用实时荧光PCR方法定量检测Bt176转基因玉米

以实时荧光PCR技术鉴定商业化种植的转基因玉米Bt176品系。根据转基因玉米Bt176中内源基因Zein和外源基因cry1Ab设计引物及TaqMan荧光探针,成功建立了检测转基因玉米Bt176品系的实时荧光PCR方法。结果表明,应用实时荧光PCR方法检测转基因作物,不仅可以达到品系鉴定的作用,而且可以用于转基因成分的检测。该方法简便迅速,降低了污染机会,为转基因作物及产品的品系检测提供了新方法。     

转基因玉米种子的PCR检测

以PCR技术为基础,建立了检测玉米种子中转基因成分的方法。对提取的基因组DNA进行PCR以扩增玉米内源基因zSSIIb,设计了常见的CaMV 35 S启动子、NOS终止子、Bar终止子、Bt,进行了初步的定性筛选,并用Bt176对阳性结果进行验证,结果表明:这是一套转基因玉米定性PCR检测方法,具有较高的准确性、可靠性,可以用于转基因玉米种子及其产品的筛查、抽检。     

转基因玉米种子的PCR检测

以PCR技术为基础,建立了检测玉米种子中转基因成分的方法。对提取的基因组DNA进行PCR以扩增玉米内源基因zSSIIb,设计了常见的CaMV 35 S启动子、NOS终止子、Bar终止子、Bt,进行了初步的定性筛选,并用Bt176对阳性结果进行验证,结果表明:这是一套转基因玉米定性PCR检测方法,具有较高的准确性、可靠性,可以用于转基因玉米种子及其产品的筛查、抽检。     

重组酶聚合酶扩增技术快速检测转基因玉米Bt11

根据外源基因草丁膦乙酰转移酶基因(PAT)与载体骨架连接区序列设计引物,建立了基于重组酶聚合酶扩增技术(RPA)的转基因玉米Bt11特异性快速检测方法。结果表明:该方法可在37℃条件下20 min内完成转基因玉米Bt11的检测,绝对检测限为100拷贝/μL,相对检测限为0.1%。     

转基因玉米的定性PCR检测

根据玉米内参照基因zSSIIb和转基因玉米中常见的CaMV35S、NOS、Bt、hpt等基因的特异性结构,设计5对定性PCR引物,经定性PCR检测,可以准确地将转基因玉米的目的基因检出,说明这5对引物具有较高的特异性和准确性。由此建立了一套转基因玉米定性PCR检测方法,用于转基因玉米及其产品的筛查、抽检。     

转基因作物中常见Bt基因PCR检测方法的建立

建立基于常见外源基因的转基因成分检测方法是开展转基因生物监测与检测活动的技术支撑,Bt基因作为目前商业化应用最广泛的一类外源基因,已成为转基因产品筛选检测的重要靶标。依据转基因作物中常见的6种Bt基因(cry1F、cry1C、cry1Ie、cry34Ab、cry35Ab、vip3A)的核苷酸序列设计特异性PCR引物,并经过特异性、灵敏度等一系列测试,建立上述6种Bt基因的定性PCR检测方法。结果显示,应用这些方法均可从含有相应Bt基因的样品中正确检测出预期转基因成分,方法的灵敏度可达0.10%。上述方法具有特异性强、灵敏度高等特点,适用于转基因作物中常见Bt基因的筛选检测。     

利用可视化膜芯片检测9种转基因玉米

建立了一种可同时检测9种转基因玉米(Zea mays L.)的可视化膜芯片检测方法。该方法利用紫外交联技术,将9种转基因玉米特异性探针及内源性玉米醇溶蛋白基因(Zein)探针和杂交质控探针固定于尼龙膜表面制成检测芯片。通过多重PCR同时扩增多重靶标片段,生物素化产物与检测芯片杂交。阳性结果由链酶亲和素-碱性磷酸酶及显色底物NBT/BCIP的显色反应在芯片表面形成裸眼可见的点。应用商业化转基因玉米(Bt176、Bt11、MON810、GA21、T25、TC1507、DAS-59122、NK603、MIR604)、转基因棉花(MON1445、MON15985)、转基因大豆及非转基因材料检验了芯片的性能,结果表明,制备的检测芯片具有良好的特异性和重复性,检测限为0.5%。芯片鉴定结果与PCR产物测序结果一致。     

转基因玉米Bt 176细胞毒性及遗传毒性研究

利用细胞-遗传毒理学技术评价转基因玉米Bt 176细胞毒性及遗传毒性,分别以200,100,50,25,12.5mg·L-1转基因玉米Bt176全蛋白质作用于人淋巴细胞,并各孵育1.5,6,24 h.检测其细胞毒性损伤及遗传毒性损伤,并与空白组、阳性对照组、非转基因玉米组相比较.结果表明,阳性组与空白组淋巴细胞的遗传及细胞损伤指标存在显著差异.转基因玉米组淋巴细胞遗传及细胞损伤指标与非转基因玉米组淋巴细胞相比无明显差异(P＞0.05),且与空白剂组细胞差异不显著(P＞0.05).结果还表明,转基因玉米Bt 176与非转基因玉米两者在遗传毒性及细胞毒性上性状相似,实质等同.     

����MPCR����⿹�����ͳ��ݼ�ת��������Bt11

为构建抗虫和耐除草剂转基因玉米Bt11的多重PCR检测方法,根据抗虫和耐除草剂玉米Bt11分子特征,同时选择玉米内源参照基因zSSIIb、外源基因Cry1Ab、P-CaMV 35S、T-NOS和PAT 5个基因作为MPCR检测基因,参照国家相关标准中特异性引物序列,通过对反应条件的优化以及方法特异性和灵敏度测试,建立MPCR检测体系.结果表明:利用已知样品对体系(退火温度为56℃,模板浓度≥200bp,引物配比为zSSIIb∶Cry1Ab∶P-CaMV 35S∶T-NOS∶PAT =0.1∶0.2∶0.2∶0.2∶0.2)验证,抗虫和耐除草剂玉米Bt11能同时被检出zSSIIb、Cry1Ab、P-CaMV 35S、T-NOS和PAT等5个基因,而其他样品均不能被同时检出这5个基因,建立体系可用于抗虫和耐除草剂转基因玉米Bt11检测.     

基于MPCR法检测抗虫与耐除草剂转基因玉米Bt1

为构建抗虫和耐除草剂转基因玉米Bt11的多重PCR检测方法,根据抗虫和耐除草剂玉米Bt11分子特征,同时选择玉米内源参照基因zSSIIb、外源基因Cry1Ab、P-CaMV 35S、T-NOS和PAT 5个基因作为MPCR检测基因,参照国家相关标准中特异性引物序列,通过对反应条件的优化以及方法特异性和灵敏度测试,建立MPCR检测体系。结果表明:利用已知样品对体系(退火温度为56℃,模板浓度≥200bp,引物配比为zSSIIb∶Cry1Ab∶P-CaMV 35S∶T-NOS∶PAT=0.1∶0.2∶0.2∶0.2∶0.2)验证,抗虫和耐除草剂玉米Bt11能同时被检出zSSIIb、Cry1Ab、P-CaMV 35S、T-NOS和PAT等5个基因,而其他样品均不能被同时检出这5个基因,建立体系可用于抗虫和耐除草剂转基因玉米Bt11检测。     

江苏省畜禽饲料中转基因成分的检测分析

随着转基因植物研究的迅速发展,转基因农产品的应用也更加广泛。在我国,转基因农产品的来源主要是进口,主要是玉米、大豆,主要用于饲料加工行业。为了调查转基因玉米、大豆在江苏省畜禽饲料市场的分布情况,在江苏省市场抽取40份鸡、鹅和猪饲料以及饲料原料,通过定性PCR检测玉米内标zSSIIb、大豆内标Lectin、花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子、NOS终止子、Bt、EPSPS基因,同时检测玉米、大豆转化体事件MON810、MON89788、GTS40-3-2和MON87701。结果表明,90%的饲料都含有转基因成分;转基因玉米转化体事件MON810占50%,转基因大豆转化体MON89788、GTS40-3-2、MON87701的检出率都为80%。由研究结果可知,江苏省市场的鸡、鹅和猪饲料及饲料原料中转基因成分的占有率较高,需要进一步加强对饲料原料的转基因监管。     

多重PCR法快速检测转基因玉米多种转化体技术优势的比较分析

以常见的转基因玉米Bt176、MON810、MON863、NK603这4种转化体为检测对象,通过对其中MON810引物的重新设计和评价,建立并完善了转基因玉米四重转化体的PCR检测体系。结果表明,建立的四重PCR体系能有效检测出转基因玉米4种转化体,与单一PCR检测技术相比,检测耗时缩短63%,成本降低75%,检测产生的废液减少75%,说明该方法具有简便、快速、低成本、低污染等优势,适用于转基因玉米多种转化的大规模系统性检测。     

大米和米制品Bt63转基因检测PCR方法的灵敏度研究

采用普通PCR法和荧光定量PCR法对Bt63转基因大米的检测灵敏度进行对比研究。根据大米内源蔗糖磷酸合成酶基因SPS和结构特异性基因Btc的基因序列,选用特异性的引物和探针进行研究,经验证试验表明具有专一性,能用于品系鉴定。在灵敏度试验中,阳性转基因大米按照不同质量百分比进行梯度稀释,提取DNA进行PCR扩增。结果表明,普通PCR检测的灵敏度在0.1%左右,而荧光定量PCR检测的灵敏度为0.01%,是普通PCR检测的10倍以上。应用两种方法对实际样品进行检测,都得到了较明显的内源SPS基因的扩增,而Btc基因都是阴性。荧光定量PCR方法避免了电泳检测的步骤,具有更高的安全性和简便性,因此日常检测中,利用荧光定量PCR技术检测Bt63转基因大米及其产品是一种快速、灵敏和准确的检测手段。     

转Bt基因玉米秸秆发酵对微生物菌系SFC-2的影响

当前,利用生物基因工程技术将外源抗虫基因导入玉米,使玉米自身产生抗虫蛋白而达到抗虫目的成为可能。为了明确转基因玉米携带Bt蛋白参与微生物发酵的安全性与效应,利用乳酸菌复合系SFC-2对转Bt基因及非转基因玉米秸秆进行接种,通过对发酵过程的pH变化、纤维素降解率、分解产物定性定量分析、Bt毒蛋白含量进行全程检测,并采用DGGE(变性梯度凝胶电泳)方法在分子水平上对发酵过程中的微生物遗传物质进行监测。结果表明,乳酸菌复合系SFC-2对转基因与非转基因玉米进行接种并发酵后,4种玉米秸秆的气味具有甜酸香味、色泽好、质地松散,且pH符合发酵饲料的要求;发酵体系中pH变化情况没有显著差异;可溶性糖含量变化无显著差异;气质联机分析表明,转Bt基因和非转基因玉米秸秆发酵过程中发酵产物种类无差异,乙醇、乙酸、乳酸及甘油产生量无显著差异;转Bt基因玉米在发酵过程中秸秆的毒蛋白含量呈现不断下降的趋势。本研究结果为转Bt基因玉米的合理利用和安全性评价提供了初步依据。     

转基因玉米中膦丝菌素乙酰转移酶双抗体夹心ELISA检测方法的建立

【目的】以单克隆抗体(monoclonal antibody,mAbs)为基础,建立检测膦丝菌素乙酰转移酶(the phosphinothricin acetyltransferase,PAT)的双抗体夹心ELISA方法,为转基因玉米PAT蛋白的检测提供参考。【方法】由P3301质粒扩增出膦丝菌素乙酰转移酶基因(blalaphos resistance gene)bar,并与表达载体pET28a构建重组质粒,诱导表达产生外源性PAT蛋白;以纯化后的PAT蛋白为免疫原,制备mAbs,建立双抗体夹心ELISA方法,并与PCR检测方法进行比较,确定该方法的准确性和可靠性。【结果】应用mAbs 4D5和3E8成功建立了检测PAT蛋白的双抗体夹心ELISA方法,其有效检测范围为3.125~50ng/mL。采用该夹心ELISA方法对36份已知转基因背景的玉米样品进行了检测,根据阴阳性判定值OD450>0.210,检测出含PAT蛋白的Bt176阳性样品4份,以bar基因为检测目标利用传统PCR方法也检测出相同的Bt176样品4份,2种检测方法的符合率为100%。【结论】利用建立的双抗体夹心ELISA免疫学检测方法,可以对转基因玉米中的PAT蛋白进行准确、特异、有效的检测。     

转 Bt 基因玉米对土壤养分含量的影响

试验以转 Bt 基因玉米丹 BT01为研究对象,研究了在大田种植条件下转 Bt 基因玉米对苗期、拔节期、大喇叭口期、抽雄期、灌浆期和成熟期土壤养分含量的影响。结果表明,转 Bt 基因玉米抽雄期和成熟期土壤有机质含量,灌浆期全磷含量,大喇叭口期和成熟期缓效钾含量显著高于非转基因玉米,其余生育时期与非转基因玉米的土壤有机质、全氮、全磷和缓效钾含量无显著差异。转 Bt 基因玉米土壤水解氮含量在大喇叭口期显著高于非转基因玉米,在抽雄期和灌浆期显著低于非转基因玉米;硝态氮含量则在拔节期和抽雄期显著低于非转基因玉米,在成熟期却显著升高;土壤铵态氮含量在大喇叭口期和抽雄期显著低于非转基因玉米。从拔节期开始,除了灌浆期的速效磷含量,非转基因玉米的速效磷和速效钾含量显著高于转 Bt 基因玉米。     

利用Bt试纸对转Bt基因玉米种质的快速检测

玉米是世界三大粮食作物之一,更是重要的饲料作物,并且在世界粮食生产中处于重要的位置,因此转基因玉米的研究和发展受到广泛关注.如何更加安全准确地检测玉米中是否含有转基因,是许多学者一直研究的内容.利用Bt-Cry1Ac/Ab试纸对转Bt基因玉米种质进行检测,初步筛选出含有转Bt基因的玉米种质,同时分析了影响Bt-Cry1Ac/Ab试纸检测的因素.     

我国进出口农产品转基因成分检测与分析

对进出口农产品的转基因成分进行调查研究,分析转基因农产品的检出情况,探讨转基因农产品检出情况与转基因成分的关系,并总结转基因农产品的风险因素。研究采用荧光PCR法对425份进出口农产品样品进行转基因成分检测。结果表明:所检样品中检出含转基因成分的有36份,阳性率为8%。检出的转基因成分主要为转基因大豆、大米、玉米和油菜籽。研究结论是我国进出口农产品中存在转基因成分。进口农产品方面,大豆、玉米及其制品是含有转基因成分的高风险产品;出口农产品方面,大米及其制品是含有转基因成分的高风险产品。     

转基因大豆、玉米、水稻深加工产品的五重巢式 PCR技术检测

本试验针对已商品化的转基因大豆、玉米和水稻的主要外源基因Cry1A(B)基因、BAR基因、CP4-EPSPS基因和PAT基因及共有的内标准基因RBCL基因设计了10对引物,对从超市购买的进口大豆、玉米和水稻的11种深加工制品(未标注是否含有转基因成分)进行了五重巢式PCR定性检测。第1轮普通五重PCR检测,11个待测样品均未出现任何转基因成分,其灵敏度为0.5%;第2轮将普通五重PCR扩增产物进行五重巢式PCR检测,结果在卵磷脂、大豆蛋白质粉、巧克力饮品和婴儿米粉中扩增出RBCL基因,玉米淀粉和玉米泥中扩增出RBCL基因、Cry1A(B)基因和PAT基因;玉米蛋白粉扩增出RBCL基因、Cry1A(B)基因和BAR基因,营养麦片扩增出内参RBCL基因和Cry1A(B)基因,在大豆精炼油、色拉油和玉米油中未检测出上述2种基因和另外3种外源基因CP4-EPSPS、BAR和PAT,其检测灵敏度为0.005%。结果提示,五重巢式PCR检测方法适用于转基因大豆、玉米和水稻深加工产品的定性检测。     

2010年五项措施确保农机补贴政策继续推进

近日,根据《农业转基因生物安全管理条例》规定和农业转基因生物安全委员会评价结果,农业部批准发放了转基因抗虫水稻“华恢1号”及杂交种“Bt汕优63”和转植酸酶基因玉米BVLA430101的生产应用安全证书。这是我国首度为转基因粮食作物颁发安全证书。