砀山梨炭疽病病原鉴定及其抑菌药剂筛选

【目的】明确近年来严重危害砀山梨的炭疽病病原菌种类,研究常用杀菌剂对致病菌菌丝生长、分生孢子萌发的抑制作用。【方法】对6个取自不同梨品种上的病果、病叶样本分别进行发病组织培养、单孢分离纯化,根据病原菌的形态特征和致病性,并结合其rDNA-ITS序列分析,进行病原菌种类鉴定。采用常用杀菌剂分别对病原菌菌丝和分生孢子进行处理,观测其化学抑制效果。【结果】从不同病斑上分离出了6个纯化菌株,其形态特征相同,且与已报道的炭疽病菌(Colletotrichum spp.)形态特征相似;用上述纯培养菌株接种于健康果实和叶片上,又引起与田间原标本相同的病害症状;通过病原菌rDNA-ITS克隆测序、BLASTn比对分析,6个菌株为同一致病菌,且该致病菌与台湾枣(Taiwan jujube)炭疽菌株(Colletotrichum sp.EXMQ-1;登录号FJ233185)、日本超市水果(Japanese fruit)炭疽菌株(Glomerella cingulata;登录号AB219012)和凤梨草莓(Fragaria ananassa)炭疽菌株(C.gloeosporioides;登录号EU200455)的rDNA-ITS序列一致;430g·L-1戊唑醇水悬浮剂等7种杀菌剂对病原菌菌丝生长抑制率达100%;70%代森锰锌可湿性粉剂等8种药剂处理,病原菌分生孢子萌发率为0。【结论】危害砀山梨的炭疽病病原菌为半知菌亚门刺盘孢属的胶胞炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides),其有性阶段为围小丛壳(Glomerella cingulata)。常用药剂对该菌菌丝和分生孢子的抑制作用存在着显著的差异。     

春兰叶斑病病原的鉴定和分析

【目的】明确野生春兰引种驯化过程中引发叶斑病的病原菌种类,为春兰叶斑病的诊断和防治提供科学依据。【方法】采集广东省广州市和贵州省遵义市典型春兰叶斑病的病叶,利用组织分离法对病原菌进行分离纯化;依据柯赫氏法则,通过刺伤接种和摩擦接种验证其致病性;根据病原菌形态学特征,结合ITS、ACT、CAL、EF-1a、GAPDH、GS和TUB2部分序列的多基因分子系统学分析等方法进行病原菌分类鉴定。【结果】从采集的3种不同类型症状的叶斑病病叶中共检测到4株致病菌,分别命名为GZH1、GZH2、GZH3和GZH4,其中GZH1和GZH4分离自广东广州采集的叶斑病病叶,GZH2和GZH3分离自贵州遵义采集的叶斑病病叶。致病性测定结果显示,菌株GZH1表现出较强的致病性,离体针刺接种发病明显;菌株GZH2、GZH3和GZH4离体针刺接种发病不明显,通过摩擦接种可在接种部位形成典型的坏死斑。菌株GZH1在PSA培养基上的菌落特征,大、小型分生孢子,小型分生孢子梗、厚垣孢子的形态及大小均符合尖镰孢（Fusarium oxysporum）的特征,其ITS和EF-1a部分序列与F. oxysporum菌株UACH...     

一种八角炭疽病新病原鉴定

【目的】通过研究八角炭疽病病原菌,为防治八角炭疽病提供病原学基础。【方法】对采自广西玉林、崇左、河池、百色、防城港等市八角炭疽病样本,进行单孢分离,致病性测定,采用形态学特征结合病原菌核糖体内转录间隔区(ITS)、微管蛋白(TUB2)、肌动蛋白(ACT)和3-磷酸甘油醛脱氢酶(GPDH)多基因分子系统学的方法对分离菌株进行鉴定。【结果】菌株在PDA培养基25℃暗培养7 d后,菌落呈圆形,灰白色至灰黑色,分生孢子无色单细胞,圆柱状,顶端钝圆,基部平截,光滑,大小为(17.09±1.11)μm×(5.26±0.55)μm,分生孢子附着孢近椭圆形,浅褐色,边缘光滑完整,大小为(7.72±0.77)μm×(5.45±0.68)μm;病原菌ITS、TUB2、ACT和GPDH四基因联合系统发育树显示,供试菌株与包括模式菌株在内的哈锐炭疽菌(Colletotrichum horii WeirJohnst)聚在同一进化分支上。【结论】确定八角炭疽病病原菌为哈锐炭疽菌(Colletotrichum horii),其为八角炭疽病一种新的病原。     

进境棉籽中胶孢炭疽病菌的分离与鉴定

对一批澳大利亚进境的棉籽进行了病原菌分离,在棉籽上分离到1株疑似胶孢炭疽病菌的菌株CG-92963。通过对该菌株进行病原菌形态学观察、致病性测定并结合分子生物学方法检测。结果表明,菌株CG-92963在PDA上产生大量分生孢子,分生孢子呈长椭圆形或圆筒形;分别用真菌通用引物、特异引物对CG-92963进行扩增和测序,Blast分析结果表明其与GenBank中胶孢炭疽病菌ColletotrichumgZOP0sp0以0idPs序列同源性为100％;该菌不仅侵染棉花,还侵染芒果和梨。根据上述实验结果,将分离获得的菌株CG-92963鉴定为胶孢炭疽病菌ColletotrichumgtoeoSportoiaes（Penz）Sacc,     

我国草莓胶孢炭疽菌的多基因联合鉴定与致病性分析

为科学防控草莓炭疽根腐病,本研究在调查全国12个草莓主产区的109株草莓根部腐烂样品的基础上,对导致草莓根部腐烂的病原菌进行菌落形态鉴定、分离纯化与分子鉴定、多基因序列(ITS-ACT-GAPDH-CAL-TUB2-CHS)联合鉴定以及致病性鉴定。结果表明:109株草莓根部腐烂样品中有27.5%的样品是由草莓炭疽根腐病病原菌胶孢炭疽菌复合种(Colletotrichum gloeosporioides complex)引起;胶孢炭疽菌复合种可分为3种生理小种,分别为暹罗炭疽菌(C.siamense)、隐秘炭疽菌(C.aenigma)与果生刺盘孢菌(C.fructicola);3种炭疽菌致病力由高到低依次为隐秘炭疽菌、果生刺盘孢菌和暹罗炭疽菌。其中隐秘炭疽菌发病较快,引起的病症较重。综上,本研究可为草莓炭疽根腐病病害防控提供有价值的信息。     

蓝莓炭疽病病原菌鉴定及致病性测定

【目的】鉴定辽宁省部分地区疑似炭疽病的蓝莓病株的病原,为蓝莓病害的防控及抗病育种提供依据。【方法】对采自辽宁省兴城市和庄河市的疑似炭疽病的蓝莓发病枝条及叶片进行组织分离、培养,从所分离获得的两类菌株中选择形态学不同的代表菌株LNSW1和B-Cg1进行后续试验和分析。观察两个代表分离菌株在马铃薯葡萄糖琼脂培养基（potato dextrose agar,PDA）上的菌落及分生孢子的形态特征。对代表菌株LNSW1和B-Cg1的真菌核糖体基因进行PCR扩增和测序,采用Mega5.1软件中邻位加入法（neighbor-joining,NJ）进行基于病原菌rDNA-ITS基因序列和GenBank中已有相关炭疽菌序列的系统发育树构建。利用尖孢炭疽菌（Colletotrichum acutatum）和胶孢炭疽菌（C. gloeosporioides）的特异性引物对CgInt2/ITS4和CgInt/ITS4对代表菌株进行特异性扩增,采用菌丝块叶片接种法对8个蓝莓品种进行代表分离菌株的致病性测定。【结果】从辽宁省部分蓝莓产区罹病植株上共分离纯化得到36个菌株,根据各菌株的形态学差异将其分成两个类别,两类别中代表菌株LNSW1和B-Cg1在菌落颜色及分生孢子形态上具有较大差异,且与已报道的炭疽菌属当中的尖孢炭疽菌和胶孢炭疽菌形态特征相似;两个代表分离株的rDNA-ITS序列实际长度为557和547 bp,通过基于真菌核糖体基因的系统发育分析,表明菌株LNSW1与GenBank中尖孢炭疽菌菌株AB729126、KF698729、EU886755聚在同一分支,B-Cg1与胶孢炭疽菌菌株JF923828、KF516931、GU174547聚在同一分支,相似度分别为99%-100%;两对炭疽菌特异性引物扩增结果再次证明所获代表菌株分别为尖孢炭疽菌和胶孢炭疽菌; 致病性测定结果表明,尖孢炭疽菌和胶孢炭疽菌菌丝块接种8个蓝莓品种的叶片及枝条均可致病,两类病菌回接症状与田间自然发病症状较为相似,尖孢炭疽菌对蓝莓的致病稍强于胶孢炭疽菌。【结论】通过对辽宁省蓝莓主产区的蓝莓发病枝条及叶片的病原菌进行形态学和分子学鉴定,基本明确辽宁省部分地区的蓝莓炭疽病是由尖孢炭疽菌和胶孢炭疽菌侵染所致。     

新疆南疆9种不同林果树木腐烂病菌无性形态比较

对南疆不同林果树木寄主来源腐烂病菌无性形态比较,为病原菌的准确鉴定及摸清病原菌间亲缘关系提供理论依据。观察分生孢子器在寄主表皮着生状态;挑取病样子实体进行切片观察分生孢子器纵横切面、分生孢子形态特征;将不同寄主来源腐烂病菌接种于PDA培养基上,观察记录菌落颜色、形态和产孢体形态特征。不同寄主来源分生孢子器表生、半埋生或者埋生于树皮之上;分生孢子器腔室数量不同,纵横切面大小存在明显差异;分生孢子有腊肠形和香蕉形两种;在PDA培养基上形成的菌落特征也存在明显差异。依据无性形态鉴定,梨壳囊孢菌(C.carphosperma Fr.)、苹果壳囊孢菌(C.mandshurica Miura)、桃壳囊孢菌(C.leucostoma Sacc.)、胡桃壳囊孢菌(C.juglandis(DC)Sacc)和柳属壳蕉孢菌(C.salicis Rab.)相似度较高。     

农杆菌介导苹果炭疽病菌的遗传转化及转化子鉴定

【目的】优化农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导转化苹果炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）的技术体系,并对转化子进行筛选鉴定,比较其生物学特性和致病性差异。【方法】以苹果炭疽病菌LXS010101分生孢子为转化受体,利用携带重组双元载体的农杆菌进行转化;对获得的转化子进行遗传稳定性测定、PCR检测及Southern blot分析;选取一定数量的转化子,比较其菌落形态、生长速率及分生孢子发育等主要生物学性状及致病性的差异。【结果】苹果炭疽病菌的最优转化体系为：病菌分生孢子悬浮液浓度1×105个/mL,共培养温度和时间分别为22℃和24 h,共培养基中添加200 μmol•mL-1乙酰丁香酮,其转化效率达到1×105个孢子可获得439个转化子。随机选取30个转化子进行鉴定,发现T-DNA已整合进炭疽病菌基因组中,在所检测的转化子中都是以单拷贝的形式整合,且能够稳定遗传。与野生型菌株相比,转化子的菌落形态没有发生明显变化,但23.33%的菌株生长速率显著减低;转化子ATJ-3和ATJ-15不能产生分生孢子,在28个产孢菌株中,分生孢子萌发率显著减低的菌株占39.29%,附着胞形成比例显著减低和形态异常的菌株占25.00%。致病性测定结果显示,11个转化子的致病力显著降低,其中菌株ATJ-19完全丧失致病能力。【结论】优化的苹果炭疽病菌遗传转化技术体系,可用于炭疽病菌致病相关基因的克隆及致病分子机理的研究。     

自噬相关基因FpAtg3参与假禾谷镰孢的生长和致病

【背景】假禾谷镰孢（Fusarium pseudograminearum）引起的小麦茎基腐病是我国小麦生产上的新病害。自噬是真核生物中普遍发生的细胞过程,调控多种植物病原真菌的生长发育和侵染,但其在假禾谷镰孢中的作用还不明确。【目的】明确假禾谷镰孢自噬相关基因FpAtg3在该病菌生长和致病中的作用,解析假禾谷镰孢致病机理,为小麦茎基腐病科学防控提供理论依据。【方法】从NCBI数据库中下载主要真菌的Atg3氨基酸序列,利用MEGA5.05构建系统进化树。利用Split-PCR策略构建FpAtg3基因敲除盒,经PEG介导的原生质体转化导入假禾谷镰孢野生型菌株中。利用潮霉素抗性筛选阳性转化子,并经PCR检测获得FpAtg3基因缺失突变体（ΔFpAtg3）。构建pKNTG-FpAtg3重组载体,导入ΔFpAtg3菌株,利用FpAtg3自身启动子启动FpAtg3的转录,以获得FpAtg3缺失突变体的回补菌株。利用假禾谷镰孢营养生长的培养基PDA、CM和MM测定菌丝生长速率和菌落形态;PDA培养基上测定菌丝形态和菌丝融合率;CMC培养液中测定分生孢子的产量及形态;皮氏培养基上测定孢子融合芽管调控的...     

郑州地区草莓红斑叶枯病病原鉴定及防治药剂筛选

为明确郑州地区草莓红斑叶枯病的病原菌种类,采用组织分离方法对来源于郑州地区的草莓病株进行分离纯化,获得菌株CM3,并对其进行了形态学及rDNA-ITS序列分子鉴定;同时,采用室内离体叶片接种法进行致病性和毒力测定。结果表明,菌株CM3病原菌菌落在PDA培养基上呈白色浓密状菌丝体,表面呈波浪状,背面淡黄色,分生孢子呈纺锤形或梭形,有4个横隔膜,测量大小为(19.35～32.5)μm×(8.1～9.2)μm。分生孢子顶端细胞呈透明状,并长有附属丝,分生孢子中央深褐色。菌株CM3的ITS序列与GenBank中棒状拟盘多毛孢(Pestalotiopsis clavispora)相似性达100%,故将草莓红斑叶枯病的病原菌鉴定为棒状拟盘多毛孢,这是棒孢拟盘多毛孢在河南郑州地区草莓上的首次报道。室内毒力试验结果表明,10%苯醚甲环唑WG对该菌抑制效果显著,可在郑州地区草莓生产上推广应用。     

中国主要茶区茶树炭疽菌系统发育学

【目的】炭疽菌能够侵染茶树叶片并造成病叶干枯、脱落,论文旨在分离、鉴定中国主要茶区茶树炭疽病的病原菌,为茶树病害防治工作提供科学依据。【方法】利用单孢分离法对采自中国15省（市、自治区）茶区的茶树炭疽病病叶进行炭疽菌分离,并对其ITS、TUB2两个位点进行PCR扩增和测序,测序结果采用MEGA 6.0软件以邻接法（Neighbor-Joining,NJ）构建多基因位点系统发育树。对分离的菌株在马铃薯葡萄糖琼脂培养基（potato dextrose agar,PDA）上的形态特征进行描述。对龙井43和中茶108茶树品种叶片进行有伤和无伤处理后接种代表性菌株,测试其致病性。【结果】以茶树上分离的炭疽菌菌株的2个基因位点序列（ITS、TUB2）构建多基因位点系统发育树,Colletotrichum boninense CBS 123755作为外群,结果表明所有菌株聚为3支,其中45个菌株与C. camelliae聚为一族、28个与C. fructicola聚为一族、5个与C. siamense聚为一族,所有菌株均归属于C. gloeosporioides复合种,并且C. camelliae在中国茶区分布范围最广,为茶树炭疽菌的优势种。形态特征结果表明,C. camelliae在PDA培养基上生长速度平均11.8 mm·d^-1,菌落白色,气生菌丝致密,绒毛状,中央凸起,边缘整齐;菌核、刚毛未见;分生孢子梗、产孢细胞未见;分生孢子透明,光滑,圆柱状,两端钝圆或基部渐尖,（8-15）µm×（3-6）µm;菌丝附着胞褐色,棍棒状,不规则状,有分枝,（8-10.5）µm×（6.5-8）µm;分生孢子附着胞未见。C. fructicola在PDA培养基上生长速率平均6.76 mm·d^-1,菌落正面白色,背面中央褐色,边缘白色,气生菌丝致密,绒毛状;菌核、刚毛未见;分生孢子梗透明,有隔,具分枝,产孢细胞圆柱状,7-18 µm,顶端直径1-2 µm;分生孢子透明,圆柱状,两端钝圆,部分中部溢缩,（10-15）µm×（3-3.5）µm;菌丝附着胞深褐色,圆形,近圆形,不规则形,有分枝,（6.5-8）µm×（3.5-5.5）µm;分生孢子附着胞褐色或深褐色,圆形,（5-7）µm×（5-6.5）µm。C. siamense在PDA培养基上生长速率平均7.6 mm·d^-1,菌落白色,气生菌丝致密,绒毛状;菌核、刚毛未见;分生孢子梗透明,有隔,具分枝;产孢细胞圆柱状,8-16 µm,顶端直径1-2 µm;分生孢子透明,圆柱形,梭形,两端钝圆,部分中部有溢缩,（9.5-13.5）µm×（3-3.5）µm;菌丝附着胞深褐色,球形,棒状,不规则形,（5-8）µm×（3-5.5）µm。致病性测试结果表明,C. camelliae能侵染龙井43品种茶树有伤叶片,但对龙井43无伤叶片和中茶108有伤、无伤叶片无致病性,而C. fructicola和C. siamense 2个种对2个品种茶树有伤、无伤叶片均无致病性。【结论】基于系统发育学和形态学结合的方法对中国15省（市、自治区）部分茶区茶树病叶病原菌鉴定,基本明确C. camelliae为中国茶树炭疽菌优势种。     

顶果木灰霉病病原鉴定

【目的】对顶果木灰霉病病原菌进行鉴定,以明确其分类地位,为顶果木灰霉病的防控提供参考依据。【方法】从广西南宁市良凤江国家森林公园苗圃基地采集顶果木灰霉病病害标本,对病害进行症状描述、组织分离和致病性测定,观察致病菌的形态学特征并进行r DNA-ITS序列分析。【结果】分离获得顶果木灰霉病致病菌代表菌株DGM5-6。DGM5-6菌株在PDA上长势良好,毛绒状菌落初期呈淡黄白色,后期逐渐变为灰白色;气生菌丝呈放射状生长,开始为白色,生长后期为灰色;病菌分生孢子梗单生,灰色至褐色,分枝,顶端膨大成球形,其上有多个小梗,梗上聚生卵形、圆形或椭圆形的分生孢子;分生孢子呈浅灰色至无色,单胞,大小为10.0-12.5μm×7.5-10.0μm。DGM5-6菌株ITS基因扩增片段长度为535 bp,其r DNA-ITS序列与Gen Bank中灰葡萄孢（Botrytis cinerea Pers.ex Fr）序列的同源性达99%。【结论】引起广西顶果木灰霉病的病原为灰葡萄孢（Botrytis cinerea Pers.ex Fr）,该病原菌寄主范围广,应结合苗圃清园、圃地治理、合理密植、生物防治和化学防治等进行防控。     

三重PCR检测草莓灰霉病菌、炭疽病菌和黄萎病菌

【目的】探索和优化检测条件,建立同时检测草莓灰霉病菌Botrytiscinerea,炭疽病菌Colletotrichum gloeosporioides和黄萎病菌Verticillium dahliae的三重PCR检测体系,为3种病害的早期快速诊断和鉴定提供技术和方法。【方法】选择可以组合的3种病原菌特异引物,研究多重PCR的影响因素,优化PCR退火温度,采用正交试验方法,以3个引物组、TaqDNA聚合酶、dNTP和Mg2+六因素三水平优化多重PCR体系。【结果】建立并验证适合上述草莓主要病原菌的三重PCR最佳检测体系,可分别扩增出729、539和450bp的特异条带,最适退火温度为50℃,25μL的反应体系中含有0.32μmol·L-1C729+/-、0.032μmol·L-1DB19/DB22、0.32μmol·L-1CgInt/ITS4、1.5UTaq聚合酶、0.15mmol·L-1dNTP、1.6mmol·L-1MgCl2。【结论】利用上述引物组合和反应体系进行三重PCR检测,能够快速从田间发病植株和土壤中将草莓灰霉病菌、草莓炭疽病菌和草莓黄萎病菌检测出来,灵敏度可以达到10pg菌丝DNA。     

假禾谷镰孢转录因子FpAPSES的鉴定与功能分析

【目的】假禾谷镰孢（Fusarium pseudograminearum）侵染小麦引起的小麦茎基腐病严重影响中国小麦的安全生产。查找假禾谷镰孢中的APSES转录因子,分析其在病原菌致病过程中的作用,为解析假禾谷镰孢的致病机制及小麦茎基腐病的防治提供理论依据。【方法】从GenBank获得物种中已知的APSES氨基酸序列,利用BLASTP方法在假禾谷镰孢中查找APSES同源蛋白,利用Pfam软件预测蛋白结构域,采用MEGA5.05构建APSES蛋白的系统进化树。利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）方法分析A组APSES转录因子基因FpAPSES1和FpAPSES4在假禾谷镰孢侵染过程中的表达。通过PEG介导的原生质体转化和PCR筛选FpAPSES1和FpAPSES4基因缺失的突变体菌株。在PDA培养基上测定假禾谷镰孢野生型菌株Wz2-8A、Δfpapses1和Δfpapses4突变体菌株的菌丝形态和生长速率;测定在CMC培养液中培养后的分生孢子产生情况、形态以及在无菌水中的萌发率;利用菌丝块和分生孢子接种小麦胚芽鞘和大麦叶片以及盆栽试验测定其致病性;采用ELISA方法测定小米培养基中脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）的含量。【结果】假禾谷镰孢中有4个APSES同源蛋白,均含有保守的DNA结合结构域HTH。与其他物种的APSES蛋白构建系统进化树,发现FpAPSES1、FpAPSES2和FpAPSES4属于A组APSES,FpAPSES3分布在C组。FpAPSES1和FpAPSES4在侵染阶段诱导表达,推测可能参与假禾谷镰孢的致病。分别获得2个FpAPSES1和FpAPSES4基因缺失的突变体菌株Δfpapses1-T10、Δfpapses1-T27和Δfpapses4-T1、Δfpapses4-T2。表型测定结果显示,与野生型相比,FpAPSES1和FpAPSES4基因缺失突变体在PDA平板上的生长速率明显减慢、色素积累明显增多;FpAPSES1基因缺失突变体菌丝形态无差异,而FpAPSES4基因缺失突变体菌丝弯曲、分支明显增多;FpAPSES1和FpAPSES4基因缺失突变体在CMC液体中的分生孢子产生明显减少,分别比野生型下降了99.5%和97.4%,产生的分生孢子变短、隔膜减少、萌发率有所降低;与野生型相比,FpAPSES1和FpAPSES4基因缺失突变体菌丝体和分生孢子对小麦胚芽鞘的致病力明显降低,菌丝在小麦胚芽鞘表皮细胞中的扩展明显受阻;FpAPSES1和FpAPSES4基因缺失突变体对大麦叶片和小麦根部的致病力也明显降低;FpAPSES1和FpAPSES4基因缺失突变体在小米培养基中产生的DON毒素分别比野生型下降了约78%和44%。【结论】编码A组APSES同源蛋白的FpAPSES1和FpAPSES4对假禾谷镰孢的菌丝生长、分生孢子产生和致病力均具有重要作用。     

宁夏苦豆子中产苦参碱内生真菌的分离与鉴定

【目的】从宁夏野生苦豆子中分离内生真菌,筛选能够产生苦参碱、氧化苦参碱、氧化槐果碱或槐定碱4种喹诺里西啶类生物碱的内生真菌。【方法】应用光学显微镜和扫描电子显微镜对分离菌株显微形态进行观察,根据形态对各菌株进行初步分类;应用薄层色谱法、气相色谱-质谱联用法和酸性染料比色法检测各分离菌株的生物碱成分。对能够产生生物碱的真菌ITS和SSU rDNA序列进行扩增和测序,根据序列信息进行同源性比较和系统发育树构建;结合形态特征,对其进行种属分类。【结果】从苦豆子中共分离到27株真菌,其中23株分属于青霉属、曲霉属、链格孢属、镰刀菌属、Simplicillium属真菌,4株为不产孢菌;筛选出E1、E3和E5这3株能够产生苦参碱的内生真菌,均属于Simplicillium属真菌,其菌丝中苦参碱的含量分别为20.4、17.4和37.6 μg•g-1。【结论】根据真菌形态特征、同源性比较和遗传进化分析结果,确定该3株产苦参碱内生真菌均为Simplicillium lanosoniveum。     

一种来源于葡萄叶片的真菌(Quambalaria cyanescens)的鉴定及培养特性

【目的】研究一株来源于新疆吐鲁番市葡萄病叶上真菌的种类及分类地位。【方法】观察菌株的培养性状,测量初生分生孢子和次生分生孢子的大小,基于ITS、LSU基因片段采用最大简约法、最大似然法和贝叶斯法构建系统发育树;将该纯化菌株活化培养至不同培养基种类、光照条件、pH值和培养温度等4个因素的不同水平下培养,混合正交试验,分析最适生长条件。【结果】培养基种类、光照条件、pH值和培养温度等4个因素的交互作用对菌株Pt4-1菌落生长具有显著影响,菌株Pt4-1在PDA、SDA培养基上较CMA培养基生长更快,菌株在 SDA培养基、半光照、pH5、温度25 ℃条件下的生长速率最大,平均生长速率为2.29 cm/d;菌株Pt4-1在CMA培养基、半光照、pH 5、温度25 ℃条件下的生长速率最小,平均生长速率为0.55 cm/d。【结论】菌株Pt4-1为蓝色刺孢霉Quambalaria cyanescens;菌株Pt4-1在不同培养条件下菌落形态不同,在PDA、SDA培养基上生长良好,可分泌紫色色素,在CMA培养基上生长但不分泌色素;随着培养温度的升高,色素分泌减少。     

豌豆镰孢根腐病菌的鉴定及其致病基因多样性

【目的】明确中国不同地区豌豆镰孢根腐病菌的种类及其致病基因多样性,为病害防治及抗病育种提供依据。【方法】通过形态学观察、致病性测定和特异性分子标记检测对病原菌分离物进行鉴定,通过茄镰孢豌豆专化型（Fusarium solani f. sp. pisi）致病基因特异性PCR引物对病原菌分离物致病基因进行检测。【结果】96个病原菌分离物鉴定为茄镰孢豌豆专化型。致病性测定表明所有分离物对豌豆品种“草原27”致病,其中81.3%的分离物致病力强,10.4%的分离物致病力中等,只有8.3%的分离物具弱致病力。用4个致病基因PDA、PEP1、PEP3和PEP5 特异性引物对分离物基因组DNA进行PCR扩增,在96个分离物中共检测到10种基因组合（基因型）,其中含有4个基因组合和3个基因组合的分离物约占91%,这些分离物绝大多数具有强致病力（87.4%）或中等致病力（9.2%）,而检测不到PDA的分离物基本上都是弱致病力类型,表明致病基因的种类和数量与茄镰孢豌豆专化型的致病力水平有关。【结论】茄镰孢豌豆专化型是引起中国豌豆根腐病的主要病原菌,豌豆主产区大多数分离物致病力强。     

链格孢菌苹果致病型的ATMT转化体系的建立

【目的】链格孢菌（Alternaria alternate）苹果致病型是苹果上的重要致病菌,可以侵染苹果叶片和果实。论文旨在建立农杆菌介导的链格孢菌苹果致病型高效稳定的分子转化体系,为在分子水平上研究链格孢苹果致病型病菌的致病机制提供技术支持。【方法】质粒pKO1-HPH是以pCAMBIA1300骨架为基础构建的穿梭质粒,含有潮霉素抗性基因,并在其多克隆位点上插入了绿色荧光蛋白基因,这个质粒在大肠杆菌和农杆菌细胞中都能够稳定地复制繁殖。将质粒pKO1-HPH采用冻融法转化到农杆菌菌株AGL1中,然后与链格孢苹果致病型菌株XP-1的分生孢子在诱导培养基上共培养进行基因转化,转化子在含有潮霉素的马铃薯-葡萄糖-琼脂培养基上进行筛选;在含有50 μg·mL^-1潮霉素的马铃薯-葡萄糖-琼脂培养基上检测转化子细胞中抗性基因在转化子中的表达情况;用荧光显微镜检测绿色荧光蛋白基因在转化子细胞中的表达情况。在初步确认可以将绿色荧光蛋白和潮霉素B磷酸转移酶基因转入链格孢苹果致病型菌株中后,对菌落培养时间、转化前分生孢子的预处理方法对转化效率的影响进一步优化。转化子的稳定性采用分生孢子5次继代培养后,能否在含有潮霉素的马铃薯-葡萄糖-琼脂培养基上稳定生长来检测;采用PCR方法检测绿色荧光蛋白外源基因和潮霉素B磷酸转移酶基因是否存在于转化子基因组中;用Southern杂交检测外源基因在转化子基因组中插入的拷贝数;在苹果果实和叶片上接种检测转化子致病性的变化。【结果】将100 μL孢子悬浮液（含10⁵孢子）涂布于马铃薯-胡萝卜-琼脂平板上菌落培养36-48 h后,链格孢苹果致病型菌株XP-1可以产生足量的孢子用于农杆菌介导的分子转化。将分生孢子用无菌水洗下,在4℃处理6 h,再与含质粒pKO1-HPH的农杆菌进行诱导共培养,转化子在含有50 μg·mL^-1潮霉素的马铃薯-葡萄糖-琼脂培养基上进行筛选,转化效率较好,10⁷个分生孢子转化可获得约200个转化子。转化子经过5次继代培养,对潮霉素B的抗性没有改变。特异性引物PCR检测表明外源基因能够成功地整合到供试菌株的基因组中;Southern杂交表明外源基因多以单拷贝形式随机插入到链格孢苹果致病型菌株XP-1细胞的基因组中;转化子的菌丝和分生孢子在荧光显微镜下可以观察到明显的绿色荧光,说明荧光蛋白基因在菌丝及孢子中均能够成功表达。通过部分转化子的致病性试验,筛选获得数个在苹果果实和叶片上致病性都显著降低的菌株。【结论】建立了农杆菌介导的链格孢菌苹果致病型稳定高效的分子转化体系,为进一步开展此病菌与其寄主的分子互作研究打下基础。