bta-miR-34b/c和bta-miR-449a/b/c靶基因预测及生物信息学分析

【目的】试验旨在对bta-miR-34b/c和bta-miR-449a/b/c的序列保守性、转录因子和靶基因进行生物信息学预测和分析,探究其影响精子发生的作用机制,为研究其生物学功能及作用机制提供指导和思路。【方法】利用miRBase数据库获取不同物种的bta-miR-34b/c和bta-miR-449a/b/c序列并进行相似性分析;通过TargetScan、miRWalk、miRDB等方法预测bta-miR-34b/c和bta-miR-449a/b/c的靶基因,对获得的靶基因集合分别进行GO功能和KEGG通路富集分析;通过AnimalTFDB获取共同调控bta-miR-34b/c和bta-miR-449a/b/c的转录因子,并构建TF-miRNA-mRNA作用网络。【结果】bta-miR-34b/c和bta-miR-449a/b/c在不同物种间高度保守。预测得到2个转录因子和49个候选靶基因,这些靶基因主要富集在精子发生、钙离子依赖性胞吐的调节、胰岛素分泌的调节等GO条目,以及HIF-1信号通路、甲状腺激素信号通路、Wnt信号通路等KEGG通路。bta-miR-34b/c、bta-miR-449a/b/c与上游转录因子NR2C2和HIC1,下游靶基因AXL、E2F3、DAAM1等共同构成的作用网络通过调控减数分裂、细胞周期、细胞凋亡、精子细胞能量代谢等生物过程影响精子发生。【结论】bta-miR-34b/c、bta-miR-449a/b/c通过上游转录因子和下游靶基因组成的分子调控网络共同调节精子发生过程。     

鸡miR-10b-5p生物信息学及组织表达分析

【目的】 通过对苏禽3号肉鸡的miR-10b-5p进行靶基因预测、生物信息学分析及其在鸡不同生长时期组织表达变化规律研究,探索其在鸡肌肉生长发育中作用。【方法】 通过文献和miRBase检索脊椎动物的miR-10b-5p序列,利用Ensembl数据库查询并确定miR-10b-5p在基因组中的位置,根据前体序列构建系统进化树;使用miRDB、microT和TargetScan网站预测miR-10b-5p靶基因,并对靶基因进行GO功能和KEGG通路分析,进而揭示miR-10b-5p的基因功能。采用实时荧光定量PCR技术检测不同生长时期鸡miR-10b-5p组织表达量,探索其在大脑、小脑、垂体、下丘脑、胸肌、腿肌、卵巢、心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏组织中表达变化。【结果】 miRBase检索共获得59种动物59条miR-10b-5p序列,即每一种动物都只有一种miR-10b-5p形式。基因定位分析发现,鸡miR-10b-5p位于2号染色体上的HOX基因家族中。常见物种miR-10b-5p成熟序列比对分析结果表明,miR-10b-5p的成熟序列相似性较高,物种间较为保守。系统进化树分析发现,miR-10b在哺乳类中的灵长目、啮齿目、鸟类、鱼类中各自先聚为一支,然后再共同聚为一类,这表明miR-10b在进化过程中是保守的。靶基因预测发现,miR-10b-5p共有300个靶基因。GO功能分析发现,靶基因主要富集到染色质组装和基因表达的转录后调控、组蛋白甲基转移酶复合物、转录因子复合物等功能。KEGG通路分析表明,靶基因主要富集到Wnt和p53信号通路上。组织表达分析显示,miR-10b-5p在检测的各个组织中均有表达;3日龄时大脑、小脑、垂体、胸肌和腿肌中miR-10b-5p表达量显著高于心脏、下丘脑、肾脏和肺脏等组织(P<0.05);90日龄时,垂体、胸肌、腿肌和大脑中miR-10b-5p表达量显著高于其他组织(P<0.05)。与3日龄雏鸡相比,90日龄时垂体、胸肌和腿肌中miR-10b-5p表达量均显著上升(P<0.05)。【结论】 鸡miR-10b-5p是组织广泛表达的miRNA,miR-10b在进化过程中是保守的,其可能通过Wnt及p53信号通路调控肌肉细胞增殖分化,进而调控鸡肌肉生长发育。     

miR-192进化分析、靶基因预测及组织表达分析

【目的】研究miR-192的生物进化进程和潜在靶基因功能,以及miR-192在大围子猪(脂肪型猪)和大约克夏猪(瘦肉型猪)脂肪组织中的差异表达。【方法】利用miBase数据库获取miR-192成熟序列,并利用Ensembl数据库定位miR-192在不同物种基因组的分布特征;采用Mega 11.0软件程序构建miR-192系统进化树;通过实时荧光定量PCR检测miR-192在大围子猪和大约克夏猪背部脂肪组织中的表达情况,并比较表达差异;利用不同在线网站预测猪miR-192靶基因,并对靶基因进行GO功能和KEGG通路富集分析。【结果】miR-192在生物进化过程中具有高度保守性;实时荧光定量PCR结果显示,miR-192在大围子猪背部脂肪组织的表达量极显著高于大约克夏猪(P<0.01));GO功能和KEGG通路富集分析结果表明,miR-192靶基因主要起转录前调节和结合的作用,且主要在染色质和细胞核中发挥作用,多数基因富集在与脂肪代谢相关的信号通路;对3个网站不同物种预测结果取交集共获得猪miR-192保守靶基因5个。【结论】miR-192在生物进化过程中具有高度保守性,可能通过靶向...     

绵羊miR-150靶基因预测及生物信息学分析

为探究miR-150在绵羊卵巢中的调控机制,本研究利用生物信息学方法对miR-150进行靶基因预测与分析。通过miRBase数据库获取miR-150成熟序列,进行序列比对和保守性分析;利用Ensemble数据库搜索miR-150前体序列,并利用PROMO在线软件对其上游2 000 bp的启动子区进行转录因子结合位点预测;通过TargetScan和miRwalk在线软件预测并取靶基因的交集,采用DAVID和KOBAS在线软件对预测靶基因进行GO功能和KEGG通路富集分析;利用Networkanalyst在线软件对靶基因进行功能性蛋白的互作分析,绘制miR-150靶基因参与的调控网络;利用YM500V2在线软件分析miR-150靶基因在不同组织和疾病中的差异表达水平。结果显示,miR-150成熟序列在不同物种间具有高度保守性;miR-150启动子区存在p53、ID1、FOXO4等转录因子结合位点。GO功能分析结果显示,主要富集在RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控等生物过程,锌离子结合、DNA结合、转录DNA模板等分子功能,以及核、核质、胞质、胞质核周区域等细胞组分。KEGG通路富集结果显示,主要富集在癌症通路、癌症中蛋白聚糖、人乳头瘤病毒感染、乳腺癌、调节干细胞多能性等信号通路。miR-150靶基因互作分析发现,靶基因PIK3R1、PIK3CB、CTNNB1与其他蛋白存在较多靶向关系,参与了雌激素信号通路、细胞衰老、磷脂酰肌醇信号系统、TGF-β等通路。根据YM500V2在线软件分析miR-150在不同组织和疾病中的表达发现,在血液中表达水平最高,在卵巢、胰腺、淋巴和皮肤中表达水平相对较高,在脑和肾上腺皮质中表达水平很低或不表达。通过对绵羊miR-150靶基因的生物信息学分析,为其功能和调控机制研究提供参考依据,为绵羊miR-150在卵巢发育中的调控机制奠定基础。     

miR-449b对绵羊早期胚胎发育的影响

【目的】研究miR-449b对绵羊早期胚胎发育的影响。【方法】采用Percoll密度梯度离心法获得纯化绵羊精子，将绵羊卵丘-卵母细胞复合体（COCs）在培养箱中培养16~18 h获得成熟卵母细胞，从1月龄纯种萨福克绵羊耳组织分离成纤维细胞，通过实时荧光定量PCR比较绵羊精子、成熟卵母细胞与成纤维细胞中miR-449b的相对表达量；给成熟卵母细胞分别显微注射0.9 %生理盐水（Con组）、miR-449b模拟物对照（NC mimic）与miR-449b模拟物（miR-449b mimic），注射后进行孤雌激活，分别于激活的第2、7天统计胚胎卵裂率与囊胚率；将成熟卵母细胞进行体外受精（IVF），收集IVF、Con、NC mimic与miR-449b mimic组2-细胞胚胎，采用免疫荧光法比较组蛋白H3K9me3的变化。【结果】miR-449b在精子中的表达显著高于成熟卵母细胞和成纤维细胞（P＜0.05）；与Con组相比，miR-449b mimic和NC mimic组胚胎的卵裂率均显著降低（P＜0.05），NC mimic组胚胎卵裂率显著低于miR-449b mimic组（P＜0，05）；miR-449b mimic组胚胎囊胚率提高，但差异不显著（P＞0.05）；IVF、Con、NC mimic与miR-449b mimic组2-细胞胚胎均表达组蛋白H3K9me3，且都在细胞核表达。与Con组相比，NC mimic组2-细胞胚胎组蛋白H3K9me3的表达水平显著增加（P＜0.05），miR-449b mimic组显著降低（P＜0.05）；NC mimic组2-细胞胚胎组蛋白H3K9me3的表达水平显著高于miR-449b mimic组（P<0.05），miR-449b mimic与IVF组无显著差异（P＞0.05）。【结论】miR-449b能显著提高绵羊早期胚胎的发育率，且降低早期胚胎中H3K9me3的表达水平。     

miR-181a和miR-181d-5p对猪前体脂肪细胞成脂分化调控的研究

【目的】 探究miR-181a和miR-181d-5p在荣昌猪原代前体脂肪细胞分化中的作用及机制。【方法】 通过比对种子序列差异分析miR-181a和miR-181d-5p在猪、人、大鼠和小鼠不同物种间的序列保守性；实时荧光定量PCR检测miR-181a和miR-181d-5p在猪肌肉和背部皮下脂肪组织中表达；利用miRandn和TargetScan在线软件预测miR-181a和miR-181d-5p的靶基因，并进行GO和KEGG富集分析；使用RNAhybrid在线软件预测miR-181a和miR-181d-5p与其靶基因的结合自由能。取7日龄雄性荣昌猪背部皮下脂肪组织分离原代前体脂肪细胞。分别设计miR-181a和miR-181d-5p的靶基因野生型和突变型载体，并与对应的miRNA共转染前体脂肪细胞，进行双荧光素酶报告基因试验验证miRNA与靶基因的靶标关系，测定miR-181a和miR-181d-5p与其靶基因的结合情况。构建miR-181a和miR-181d-5p的模拟物（miR-181a mimics、miR-181d-5p mimics）、抑制物（miR-181a inhibitor、miR-181d-5p inhibitor）、阴性对照（NC）及其靶基因的干扰siRNA （Gene-siRNA），转染细胞6 h后进行诱导分化。6 d后，分别对不同处理的细胞通过实时荧光定量PCR检测基因表达情况，油红O染色鉴定甘油三酯生成情况。【结果】 保守性分析结果表明，miR-181a和miR-181d-5p在猪、人、大鼠和小鼠间具有高度序列保守性；miR-181a与miR-181d-5p在猪不同组织中定量结果显示，miR-181a与miR-181d-5p在猪脂肪组织中特异性高表达；靶基因预测结果表明，miR-181a与miR-181d-5p的靶基因分别为线粒体甘油3-磷酸脱氢酶（GPD2）和环腺苷酸反应元件（CREB1）；GO和KEGG功能富集分析发现，miR-181a和miR-181d-5p的靶基因可以抑制甘油三酯生成，调节脂肪细胞分化，且miR-181a和miR-181d-5p与其靶基因的自由结合能均<－87.8 kJ/mol；双荧光素酶报告基因试验结果表明，转染miR-181a与miR-181d-5p的mimics可以极显著抑制靶基因3'-UTR野生型双荧光素酶报告载体中的荧光素酶活性（P<0.01），但不影响靶基因突变型双荧光素酶报告载体中的荧光素酶活性。诱导分化结果表明，与未分化脂肪细胞（0 d）相比，miR-181a表达量在分化的第4天显著升高（P<0.05），到第6天达到极显著差异（P<0.01）；miR-181d-5p及GPD2和CREB1基因表达量在分化的第4、6天均极显著升高（P<0.01）。miR-181a和miR-181d-5p的细胞转染试验均得到相似结果，与NC组相比，mimics组miR-181a与miR-181d-5p的表达量均极显著上升（P<0.01），inhibitor组miR-181a与miR-181d-5p表达量均极显著下降（P<0.01）；mimics和siRNA组的GPD2与CREB1基因表达量均极显著下降（P<0.01），inhibitor组GPD2与CREB1基因表达量均极显著上升（P<0.01）；mimics和siRNA组PPARγ和C/EBPα基因的相对表达量均显著或极显著上升（P<0.05；P<0.01），inhibitor组PPARγ和C/EBPα基因的表达量均显著下降（P<0.05）；油红O染色结果表明，与NC组相比，mimics和siRNA组细胞脂滴数目增加，inhibitor组细胞脂滴数目减少。【结论】 miR-181a和miR-181d-5p可以分别靶向结合GPD2和CREB1基因3'-UTR区域序列，降低GPD2和CREB1基因的表达，促进猪前体脂肪细胞成脂分化。     

鸡miR-125b的组织发育性变化及其功能预测分析

为了解miR-125b的进化历史和潜在的生物学功能,下载不同物种miR-125b前体序列,运用Clustal W2软件进行多序列比对,构建系统进化树,q PCR方法检测固始鸡不同组织中miR-125b表达量的发育性变化,通过Targetscan 7.0与miRDB数据库对miR-125b靶基因进行预测、DAVID数据库对预测的靶基因进行基因本体论(GO)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析。结果显示:不同物种之间miR-125b具有很高的保守性;在胚胎期下丘脑中,随着胚胎发育,miR-125b的表达量逐渐增加,出壳后又呈现逐渐降低的趋势,到36周龄表达量又显著升高;在成年期消化器官(肌胃、腺胃、小肠、肝脏)中也具有较高的表达量;经预测,miR-125b靶基因有920个,富集于组织发育、生物调节、基因表达的转录后调节、小RNA的生物学加工等生物过程和细胞外基质受体相互作用、调节肌动蛋白细胞骨架、MAPK信号通路、胰岛素信号通路、不饱和脂肪酸的生物合成和NOD样受体信号等通路。结果表明:鸡miR-125b为广泛性时序表达miRNA,可能参与鸡胚胎期及出壳后生长发育相关的诸多生物学过程的调控。     

不同繁殖季节绵羊卵巢组织中piRNAs序列特征及表达差异分析

为了分析绵羊卵巢组织中piRNAs的序列特征及不同繁殖季节绵羊卵巢组织中piRNAs的表达差异,本试验采用Solexa测序技术对休情季节（休情期）和发情季节（卵泡期和黄体期）滩羊卵巢组织进行高通量测序,采用生物信息学方法筛选绵羊卵巢中的piRNAs,对piRNAs的长度分布、首位碱基偏好、基因组来源、染色体分布、链特异性、ping-pong循环特征、piRNAs比对重复序列类型进行分析,并对发情季节与休情季节绵羊卵巢之间差异表达的piRNAs进行靶基因预测及其靶基因的GO功能和KEGG Pathway富集分析。结果显示,绵羊卵巢中不同长度的piRNAs首位碱基偏好性不一致;3个时期（休情期、黄体期和卵泡期）的piRNAs均主要比对到基因内含子、编码区及lncRNA区域,而比对到重复序列的piRNAs相对较少;绵羊卵巢piRNAs在染色体上呈不均匀分布;绵羊piRNAs簇存在很强的链特异性,但首位碱基偏好性不明显;3个时期的piRNAs均无明显的ping-pong循环特征。KEGG富集分析发现,差异piRNA靶基因主要富集在RNA运输通路（RNA transport pathway）、嘌呤代谢通路（purine metabolism pathway）、黏着斑通路（focal adhesion）、PI3K-Akt信号通路（PI3K-Akt signaling pathway）、Hippo信号通路（Hippo signaling pathway）等与绵羊繁殖相关的通路。本研究揭示了不同繁殖季节绵羊卵巢组织中的piRNAs序列特征,暗示绵羊卵巢组织中的piRNAs可能通过BAD等基因和黏着斑通路等调控绵羊季节性繁殖,为深入解析绵羊季节性发情分子机制提供一定参考。     

不同繁殖季节绵羊卵巢组织中piRNAs序列特征及表达差异分析

为了分析绵羊卵巢组织中piRNAs的序列特征及不同繁殖季节绵羊卵巢组织中piRNAs的表达差异,本试验采用Solexa测序技术对休情季节(休情期)和发情季节(卵泡期和黄体期)滩羊卵巢组织进行高通量测序,采用生物信息学方法筛选绵羊卵巢中的piRNAs,对piRNAs的长度分布、首位碱基偏好、基因组来源、染色体分布、链特异性、ping-pong循环特征、piRNAs比对重复序列类型进行分析,并对发情季节与休情季节绵羊卵巢之间差异表达的piRNAs进行靶基因预测及其靶基因的GO功能和KEGG Pathway富集分析。结果显示,绵羊卵巢中不同长度的piRNAs首位碱基偏好性不一致;3个时期(休情期、黄体期和卵泡期)的piRNAs均主要比对到基因内含子、编码区及lncRNA区域,而比对到重复序列的piRNAs相对较少;绵羊卵巢piRNAs在染色体上呈不均匀分布;绵羊piRNAs簇存在很强的链特异性,但首位碱基偏好性不明显;3个时期的piRNAs均无明显的ping-pong循环特征。KEGG富集分析发现,差异piRNA靶基因主要富集在RNA运输通路(RNA transport pathway)、嘌呤代谢通路(purine metabolism pathway)、黏着斑通路(focal adhesion)、PI3K-Akt信号通路(PI3K-Akt signaling pathway)、Hippo信号通路(Hippo signaling pathway)等与绵羊繁殖相关的通路。本研究揭示了不同繁殖季节绵羊卵巢组织中的piRNAs序列特征,暗示绵羊卵巢组织中的piRNAs可能通过BAD等基因和黏着斑通路等调控绵羊季节性繁殖,为深入解析绵羊季节性发情分子机制提供一定参考。     

香猪睾丸miR-449b和miR-222分子的发育性变化

为了阐明miR-449b和miR-222对贵州从江香猪睾丸发育的调节作用。运用qPCR方法检测香猪睾丸组织中miR-449b和miR-222表达量的发育性变化,通过miRSystem数据库、Kobas数据库对预测的靶基因进行信号转导通路富集分析。经克隆测序,得到香猪miR-222序列,与猪的相似性为100%,而且物种之间miR-449b和miR-222两个分子的保守性都很高。香猪睾丸中miR-449b于1~4月龄期间的表达量逐渐上升,4月龄时表达量达到峰值,之后下降;miR-222的表达量呈现相反的变化趋势,于1~4月龄期间表达量逐渐下降,1月龄时最高,4月龄时最低,之后的表达量有所回升;已知物种的miR-449b和miR-222序列高度保守;经预测miR-449b靶基因有420个,富集于卵母细胞减数分裂、Notch信号通路、Ras信号通路等100个途径(P0.05),miR-222的靶基因有429个,富集于细胞周期、Fox O信号通路、TGF-β信号通路等69个通路(P0.05);miR-449b和miR-222的靶基因共享的通路为Wnt信号通路、MAPK信号通路、雌激素信号通路等42个(P0.05)。     

湖羊卵巢不同发育阶段的miRNA鉴定与分析

旨在分析不同发育阶段绵羊卵巢组织中miRNA的表达水平,了解miRNA表达及其调控机理。本研究采用转录组测序技术鉴定1和8月龄湖羊卵巢组织中的miRNA,运用生物信息学方法对差异表达的miRNA进行靶基因预测,并对靶基因进行GO和KEGG功能注释,筛选参与卵巢发育的miRNAs。结果显示,6个样品中检测到的已知miRNA个数分别为2 186、2 091、2 217、2 136、2 176、2 088,新miRNA的个数分别为613、567、668、640、662、450。筛选到701个差异表达novel miRNAs,38个差异表达已知miRNAs。对差异表达miRNAs的靶基因进行GO和KEGG分析,发现主要富集在血管内皮生长因子通路和卵巢类固醇生成等过程。对3个差异miRNAs进行qRT-PCR验证,与测序结果一致。oar-let-7b、oar-miR-29a、oar-miR-134-3p、oar-miR-541-3p等的靶基因富集在TGF-beta通路、卵巢卵泡生长等与卵巢发育相关的生物过程。oar-miR-148a、oar-miR-136的靶基因调控颗粒细胞增殖和类固醇生成,可能参与调控绵羊卵巢发育。     

绵羊miR-200b对卵泡颗粒细胞周期和凋亡的影响

旨在揭示miR-200b在绵羊卵泡颗粒细胞的作用。本研究利用在线工具（TargetScan、miRTarBase及miRDB）预测miR-200b的靶基因,并利用KOBAS对其进行GO和KEGG通路富集分析。将分离培养的绵羊卵泡颗粒细胞分为4组,分别转染miR-200b mimic、mimic NC、miR-200b inhibitor和inhibitor NC,每组6个重复。采用CCK8法分别检测转染24、48和72 h颗粒细胞的存活率;采用荧光定量PCR检测miR-200b、CDK4、CDK6、CCND1、CCND2、Bax和Bcl-2基因的表达水平。利用3种在线工具预测到25个miR-200b的共同靶基因,GO和KEGG通路富集分析发现这些基因富集在细胞的增殖分化、细胞周期及生殖发育过程;转染miR-200b mimic、miR-200b inhibitor和NC后,颗粒细胞存活率随时间延长呈“V”型趋势降低,且48 h达最低（P<0.01）;miR-200b inhibitor与inhibitor NC组相比,miR-200b表达量无显著差异（P>0.05）;与mimic NC相比,miR-200b mimic组极显著促进miR-200b表达（P<0.001）,显著下调CDK4（P<0.01）、CDK6（P<0.001）和CCND1（P<0.001）、CCND2（P<0.05）和Bcl-2（P<0.01）基因表达水平,Bax表达并无显著变化（P>0.05）,且极显著下调Bcl-2与Bax比值（P<0.001）。综上所述,miR-200b抑制绵羊卵泡颗粒细胞细胞周期和增殖并促进其凋亡。     

发情周期不同阶段绵羊卵巢lncRNA的鉴定和功能分析

旨在分析不同繁殖周期绵羊卵巢组织中长链非编码RNA (long non-coding RNA,lncRNA)的表达谱,了解lncRNA表达及其调控机理,为绵羊繁育研究提供理论依据。本研究以湖羊为研究对象,选取年龄在1.5～2.5岁的黄体期和卵泡期母羊各3只,通过高通量测序筛选出卵巢组织中的lncRNA,运用生物信息学分析对差异表达的lncRNA进行靶基因预测,通过GO和KEGG富集分析找出与绵羊繁殖相关的通路。结果显示,本研究共获得1 379个差异表达的lncRNAs,其中1 158个表达上调,221个表达下调。GO和KEGG富集分析表明,差异表达的lncRNAs及其靶基因主要参与卵泡发育、排卵周期过程、钙离子信号通路、卵母细胞减数分裂、催产素信号通路、MAPK信号通路、甲状腺激素合成通路、雌激素信号通路。关键的lncRNAs可能通过调控参与这些信号通路和生物学过程的相关基因来调控生殖。其中,LNC_011239、LNC_012847、LNC_003902、LNC_003906、LNC_003907等靶向的MAPK1、ADCY1、ADCY5、PPP3CA和CDC23可能发挥关键的调控作用。qRT-PCR验证证明,随机选取的5个差异lncRNAs定量结果与测序结果基本一致。本研究利用RNA-Seq技术筛选出黄体期和卵泡期卵巢组织中的lncRNAs,并进行差异分析,为揭示绵羊繁殖能力的分子机制提供依据。     

miR-184及miR-205在绵羊不同生长时期毛囊及其他组织中的表达研究

为了研究miR-184及miR-205在绵羊毛囊发育过程中的作用,本研究以绵羊为研究材料,检测了miR-184及miR-205在毛囊3个发育时期及不同组织中的表达情况,进行了基因组定位及前体预测,并预测了可能的靶基因及调控的基因通路.结果发现,miR-184的表达量从毛囊生长期到衰退期呈逐步上升的趋势,而miR-205则表现为先上升后下降,其在衰退期表达量最高.2个microRNA在绵羊的多个组织中均有表达.两者的候选靶基因涉及15个基因通路,可能通过Wnt通路调控毛囊的生长周期.     

水牛miR-16b过表达腺病毒载体构建及生物信息学分析

试验旨在对水牛pri-miR-16b基因进行克隆并构建腺病毒表达载体，且对水牛miR-16b及其预测靶基因进行生物信息学分析，为研究其在水牛卵母细胞成熟过程中的作用奠定基础。利用RT-PCR技术从水牛卵巢基因组中扩增pri-miR-16b基因，采用同源重组的方法构建pDC316-mCMV-EGFP-pri-miR-16b质粒；利用BLAST程序进行同源性分析，Mega 7.0构建系统进化树，ViennaRNA Web Services预测pre-miR-16b的二级结构。对腺病毒质粒与腺病毒骨架质粒pBHGloxdelE13cre进行包装，经过3次扩增获得含有pri-miR-16b的腺病毒颗粒，将获得的病毒颗粒命名为Ad-miR-16b，并进行病毒滴度测定；利用Ad-miR-16b感染水牛卵丘细胞，实时荧光定量PCR检测miR-16b在卵丘细胞中的表达情况。利用TargetScan对miR-16b进行靶基因预测，对预测的靶基因进行KEGG通路富集。结果显示，试验成功克隆水牛pri-miR-16b序列，通过比对发现与牛的序列相似性分别为100%，与其他物种同源性较高，和黄牛的亲缘关系最近。ViennaRNA Web Services预测结果显示，pre-miR-16b的二级结构具有典型的单一茎环结构。试验成功获得Ad-miR-16b腺病毒颗粒，病毒滴度为3.367×10¹⁰ GFU/mL，感染卵丘细胞后，实时荧光定量PCR检测发现miR-16b的表达量极显著升高（P<0.01）。对miR-16b预测的1 394个靶基因进行KEGG通路富集分析，发现miR-16b可能主要通过调控卵丘细胞中MAPK、TGF-β及PI3K/AKT等74条信号通路进而在卵母细胞成熟过程中发挥作用。     

miR-18a-5p在鸡不同生长时期的表达及其生物信息学分析与靶基因预测

为探究miR-18a-5p在鸡不同生长时期组织表达变化规律及其生物信息学特点,本研究以苏禽3号鸡为试验动物,利用实时荧光定量PCR技术检测不同生长时期鸡miR-18a-5p的组织表达变化。通过文献和miRBase检索脊椎动物的miR-18a-5p序列,利用Ensembl数据库确定miR-18a-5p在基因组中的位置,根据成熟序列构建系统进化树;使用miRmap、microT、miRanda和TargetScan网站预测miR-18a-5p靶基因,并进行GO和KEGG分析。组织表达分析结果显示,miR-18a-5p序列在鸡心脏、脾脏、肾脏和下丘脑中的表达量显著高于除大脑以外的其他组织(P<0.05)。与3日龄雏鸡相比,90日龄鸡心脏、脾脏、肾脏、腿肌和下丘脑中miR-18a-5p的表达量均显著上升(P<0.05)。在50种脊椎动物中共发现52条miR-18a-5p序列,几乎所有物种都只有1条成熟序列;基因定位分析发现,鸡miR-18a-5p位于1号染色体上的基因间隔区。多序列比对分析表明,不同物种miR-18a-5p的成熟序列同源性较高,物种间较为保守。系统进化树分析发现,鸡miR-18a-5p与原鸽、斑胸草雀等其他鸟类聚为一类,这表明miR-18a-5p进化过程中是保守的。靶基因预测和功能分析发现,miR-18a-5p共有121个靶基因。GO分析结果显示,靶基因主要富集到蛋白质泛素化、细胞周期阻滞、白细胞介素-6产生的负调控等功能。KEGG 通路分析表明,靶基因主要富集到细胞周期及Wnt和FoxO信号通路等。多个与肌肉生长及细胞增殖等相关的基因富集到相关通路之上。综上,鸡miR-18a-5p是组织广泛表达的miRNA,其可能通过Wnt及FoxO信号通路调控肌肉生长及细胞增殖分化。本研究为miR-18a-5p功能及调控机制的深入研究提供参考依据。     

野生盘羊×巴什拜羊杂交二代尾部脂肪差异表达lncRNA的鉴定与分析

【目的】 分析不同脂尾型绵羊尾部脂肪组织中的长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)的表达谱,探究lncRNA与绵羊尾部脂肪沉积机制的关系,为揭示绵羊尾脂沉积机制提供理论依据。【方法】 选择新疆地方绵羊巴什拜羊(肥尾型)和野生盘羊×巴什拜羊杂交二代(小尾型)作为研究对象,采集2个群体尾部脂肪组织,利用转录组测序技术筛选差异表达lncRNA并预测靶基因,对其进行GO功能和KEGG通路富集分析;利用实时荧光定量PCR技术验证转录组测序的表达结果。【结果】 通过差异表达分析共筛选出728个差异表达lncRNAs,其中270个表达下调,458个表达上调;通过差异表达lncRNA靶基因的GO功能和KEGG通路富集分析,筛选到634个靶基因参与疾病、免疫、蛋白修饰、细胞代谢等相关功能分类,共涉及76条信号通路,部分lncRNA介导的靶基因SCD、GPAM、THRSP、FASN等与绵羊尾部脂肪沉积相关。实时荧光定量PCR与转录组测序结果趋势相同。【结论】 lncRNA在绵羊脂尾进化中对尾部脂肪沉积具有重要的调控作用,为从lncRNA的角度分析绵羊脂肪沉积提供了理论依据。     

miR-33a靶向Lipin1和IRS2调节绵羊前体脂肪细胞分化的研究

旨在揭示miR-33a在绵羊前体脂肪细胞分化中的生物学功能。本研究以15日龄雄性绵羊背部皮下前体脂肪细胞为试验材料,所有的试验均设立3个重复;利用生物信息学软件预测miR-33a的靶基因,并通过双荧光素酶报告试验对预测的潜在靶基因进行验证;用qPCR和Western blotting分别检测miR-33a、Lipin1和IRS2及其编码蛋白的表达,以揭示miR-33a与其靶基因在绵羊前体脂肪细胞分化中的表达规律;慢病毒介导实现miR-33a的过表达和干扰后,检测Lipin1、IRS2和成脂标志基因的表达,并用油红O染色检测脂滴沉积能力,以解析miR-33a对其靶基因的调节机制。生物信息学分析发现,miR-33a与Lipin1和IRS2 3'-UTR都存在结合位点,miR-33a显著下调Lipin1和IRS2野生型双荧光质粒的相对荧光活性（P<0.05）;在绵羊前体脂肪细胞分化中,miR-33a与Lipin1和IRS2的表达趋势相反;过表达miR-33a后,显著下调了Lipin1（P<0.01）和IRS2（P<0.05）及其编码蛋白以及成脂标志基因的表达;干扰miR-33a后,这些基因和蛋白的表达则显著上调;过表达miR-33a减少了脂滴沉积,干扰miR-33a促进了脂滴沉积。在绵羊前体脂肪细胞分化中,miR-33a与Lipin1和IRS2的表达呈负相关。miR-33a靶向Lipin1和IRS2的3'-UTR抑制绵羊前体脂肪细胞分化和脂滴沉积。     

miR-143在尼罗罗非鱼性腺组织中的表达和功能预测

miR-143是一种广泛表达的miRNA,本研究采用RT-qPCR方法检测miR-143在尼罗罗非鱼雌雄性腺中的表达差异,同时对它的靶基因进行预测,并对靶基因进行GO富集和KEGGpathway分析。结果表明:miR-143在尼罗罗非鱼雌雄性腺均有表达,在卵巢中表达量显著高于精巢(P0.05);GO富集分析表明,miR-143参与细胞增生、营养积累和代谢等多个生物学过程;KEGGpathway分析表明,IGF1R、CAMKⅡ和PLA2等靶基因富集于与性腺发育、繁殖相关的卵母细胞减数分裂通路、Wnt信号通路和GnRH通路。本研究为探究miR-143在鱼类性腺发育过程的功能和分子机理提供了基础资料。     

调控香猪繁殖候选miRNA筛选

研究旨在从香猪卵巢small RNA测序数据中挖掘调控香猪繁殖的microRNA （miRNA）,解析miRNA调控香猪卵巢功能及繁殖性状的分子机制,对于猪的遗传选育具有重要意义。研究选取发情期和间情期的香猪各4头,屠宰后取其卵巢组织,提取总RNA进行small RNA测序,利用生物信息学方法检测miRNA表达谱,筛选差异表达的miRNA,预测差异表达miRNA靶基因,并对靶基因进行GO功能富集和KEGG通路富集分析。结果显示,香猪卵巢组织中miRNA在染色体上呈不均匀分布,主要分布于1号染色体和X染色体上。香猪卵巢中共有627个已知猪miRNAs表达,其中有34个差异表达miRNAs,表达量前五的分别是miR-23、let-7i-5p、miR-103、miR-30e-5p和miR-1271-5p。GO功能分析结果显示,靶基因主要参与的生物学过程是细胞过程（cellular process）,主要分布于细胞（cell）,主要分子功能是结合（binding）;KEGG显著富集通路中,促性腺激素释放激素受体通路（gonadotropin-releasing hormone receptor pathway）、胰岛素样生长因子通路（IGF pathway）和表皮生长因子受体信号通路（EGF receptor signaling pathway）与卵母细胞的发育成熟相关,因此推测miR-23b、let-7i-5p、miR-103、miR-30e-5p和miR-1271-5p可能参与了香猪繁殖调控。本研究初步筛选出5个可能调控香猪繁殖性能的miRNAs,可为从分子水平提高香猪产仔数提供理论基础。