部区段5龄第2天表达的特异性蛋白质斑点有9个,第4天有33个,熟蚕期有30个;后部区段5龄第2天表达的特异性蛋白质斑点有10个,第4天有7个,熟蚕期有25个。     

野桑蚕和不同家蚕品系幼虫体内1-脱氧野尻霉素含量测定

采用反相高效液相色谱(RP-HPLC)-紫外检测法测定了野桑蚕和不同品系家蚕体内的1-脱氧野尻霉素(1-DNJ)含量,并调查了家蚕5龄幼虫不同组织不同生长时期1-DNJ含量的变化。野桑蚕与家蚕、家蚕不同品系间的1-DNJ含量存在极显著差异:野桑蚕全蚕粉中1-DNJ含量最高,质量分数平均为0.427 8%;家蚕以黄血蚕最低,平均0.220 5%。家蚕5龄幼虫不同组织的1-DNJ含量也存在明显差异:家蚕血干粉中的1-DNJ含量最高,质量分数达0.848 7%;其次是中肠、体壁和脂肪体组织,分别为0.512 2%、0.472 2%、0.308 5%;而在丝腺中几乎检测不出1-DNJ。家蚕5龄幼虫体内1-DNJ含量随发育时期呈明显变化,5龄第4天含量最高,达0.329%,第5天以后迅速下降。     

N-甲基-N-亚硝基脲(MNU)对家蚕毒性的半致死剂量调查

N-甲基-N-亚硝基脲(MNU)是一种能诱导生物体产生随机点突变的烷化剂。为了完善利用MNU诱导家蚕突变的实验体系,用MNU处理家蚕品种大造的5龄第3天幼虫、化蛹第5天蛹、羽化当天的雄蛾及产后4～6 h的受精卵,通过Bliss法计算MNU对家蚕的半致死剂量(LD50)。结果显示MNU对不同发育时期家蚕的LD50值存在一定的差异:MNU对家蚕5龄第3天幼虫雌雄个体的LD50分别为28.735、20.157μg/头;对化蛹第5天蛹雌雄个体的LD50分别为56.466、54.672μg/头;对羽化当天的雄蛾的LD50为273.94μg/头;对产后4～6 h的受精卵的LD50为7 288.8μg/mL。实验数据表明,家蚕幼虫对MNU的毒性耐受能力差,蛾和卵的耐受能力较强;雌性个体对MNU毒性的耐受能力比雄性个体更强。     

家蚕丝氨酸蛋白酶抑制剂基因serpin16的表达规律及体外重组表达

家蚕(Bombyxmori)的丝腺是丝蛋白合成分泌的场所,存在多种丝氨酸蛋白酶抑制剂。为探究家蚕丝蛋白的合成和保护机制,采用半定量RT-PCR的方法调查家蚕丝氨酸蛋白酶抑制剂基因serpin16在家蚕不同发育时期和5龄第5天幼虫各个组织器官中的表达特征,结果表明家蚕serpin16基因仅在4眠-5龄第6天的发育期表达,并且仅在丝腺中特异表达,其中在中部丝腺前区转录水平最高,而在中部丝腺中区和后区的转录水平较低;进一步构建pGEX-4T-1-serpin16原核表达载体,并转化至大肠杆菌(Eschevichia coli)BL21(DE3),经IPTG诱导获得融合蛋白,纯化后得到单一的目的蛋白。家蚕serpin16基因在幼虫丝腺的特异表达模式提示其可能与家蚕的吐丝过程密切相关,推测该基因在维持丝腺稳定的泌丝环境中发挥重要作用。     

家蚕五龄至预蛹期翅原基及造血器官的切片观察

通过家蚕翅原基石蜡组织切片H.E染色和DAPI荧光染色的方法对五龄至预蛹期家蚕翅原基及造血器官的形态结构进行显微观察。实验发现:翅原基在预蛹前变化不大,而到预蛹期发育加快。翅芽细胞在5龄初到蛹前一直保持着器官芽状态,细胞密集,核物质丰富,占细胞比例大。造血干细胞的细胞核较大,在化蛹前进行大量增殖,随造血器官的破裂造血干细胞并散落到体腔中。     

家蚕防御素基因的序列特征与表达模式分析及原核表达试验

家蚕防御素(defensin)是家蚕抗菌肽家族的主要成员之一,为家蚕先天性免疫的重要效应因子。采用生物信息学方法分析家蚕防御素基因BmdefA、BmdefB的序列中各有2个外显子,2个基因分别定位于家蚕第4号和第13号染色体上;等电点预测BmdefA带有负电荷,属于罕见的阴离子型抗菌肽,而BmdefB带有正电荷,属于常见的阳离子型抗菌肽;预测2个基因编码的成熟肽分子质量均在4 kD左右。用RT-PCR方法检测BmdefA在家蚕整个发育过程中有表达,且在检测的幼虫和成虫各组织中均有表达;BmdefB从幼虫5龄第3天到成虫期表达,雄性表达量高于雌性,且在5龄第3天幼虫的生殖腺、脂肪体和血细胞中高水平表达。家蚕防御素BmdefA、BmdefB具有不同的分子特性和表达特征,暗示它们在家蚕先天免疫过程中可能行使不同的功能,甚至可能具有不同的抗菌机理。构建融合GST标签的家蚕防御素基因原核表达载体,通过在大肠杆菌细胞内诱导表达,获得可溶性的目的蛋白,使用GST亲和层析柱初步纯化表达的融合蛋白并进行Western blotting鉴定,为进一步研究BmdefA、BmdefB的体外活性和抑菌机制奠定基础。     

人类免疫缺陷病毒HIV结构蛋白Gag在家蚕杆状病毒表达系统中的表达

人类免疫缺陷病毒(HIV)是导致艾滋病的主要病原之一,HIV病毒的核心结构蛋白Gag有自我装配功能,并能激发体液免疫和细胞免疫,是理想的HIV疫苗靶抗原。将Gag基因克隆至质粒p Bac PAK8中构建重组质粒,并与线性化的家蚕杆状病毒基因组DNA共转染Bm N细胞,得到重组家蚕杆状病毒Bm NPV-Gag。将该重组病毒感染Bm N细胞和家蚕5龄幼虫,SDS-PAGE、Western blotting检测显示在重组病毒感染的Bm N细胞和家蚕5龄幼虫血淋巴中均有与Gag蛋白大小(55 k D)相符的特异性条带出现,证明重组Gag蛋白成功表达。用ELISA法测定重组病毒感染后不同时间目的蛋白质的表达变化:Bm N细胞中的Gag蛋白含量在感染后的第4天达到最大值6.995 pg/个,在感染第5天后出现下降趋势;5龄幼虫血淋巴中的Gag蛋白含量在感染后的第7天最高,为790.1 ng/m L。重组Gag蛋白在家蚕杆状病毒表达系统中的成功表达,为艾滋病疫苗的研究探索了新的途径。     

用不同家蚕品种5龄幼虫培育蚕蛹虫草中的1-脱氧野尻霉素含量检测

家蚕幼虫体内的活性物质1-脱氧野尻霉素(DNJ)的含量在家蚕品种之间存在差异。以蛹虫草菌(Cordyceps militaris)感染家蚕幼虫生产蚕蛹虫草,分别以20个家蚕品种的5龄第3天幼虫作为寄主,调查96 h家蚕感染率、10 d出草率及蚕蛹虫草中的DNJ含量,筛选蚕蛹虫草产量高且富含DNJ的家蚕品种。结果表明,蛹虫草菌对不同家蚕品种幼虫的感染率无显著差异,感染率和10 d出草率均达到100%;不同家蚕品种5龄第3天幼虫制备全蚕粉样品中的DNJ含量存在极显著差异,其中家蚕品种楚玉样品中的DNJ质量分数最高达0.557 5%,用不同家蚕品种5龄第3天幼虫培育的蚕蛹虫草中的DNJ含量也存在极显著差异,其中用家蚕品种东四单幼虫培育蚕蛹虫草样品中的DNJ质量分数最高达0.239 7%。依据试验结果初步认为,不同家蚕品种幼虫接种同一株蛹虫草菌对人工培育蚕蛹虫草的出草率没有影响;蛹虫草菌在蚕体内生长过程中会在一定程度降低蚕体原有的DNJ含量,家蚕品种东四单的5龄幼虫可用于生产高DNJ含量的蚕蛹虫草。     

用原子荧光法检测家蚕体内硒的含量及其分布

硒对动物生殖发育、免疫系统具有重要功能,是动物必需微量元素。采用原子荧光法对不同系统家蚕体内硒的含量及其分布进行测定,结果显示:在喂食相同桑叶的情况下,不同系统家蚕品种幼虫体内的硒含量存在显著差异,5龄第4天的中系家蚕品种幼虫体内的硒含量明显高于日系家蚕品种,其中中系家蚕品种19-570体内的硒含量最高。对家蚕品种大造体内硒分布的研究结果表明:精巢中的硒含量明显高于其他组织,头部次之,脂肪体中的硒含量相对较低,由此推测硒在家蚕的生殖发育过程中可能发挥着重要作用。     

家蚕氟化物中毒后血淋巴中脂质过氧化物和抗氧化物含量及抗氧化酶活性的变化

为了探究氟化物对家蚕的毒理作用,通过给家蚕5龄期幼虫添食NaF,检测氟化物中毒家蚕幼虫血淋巴中脂质过氧化物质丙二醛(MDA)、抗氧化物质谷胱甘肽(GSH)的含量变化以及谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、谷胱甘肽硫转移酶(GST)等抗氧化物酶的活性变化。正常家蚕幼虫和氟化物中毒家蚕幼虫血淋巴中的MDA含量在5龄期均逐渐下降,但氟化物中毒家蚕的MDA平均浓度比正常家蚕升高了83.77%;GSH含量变化趋势为5龄第1天和第5天较高,第3天较低,但氟化物中毒家蚕5龄期的GSH浓度平均比正常家蚕下降了47.81%;氟化物中毒家蚕5龄期的GSH-Px和GST的平均活性分别比正常家蚕升高63.49%、39.22%,5龄第3天达到最高峰,5龄第1天和第5天较弱。初步分析认为家蚕幼虫血淋巴中MDA和GSH的含量变化以及GSH-Px和GST的活性变化,与家蚕氟化物中毒后体内氧自由基含量上升和脂质过氧化作用增强密切相关,可作为诊断家蚕氟化物中毒的生化指标。     

不同家蚕品种血液黄酮类化合物含量的测定及分析

本研究对浙江大学动物科学学院家蚕种质资源库中四种不同茧色的家蚕品种即绿色茧P50、黄色茧金秋、白色茧玉丰以及红色茧HHM的五龄第1～6天黄酮类化合物含量进行了测定,同时对种质资源库中其他蚕品种五龄第4天血液中黄酮类化合物含量进行了测定,并且分析了不同蚕品种以及不同茧色之间的差异及变化规律.结果显示黄酮类化合物的峰值依品种特性出现在五龄第3或第4天,绿色茧的黄酮类含量变化规律与其他品种截然不同,品种间黄酮类化合物的含量差异很大,可能与品种的全茧量及五龄发育经过长短有关.     

家蚕模式识别受体PGRP、βGRP编码基因的克隆鉴定及表达谱分析

模式识别受体(PRR)是生物体先天免疫系统中免疫受体的代表,对生物体的生存极为重要。克隆鉴定了家蚕的14个模式识别受体编码基因,包括10个肽聚糖识别蛋白(PGRP)基因和4个β-葡聚糖识别蛋白(βGRP)基因,并得到了BmPGRP-S3、BmPGRP-S4和BmPGRP-L5的完整编码序列。家蚕PGRP的长型和短型亚家族都具有典型的酰胺酶活性结构域,短型亚家族具有信号肽,长型亚家族则没有信号肽。5个PGRP长型亚家族基因成簇分布于第1号染色体;5个PGRP短型亚家族基因中有2个分布于第9号染色体,有3个分布于第16号染色体。家蚕βGRP家族成员都具有信号肽,其中BmβGRP1-3成簇分布于第11号染色体,编码蛋白不具有典型的葡聚糖结合结构域;BmβGRP4独立分布于第22号染色体,编码蛋白具有典型的葡聚糖结合结构域。基因芯片数据分析表明,BmPGRP-L5和BmβGRP1在5龄第3天幼虫各组织中没有表达,其余12个模式识别受体基因为多组织表达,但在丝腺组织中均无表达。在这12个模式识别受体基因中,BmPGRP-L3等6个模式识别受体基因在中肠组织中的表达水平偏高;BmβGRP3、BmβGRP4和BmPGRP-L3、BmPGRP-L4等在家蚕生殖腺中的表达水平较高。在生殖腺以外的其他各组织中,这12个基因的表达不具有雌雄差异性。BmβGRP1在家蚕各发育时期没有表达,BmPGRP-L5主要在变态发育的转折期表达,其余12个模式识别受体基因在各发育时期均有表达,并从5龄第3天幼虫到上蔟第2天有较高水平的表达,雌雄个体间无表达差异性。由此说明这些模式识别受体基因的表达具有一定的组织性和发育时期性。给人工饲料无菌饲养的家蚕5龄第3天幼虫分别添食大肠杆菌、家蚕黑胸败血菌和家蚕白僵菌,对免疫诱导3、6、12和24h的家蚕进行个体水平的实时荧光定量PCR检测,发现PGRP长型亚家族基因BmPGRP-L1、BmPGRP-L3和短型亚家族基因BmPGRP-S1-3均能被这3种微生物诱导上调表达;βGRP基因家族中的BmβGRP3、BmβGRP4也能被3种微生物诱导上调表达。同时对诱导12h时家蚕各组织中14个家蚕模式识别受体基因的表达谱进行分析,结果显示经3种微生物分别诱导后,家蚕头部组织中BmβGRP2、BmβGRP4、BmPGRP-L2和BmPGRP-S1、BmPGRP-S3-5均上调表达;表皮、中肠和脂肪体中仅有BmβGRP3、BmPGRP-L4等少数模式识别受体基因上调表达。     

家蚕葡萄糖-甲醇-胆碱氧化还原酶家族基因BmGMCβ2的克隆及序列与表达分析

葡萄糖-甲醇-胆碱氧化还原酶(glucose-methanol-choline oxidoreductases,GMC)家族是昆虫体内一大类以黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)为辅酶的氧化还原酶类,家蚕基因组中含有43个GMC家族基因。以家蚕5龄幼虫cDNA为模板克隆到一个家蚕GMC家族基因,命名为BmGMCβ2(GenBank登录号:JQ965926)。该基因cDNA全长1 875 bp,编码624个氨基酸,预测蛋白质分子质量为69.3 kD,pI为6.21,定位于家蚕16号染色体的nscaf3058上,编码蛋白质含GMC家族共有的ADP-bindingβ-α-β折叠结构域。系统发育分析表明该基因是家蚕GMC家族β亚家族基因成员。RT-PCR检测家蚕不同发育时期和5龄第3天幼虫不同组织中BmGMCβ2基因mRNA转录水平,以5龄盛食期最高,并且主要在表皮、脂肪体和气管中转录表达;Westernblotting分析BmGMCβ2蛋白主要在5龄第3天幼虫的脂肪体中表达。将BmGMCβ2克隆到原核表达载体pET-28a(+)中,转化E.coli BL21表达菌株,IPTG诱导表达BmGMCβ2融合蛋白,通过His-亲和层析得到纯化的融合蛋白并制备多克隆抗体,为后续研究该蛋白在家蚕生长发育过程中的功能奠定了基础。     

人血小板因子Ⅳ在家蚕杆状病毒表达载体系统中的表达

将人血小板因子Ⅳ (HumanPlateletFactorⅣ ,简称hPF4)基因重组于家蚕杆状病毒转移载体pBacPAK8中 ,获得重组转移载体pBacPAK PF4,并与线性化病毒Bm BacPAK6DNA共转染家蚕培养细胞 ,在细胞内发生同源重组 ,获得重组病毒BacPAK PF4。Southern杂交结果表明重组病毒基因组中含有hPF4基因。重组病毒以MOI=10感染家蚕培养细胞 (2× 10 6个细胞 )和家蚕 5龄幼虫 ,表达产物用体外培养的血管内皮细胞测定其生物活性 ,测得表达量在家蚕培养细胞中第 3天达到最高值为 6 0 88μg/ 2× 10 6个细胞 ;在蚕体内表达第 5天达到最高值 ,表达量明显高于家蚕培养细胞     

家蚕金属羧肽酶基因家族的鉴定与表达分析

金属羧肽酶是昆虫消化管中参与食物消化吸收的重要酶类,并可能在昆虫变态、发育、抗病免疫等多种生命过程中发挥重要作用。利用家蚕全基因组数据库,基于同源搜索和隐马尔可夫模型搜索相结合的方法,对家蚕金属羧肽酶基因家族进行鉴定。全基因组预测家蚕的金属羧肽酶基因家族包括22个成员,推导的氨基酸序列均具有锌离子结合位点和金属羧肽酶M14的保守特征。根据其保守氨基酸序列不同,家蚕的金属羧肽酶分属于M14A、M14B和M14D 3个亚家族。通过RTPCR方法检测显示22个家蚕金属羧肽酶基因中有18个基因在家蚕不同组织和发育时期中表达,其中7个基因在家蚕5龄第3天幼虫中肠组织特异高量表达,提示金属羧肽酶在家蚕对营养物质的消化吸收中有重要作用;家蚕5龄幼虫添食感染Bm NPV后24 h内,中肠中有5个金属羧肽酶基因上调表达,表现出对病原微生物侵染的应答反应。研究结果有助于解析家蚕金属羧肽酶在蚕体对营养物质的消化和对病原物入侵应答中的功能作用。     

吡丙醚的残效期及低浓度添食对家蚕结茧影响试验

为探讨大田农药吡丙醚对蚕茧生产的影响,进行了低浓度吡丙醚添食试验。结果表明,吡丙醚对家蚕结茧影响较大,5龄第4天添食1.00×10~(-3) mg/L、5.00×10~(-4) mg/L、2.50×10~(-4) mg/L的吡丙醚24 h,对家蚕的结茧有影响,但到5龄第14天能够全部结茧;用1.00×10~(-2) mg/L、1.00×10~(-3) mg/L的吡丙醚,在5龄不同时间分别添食24 h,添食越晚,结茧率越低;从5龄第4天连续添食6.25×10~(-5) mg/L、3.13×10~(-5) mg/L的吡丙醚、从5龄第5天连续添食6.25×10~(-5) mg/L的吡丙醚,均可造成家蚕不结茧。吡丙醚在桑叶上的残效期超过47 d。     

家蚕自噬相关蛋白BmATG6的多克隆抗体制备及呋虫胺胁迫下的表达

自噬是生物体内维持细胞环境稳定的重要机制，在生物体面临外界刺激时会被诱导以进行适应性反应。对家蚕自噬相关蛋白BmATG6进行基因克隆，制备多克隆抗体，分析呋虫胺暴露后BmN细胞与家蚕5龄第3天幼虫BmATG6的表达变化。氨基酸序列比对表明BmATG6与鳞翅目昆虫的ATG6/Beclin 1相似度较高。原核表达并纯化了BmATG6抗原蛋白，随后接种新西兰白兔，获得效价1∶64 000的多克隆抗体，Western blot在家蚕中肠样品中检测到大小约为50 kD的条带。呋虫胺处理2 h后BmN细胞中的BmATG6蛋白表述显著上调；呋虫胺处理24 h后，家蚕5龄第3天幼虫中肠和脂肪体中的BmATG6蛋白表达上调。结果表明，呋虫胺显著诱导BmN细胞和家蚕组织中的BmATG6表达上调。研究结果为解析新烟碱杀虫剂对非靶标生物的毒性机制和研究家蚕自噬调控机制提供了理论基础。     

家蚕肠液对昆虫杆状病毒感染性的影响

用电击法取 5龄第 4天的家蚕肠液 ,加入家蚕核多角体病毒 (BombyxmoriNucleopolyhedrosisVirus)和宿主域扩大的苜蓿尺蠖核多角体病毒 (HybridAutographacalifornicaNucleopolyhedrosisVirus)的多角体或游离病毒粒子 ,分别作用 70min和 4 0min后 ,感染家蚕细胞Bm 5和秋粘虫细胞Sf 2 1,发现病毒粒子已经被家蚕肠液灭活。进一步用BmNPV多角体喂饲 2龄蚕后 ,收集 2 4h内的蚕粪 ,用培养基浸泡后 ,抽提液中亦不含有具感染性的病毒粒子。上述结果说明家蚕肠液对昆虫杆状病毒的病毒粒子具有很好的灭活作用。因而 ,在家蚕核多角体病毒病预防上 ,提高蚕的健康水平、注意起蚕处理和饲养密度、及早发现和隔离病蚕是有效的防治措施。