进境棉籽中棉花枯萎病菌的检疫鉴定和监控策略

对从澳大利亚进境的多批棉籽进行了病原菌分离,纯化培养后得到3株疑似棉花枯萎病菌的菌株FOV-093、FOV-130和FOV-245。形态学观察表明:菌株FOV-093、FOV-130和FOV-245均产生典型的棉花枯萎病菌大型分生孢子和小型分生孢子,前者呈镰状或椭圆形弯曲,后者呈假头状着生,多数为单孢,卵圆形;用通用引物ITS4/ITS5和特异引物FOV-F/R扩增,分别获得518 bp和354 bp的DNA片段,测序后通过BLAST比对表明,其与GenBank中Fusarium oxysporum f.sp.vasinfectum序列同源性为100%,;致病性测定表明:3个菌株均可侵染棉花并致其萎蔫死亡。根据上述试验结果,将分离获得的菌株FOV-093、FOV-130和FOV-245鉴定为棉花枯萎病菌Fusarium oxysporum f.sp.vasinfectum。加强进境棉籽的检疫和病害监控,是防止该真菌扩散和传播的有效方法。     

柱花草炭疽病菌的准确快速鉴定

采用常规组织分离法分离得到2个柱花草炭疽病菌致病性菌株,利用ITS通用引物ITS1／ITS4对炭疽菌rDNA—ITS进行扩增,电泳检测得到约500bp大小的目的条带,经过生物信息学分析2个菌株均为刺盘孢属胶胞炭疽病菌,且两者之间同源性达到99％,对其侵染能力进行检测,5个柱花草品系的抗病性有所不同。     

砀山梨炭疽病病原鉴定及其抑菌药剂筛选

【目的】明确近年来严重危害砀山梨的炭疽病病原菌种类,研究常用杀菌剂对致病菌菌丝生长、分生孢子萌发的抑制作用。【方法】对6个取自不同梨品种上的病果、病叶样本分别进行发病组织培养、单孢分离纯化,根据病原菌的形态特征和致病性,并结合其rDNA-ITS序列分析,进行病原菌种类鉴定。采用常用杀菌剂分别对病原菌菌丝和分生孢子进行处理,观测其化学抑制效果。【结果】从不同病斑上分离出了6个纯化菌株,其形态特征相同,且与已报道的炭疽病菌(Colletotrichum spp.)形态特征相似;用上述纯培养菌株接种于健康果实和叶片上,又引起与田间原标本相同的病害症状;通过病原菌rDNA-ITS克隆测序、BLASTn比对分析,6个菌株为同一致病菌,且该致病菌与台湾枣(Taiwan jujube)炭疽菌株(Colletotrichum sp.EXMQ-1;登录号FJ233185)、日本超市水果(Japanese fruit)炭疽菌株(Glomerella cingulata;登录号AB219012)和凤梨草莓(Fragaria ananassa)炭疽菌株(C.gloeosporioides;登录号EU200455)的rDNA-ITS序列一致;430g·L-1戊唑醇水悬浮剂等7种杀菌剂对病原菌菌丝生长抑制率达100%;70%代森锰锌可湿性粉剂等8种药剂处理,病原菌分生孢子萌发率为0。【结论】危害砀山梨的炭疽病病原菌为半知菌亚门刺盘孢属的胶胞炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides),其有性阶段为围小丛壳(Glomerella cingulata)。常用药剂对该菌菌丝和分生孢子的抑制作用存在着显著的差异。     

木薯炭疽病病原鉴定及其生物学特性研究

[目的]分离鉴定木薯炭疽病菌,并进行生物学特性研究。[方法]从我国海南木薯发病叶片上分离到2株木薯炭疽病菌CCGHN01和CCGHN03,通过分生孢子形态观察和ITS序列分析进行鉴定,并进行生物学特性研究。[结果]分生孢子形态观察和ITS序列分析表明2株病原菌为胶孢炭疽菌。生物学特性研究表明,2个菌株生长最适培养基为PSA,最适温度分别是26和30℃,最适pH值为8.0,最适光照条件分别是光暗交替和完全黑暗。2个菌株孢子萌发最适温度分别是28和30℃,致死温度为55℃10min。[结论]该研究为进一步防治木薯炭疽病提供了基础。     

茶树炭疽病病原菌的分离与鉴定

为茶炭疽病的快速诊断及防治提供理论依据,采用常规组织分离、伤口回接法对比感病症状,并通过形态学特征结合多基因系统发育分析方法,探究遵义银柜山茶区福鼎大白茶炭疽病病原菌的种类及致病力。结果表明:分离得到茶树炭疽病菌株1株(ygs03-1),该菌株在PDA平板上25℃黑暗条件下培养,菌落正面呈白色或灰白色海绵状隆起,背面黑褐色;气生菌丝发达,透明有隔;分生孢子梗透明、有隔膜;产孢细胞透明,圆柱形或椭圆形;分生孢子长椭圆或椭圆形,少部分为花生形;分生孢子附着孢圆形或不规则形,边缘呈黑色。ygs03-1可通过伤口侵染茶树叶片,且病症与采集病样病症相似。经系统进化树聚类分析,分离菌株ygs03-1和Colletotrichum camelliae聚为一类,相似度达97%。结合该菌株的形态特征与分子鉴定结果,确定菌株ygs03-1为刺盘孢炭疽菌(Colletotrichum camelliae)。     

节瓜炭疽病菌对嘧菌酯的敏感性及其交互抗性

为了对海南瓜类蔬菜炭疽病菌的抗性监测研究及抗性治理提供理论依据,对海南不同市县采集的节瓜炭疽病病样中分离纯化的90株炭疽病原菌进行了检测,采用菌丝生长速率法测定2种病原菌对嘧菌酯的敏感性。结果表明:经分生孢子形态鉴定节瓜炭疽病有胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)和尖孢炭疽菌(C.acutatum),胶孢炭疽菌为优势种群,占84.4%;2种病原菌对嘧菌酯的EC50在0.334 4~36.467 0μg/mL,平均为12.954 4μg/mL,敏感性分布接近于正态分布,EC50值之间表现较连续,故以平均EC50值为敏感性基线,用于节瓜炭疽病菌对嘧菌酯的田间抗药性监测。嘧菌酯与多菌灵、福美双、丙环唑和咪鲜胺不存在交互抗性。     

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为了对海南瓜类蔬菜炭疽病菌的抗性监测研究及抗性治理提供理论依据,对海南不同市县采集的节瓜炭疽病病样中分离纯化的90株炭疽病原菌进行了检测,采用菌丝生长速率法测定2种病原菌对嘧菌酯的敏感性.结果表明:经分生孢子形态鉴定节瓜炭疽病有胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)和尖孢炭疽菌(C.acutatum),胶孢炭疽菌为优势种群,占84.4％;2种病原菌对嘧菌酯的EC50在0.334 4～36.467 0μg/mL,平均为12.954 4μg/mL,敏感性分布接近于正态分布,EC50值之间表现较连续,故以平均EC50值为敏感性基线,用于节瓜炭疽病菌对嘧菌酯的田间抗药性监测.嘧菌酯与多菌灵、福美双、丙环唑和咪鲜胺不存在交互抗性.     

贺州荸荠秆枯病病原鉴定及其侵染过程

[目的]对广西贺州市荸荠种植区感染秆枯病的荸荠样本进行病原分离鉴定及分析病原菌的侵染过程,为荸荠秆枯病的有效防治提供参考。[方法]以常规组织分离法对发病明显的荸荠茎秆组织进行分离,采用传统的形态学对病原菌进行鉴定。通过制备分生孢子悬浮液接种于载玻片上培养,测定分生孢子萌发情况。利用病菌孢子悬浮液对荸荠茎秆进行离体接种,检测病菌的侵染过程。[结果]分离获得1株病原分离物(Ceh),经形态学鉴定该病原为荸荠柱盘孢菌(Cylindrosporium eleocharidis Lentz)。病菌分生孢子接种于载玻片后4 h开始萌发,8 h后大量萌发,12 h后形成大量附着孢,菌丝24 h后形成。病菌接种荸荠茎秆4 h后,分生孢子开始萌发并产生芽管;8～12 h芽管伸长,形成附着孢侵入荸荠茎秆表皮组织;24 h至7 d菌丝形成;接种8 d后,病菌在茎秆表面形成分生孢子盘。[结论]引起广西贺州市荸荠种植区荸荠秆枯病病原为荸荠柱盘孢菌(Cylindrosporium eleocharidis Lentz)。荸荠秆枯病菌分生孢子萌发和侵染过程可用于病原菌和寄主互作机理研究。     

6种杀菌剂对2种草莓炭疽病菌室内毒力测定

从江苏省南京地区草莓病株上分离的2株炭疽病致病菌,经多基因系统发育分析,确定为胶孢炭疽复合种中的暹罗炭疽菌和果生刺盘孢。为筛选有效防治草莓炭疽病药剂,测定了6种杀菌剂对这2个菌株菌丝生长和分生孢子萌发的抑制活性。结果表明,不同杀菌剂对2种炭疽病菌的抑制效果不同,各杀菌剂在试验浓度下对2种菌的菌丝生长和分生孢子萌发均有不同程度地抑制作用,相对抑制率与药剂浓度呈正相关。根据对病原菌菌丝生长和分生孢子萌发抑制效果的综合表现,75%肟菌·戊唑醇和10%苯醚甲环唑的EC₅₀值在供试药剂中是相对较小的,在推荐使用浓度下对2种病菌相对抑制率均可达80%以上,可作为南京地区草莓炭疽病防治候选药剂。     

蓝莓炭疽病病原菌鉴定及致病性测定

【目的】鉴定辽宁省部分地区疑似炭疽病的蓝莓病株的病原,为蓝莓病害的防控及抗病育种提供依据。【方法】对采自辽宁省兴城市和庄河市的疑似炭疽病的蓝莓发病枝条及叶片进行组织分离、培养,从所分离获得的两类菌株中选择形态学不同的代表菌株LNSW1和B-Cg1进行后续试验和分析。观察两个代表分离菌株在马铃薯葡萄糖琼脂培养基（potato dextrose agar,PDA）上的菌落及分生孢子的形态特征。对代表菌株LNSW1和B-Cg1的真菌核糖体基因进行PCR扩增和测序,采用Mega5.1软件中邻位加入法（neighbor-joining,NJ）进行基于病原菌rDNA-ITS基因序列和GenBank中已有相关炭疽菌序列的系统发育树构建。利用尖孢炭疽菌（Colletotrichum acutatum）和胶孢炭疽菌（C. gloeosporioides）的特异性引物对CgInt2/ITS4和CgInt/ITS4对代表菌株进行特异性扩增,采用菌丝块叶片接种法对8个蓝莓品种进行代表分离菌株的致病性测定。【结果】从辽宁省部分蓝莓产区罹病植株上共分离纯化得到36个菌株,根据各菌株的形态学差异将其分成两个类别,两类别中代表菌株LNSW1和B-Cg1在菌落颜色及分生孢子形态上具有较大差异,且与已报道的炭疽菌属当中的尖孢炭疽菌和胶孢炭疽菌形态特征相似;两个代表分离株的rDNA-ITS序列实际长度为557和547 bp,通过基于真菌核糖体基因的系统发育分析,表明菌株LNSW1与GenBank中尖孢炭疽菌菌株AB729126、KF698729、EU886755聚在同一分支,B-Cg1与胶孢炭疽菌菌株JF923828、KF516931、GU174547聚在同一分支,相似度分别为99%-100%;两对炭疽菌特异性引物扩增结果再次证明所获代表菌株分别为尖孢炭疽菌和胶孢炭疽菌; 致病性测定结果表明,尖孢炭疽菌和胶孢炭疽菌菌丝块接种8个蓝莓品种的叶片及枝条均可致病,两类病菌回接症状与田间自然发病症状较为相似,尖孢炭疽菌对蓝莓的致病稍强于胶孢炭疽菌。【结论】通过对辽宁省蓝莓主产区的蓝莓发病枝条及叶片的病原菌进行形态学和分子学鉴定,基本明确辽宁省部分地区的蓝莓炭疽病是由尖孢炭疽菌和胶孢炭疽菌侵染所致。     

农杆菌介导苹果炭疽病菌的遗传转化及转化子鉴定

【目的】优化农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导转化苹果炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）的技术体系,并对转化子进行筛选鉴定,比较其生物学特性和致病性差异。【方法】以苹果炭疽病菌LXS010101分生孢子为转化受体,利用携带重组双元载体的农杆菌进行转化;对获得的转化子进行遗传稳定性测定、PCR检测及Southern blot分析;选取一定数量的转化子,比较其菌落形态、生长速率及分生孢子发育等主要生物学性状及致病性的差异。【结果】苹果炭疽病菌的最优转化体系为：病菌分生孢子悬浮液浓度1×105个/mL,共培养温度和时间分别为22℃和24 h,共培养基中添加200 μmol•mL-1乙酰丁香酮,其转化效率达到1×105个孢子可获得439个转化子。随机选取30个转化子进行鉴定,发现T-DNA已整合进炭疽病菌基因组中,在所检测的转化子中都是以单拷贝的形式整合,且能够稳定遗传。与野生型菌株相比,转化子的菌落形态没有发生明显变化,但23.33%的菌株生长速率显著减低;转化子ATJ-3和ATJ-15不能产生分生孢子,在28个产孢菌株中,分生孢子萌发率显著减低的菌株占39.29%,附着胞形成比例显著减低和形态异常的菌株占25.00%。致病性测定结果显示,11个转化子的致病力显著降低,其中菌株ATJ-19完全丧失致病能力。【结论】优化的苹果炭疽病菌遗传转化技术体系,可用于炭疽病菌致病相关基因的克隆及致病分子机理的研究。     

锥栗炭疽病的研究 Ⅰ.病原的确定及其生物学特性

通过分离培养,人工接种和病原鉴定,证实锥栗炭疽病是由围小丛壳菌[Glomerellacingulata(Stonem.)Spauld.etSchrenk]侵染所致,其无性世代为胶孢炭疽菌(ColletotrichumgloeosporioidesPenz).病原菌菌落在PDA加锥栗叶煎汁培养基上生长较好.菌丝生长最适温度为25～30℃,最适pH值为6.0.pH3～11均能产生分生孢子,pH8.5时产生分生孢子的能力最强.在自由水条件下分生孢子才有较高的萌发率(39.2%).分生孢子萌发pH值范围为2～10,最佳为6.5;锥栗叶煎汁培养基对孢子萌发有明显的促进作用.     

油茶林土壤放线菌的分离及其拮抗油茶炭疽病菌的筛选

从油茶林不同类型土样中分离到85株放线菌,采用PDA培养基和甲壳素脱乙酰酶培养基进行筛选。结果表明,以油茶炭疽病菌为指示菌,用对峙培养法选出抑菌带宽度达15 mm以上的菌株18株,菌株CF17拮抗效果最明显;CF17对油茶根腐病菌、油茶叶枯病菌等供试病原真菌也有较好抑菌效果,对各供试病原真菌的抑菌带宽度达14 mm以上;CF18、CF33和CF48菌株能产生甲壳素脱乙酰酶。     

樟树、柑橘、冬青卫矛炭疽病病原学比较研究

采用组织分离法,对樟树(C innam omum camphora)、冬青卫矛(E uonymus japon icus)、柑橘(C itrus reticu lata)3个树种炭疽病进行病原分离,经纯化培养,在此基础上进行寄主接种试验。结果表明,3种炭疽病的病原均为炭疽菌属的胶孢炭疽菌(Colletotrichum g loesporioid es)。3个炭疽菌的分生孢子萌发、附着孢的形态学特征以及纯化培养的菌落均存在一定的差异。致病性测定结果显示,3个菌种分别对同一寄主的致病性存在一定的差异。     

一种从土壤中筛选植物病原真菌拮抗细菌的新方法初步研究

以微孔滤膜为核心手段,研究采用滤膜空斑法从土壤中筛选芒果炭疽病菌拮抗细菌的可行性。结果使用该方法从土壤中筛选到9个对芒果炭疽病菌有疑似拮抗作用的细菌,经试验确认其中2个菌株对芒果炭疽病菌具有良好的拮抗作用。表明从滤膜空斑中确实可以挑取到对芒果炭疽病菌具有抑制效果的细菌分离物,证明用滤膜空斑法从土壤筛选抑制芒果炭疽病菌菌丝生长的细菌是可行的。     

浙江省草莓炭疽病菌鉴定及生物学特性研究

对分离自浙江各地的草莓炭疽病菌进行形态特征、培养性状等生物学特性研究并测定ITS序列,结果表明：浙江各地引起草莓炭疽病的优势菌株为Colletotrichum gloeosporioides,该病原菌最适在PDA和PSA培养基上生长,菌丝生长和孢子萌发的最适温度为25～30℃,培养基的最适pH值为6.0～7.0,但孢子在pH值6.0时萌发率最高。以蔗糖和果糖为碳源,硝酸钾为氮源时生长速率最快。     

草莓根腐病拮抗细菌的分离筛选与鉴定

为筛选和鉴定草莓根际土壤中对草莓根腐病菌(Colletotrichum gloeosporioides)有拮抗作用的细菌,采用平板对峙培养法,对从北京市昌平区小汤山草莓种植基地土样中分离到的306株菌株进行初筛,复筛后获得了1株拮抗效果好且具有较好稳定性的菌株GF-98,其抑菌带宽度为9.3 mm。此外,菌株GF-98的抑菌谱较广,对草莓根腐尖孢镰刀病菌、草莓灰霉病菌、草莓根腐石楠拟盘多毛孢病菌等9种植物病原真菌均有较好的抑菌效果。在显微镜下观察发现,菌株GF-98的代谢产物对草莓根腐病菌有致畸作用,包括菌丝缩短、粗细不均、分枝增多扭曲、细胞原生质浓缩等现象。16S rDNA基因分析以及生理生化鉴定等方法表明,菌株GF-98为多粘类芽孢杆菌(Peanibacillus ploymyxa)。     

草莓根颈腐烂病的病原鉴定

【目的】明确草莓根颈腐烂病的病原,为草莓根颈腐烂病的防治及抗病育种提供依据。【方法】对取自湖北省武汉市的发病草莓植株分别进行发病组织培养、分离纯化。采用牙签根颈接种方法进行致病性测定;观察病原微生物在马铃薯葡萄糖琼脂培养基（potato dextrose agar,PDA）上的菌落形态;从所分离到的菌株中选择PDA培养基平板上形态不同的Zhd-3、Zhd-4-1和Zhd-5进行后续试验和分析。测定各菌株在18℃黑暗条件下的菌丝生长速度,然后用方差分析程序（ANOVA）对不同菌株间的差异显著性进行分析;采用光学显微镜和扫描电子显微镜对病原菌在草莓叶柄上产生的分生孢子形态进行分析。分别以Zhd-3、Zhd-4-1和Zhd-5的基因组DNA为模板对这3个菌株的部分肌动蛋白基因（Actin,ACT）、β-维管蛋白基因（β-Tubulin 2,TUB2）和钙调蛋白基因（Calmodulin, CAL）进行PCR扩增,并将PCR产物测序。将Zhd-3、Zhd-4-1和Zhd-5与胶孢炭疽复合种内全部23个种的代表性菌株一起进行系统进化分析。采用Mega4.1软件和邻接法进行基于病原菌ACT、TUB2和CAL序列的多基因位点系统进化分析。【结果】从武汉市郊发病草莓植株上共分离纯化到15个菌株,不同菌株在PDA培养基平板上的正面形态没有显著差异,但是背面形态却明显不同,根据各菌株的PDA平板背面形态将15个菌株分成3组,分别从每组中选择Zhd-3、Zhd-4-1和Zhd-5进行后续形态学鉴定和系统进化分析。3个菌株在采用牙签接种法接种草莓根颈时均能使草莓植株发病;使用这3个菌株接种草莓叶柄时均能在病斑处产生分生孢子,但分生孢子形态没有显著差异;20个分生孢子的平均大小为11 μm×3.8 μm;3个菌株在18℃黑暗条件下的菌丝生长速度分别为0.82、0.68和0.88 cm?d-1;这些生物学特征表明这些菌株属于胶孢炭疽复合种。通过基于ACT、TUB2和CAL的多基因系统进化分析结果表明菌株Zhd-3、Zhd-4-1和Zhd-5与已鉴定为Colletotrichum siamense的菌株ICMP12567、ICMP17795、ICMP18121、CBS113199和CBS112983归在1个分支,其自展支持率为84%,能够与胶孢炭疽复合种内的其他物种区分开。【结论】通过对草莓根颈腐烂病菌的生物学特性、柯赫氏法则证病过程及基于ACT、TUB2和CAL的多基因系统进化分析,明确了引起武汉地区草莓根颈腐烂病的病原为胶孢炭疽菌复合种内的C. siamense。     

陕、豫两省苹果炭疽病病原鉴定

 【目的】确定引起中国陕、豫两省苹果炭疽病的病原菌种类。【方法】对病原菌进行分离、纯化、致病性测定以及形态学鉴定、rDNA ITS区序列分析、rDNA ITS区特异引物CaInt2/ITS4扩增。【结果】自陕西、河南11个地点采集192份样本,经鉴定引起陕、豫两省苹果炭疽病的病原菌有2种,胶孢炭疽菌[Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Sacc.]和尖孢炭疽菌(C. acutatum J.H. Simmonds)。两种病原菌的区别主要在于分生孢子形态、菌落颜色、对引物CaInt2的特异性等。【结论】首次证实了中国苹果炭疽病可由尖孢炭疽菌(C. acutatum)引起。两种病原菌在陕、豫两省各地区均有分布,其中,胶孢炭疽菌(C. gloeosporioides)所占比例较高。     

5种入侵植物提取物对2种芒果病原真菌的抑制作用

以马缨丹(Lantana camara Linn.)、薇甘菊(Mikania micrantha Kunth.)、含羞草(Mimosa pudica Linn.)、假臭草(Praxelis clematidea Cassini.)和三裂叶蟛蜞菊(Wedelia trilobata(L.)Hitchc.)为材料,采用菌丝生长速率法研究这5种入侵植物乙醇提取物对芒果炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides和蒂腐菌Botryodiplodia theobromae Pat的抑菌活性,并利用气相色谱-质谱(GC-MS)联用技术分析假臭草的主要抑菌物质。菌丝生长速率法的实验结果表明:5种入侵植物提取液对2种病原真菌均具有抑菌活性,且抑菌效果随浓度的增加而增强;其中马缨丹提取物对蒂腐菌抑制效果最好,其EC50为10.39 g·L~(-1),假臭草提取液对炭疽菌和蒂腐菌均有较强的抑菌效果,EC_(50)分别为14.70 g·L~(-1)和14.77 g·L~(-1)。采用气相色谱-质谱(GC-MS)联用法分析鉴定了假臭草提取物中的14种化学成分,其中4,5,6,7-四甲氧基黄酮、熊果苷和1,2,4-环己三醇这3种物质占总含量的81.85%。