棉花GhSPS1的克隆及表达模式分析

【目的】克隆棉花蔗糖磷酸合成酶基因（sucrose-phosphate synthase,SPS）,并分析该基因在组织和纤维发育不同阶段及不同非生物胁迫下的表达模式。【方法】采用genome-walking及over-lap PCR方法,获得了棉花中一个蔗糖磷酸合成酶基因--GhSPS1,通过半定量PCR法检测GhSPS1在不同非生物胁迫条件下的表达模式,采用实时荧光定量PCR法对GhSPS1及GhSUS3、GhINV、GhCESA4进行组织和纤维发育特异性表达分析。【结果】克隆得到的GhSPS1全长4 545 bp,包含10个内含子、11个外显子,其开放读码框为3 108 bp,编码1 035个氨基酸,且该基因在ABA、低温处理条件下表达量增加,在高温胁迫下,表达量先升高后降低。实时荧光定量PCR结果显示,GhSPS1及GhSUS3在各种组织中都有表达,其中,在0 DAF、3 DAF的胚珠及18 DAF的纤维中表达量最高,而GhINV、GhCESA4则分别在3-15 DAF的纤维、18 DAF的纤维中表达量最高。【结论】克隆得到的GhSPS1属于SPSA基因家族,能参与ABA、低温、高温等非生物胁迫应答,且可能在纤维发育的起始期及次生壁增厚初期发挥作用。     

葡萄VviSEP2基因的克隆及表达分析

【目的】克隆葡萄VviSEP2基因的完整开放阅读框(ORF)序列,明确其与胚珠败育型无核葡萄胚珠败育的关系。【方法】通过RT-PCR技术在‘无核白’葡萄中克隆葡萄VviSEP2基因的完整ORF序列,并对该序列及其编码产物进行生物信息学分析,采用半定量RT-PCR和实时荧光定量PCR技术分析VviSEP2的表达模式。【结果】克隆得到一个无核葡萄胚珠发育相关基因,该基因cDNA序列长度为1 132bp,ORF为741bp,编码246个氨基酸。氨基酸多序列比对和进化树分析确认,该基因是E类MADS-box基因家族成员,命名为VviSEP2。表达分析结果表明,VviSEP2只在花蕾、花和胚珠中有表达,而在根、茎、叶中无表达,并且该基因在有核葡萄‘黑比诺’花与花蕾中的相对表达水平明显高于无核葡萄‘无核白’,同时VviSEP2基因在‘黑比诺’胚珠发育各时期的相对表达水平均高于‘无核白’,为后者的3~5倍。【结论】VviSEP2基因与无核葡萄的胚败育可能存在一定关系。     

陆地棉无短绒突变体GZnn的纤维发育及其基因表达分析

 【目的】利用棉花无短绒突变体GZnn为材料,分离与棉花纤维发育相关的重要基因,从而揭示棉花纤维发育的分子机理。【方法】通过扫描电镜观察GZnn与其近等基因系TM-1在纤维发育上的差别;采用差异显示RT-PCR方法寻找GZnn与TM-1之间的差异表达片段,并进行相应分析。【结果】用扫描电镜观察突变体GZnn与TM-1的胚珠表面纤维细胞起始发生的情况,发现GZnn不仅在纤维细胞发生和延伸上延迟,而且纤维细胞总数也明显减少。利用差异显示PCR进行比较筛选,获得了12个差异表达的EST片段,其中,DS3只特异性地在GZnn 开花前（-3～0 DPA）的胚珠中特异表达,而在其近等基因系TM-1中没有表达,推测DS3可能是一个纤维启动过程中的MYB类负调控转录因子。【结论】本研究利用棉花无短绒突变体GZnn发现,棉纤维细胞在早期分化和形态建成过程中大量基因表达,对其中的关键基因的表达模式和功能开展深入研究将有助于阐明棉纤维分化发育的分子机理,为棉花遗传改良提供理论基础。     

棉花2个新的PPR基因的克隆及表达模式分析

【目的】从棉花中克隆2个新的PPR基因,分析其序列结构、基因表达和亚细胞定位,为深入研究这2个基因在棉花中的功能提供依据。【方法】利用棉花EST库,通过RT-PCR从陆地棉徐州142中克隆得到2个PPR基因：GhPPRH1和GhPPRH2;应用生物信息学方法对2个基因编码蛋白序列进行预测分析,利用半定量RT-PCR和实时荧光定量PCR的方法分析目的基因在不同组织及纤维不同发育时期的表达模式;利用棉花子叶瞬时表达系统对上述2个基因编码的蛋白进行亚细胞定位。【结果】GhPPRH1和GhPPRH2均属于PPR基因家族的PLS亚家族;GhPPRH1和GhPPRH2的开放读码框的长度分别为1 917和2 556 bp,编码638和851个氨基酸;GhPPRH1蛋白有18个PPR基序,包含1个E+结构域和1个DYW结构;GhPPRH2蛋白有17个PPR基序,包含1个E结构域,1个E+结构域和1个DYW结构;将GhPPRH1和GhPPRH2蛋白的氨基酸序列与GenBank数据库中的9条同源蛋白以及棉花中已经报道的5个PPR蛋白的氨基酸序列进行比对,构建系统进化树,结果显示,GhPPRH1与水稻RF1b蛋白亲缘关系较近,推测其可能与胞质雄性不育的育性恢复相关,而GhPPRH2与玉米PPR5蛋白亲缘关系最近,推测可能会影响细胞器一些转录本的RNA编辑;半定量RT-PCR和实时荧光定量PCR的结果表明,GhPPRH1和GhPPRH2在根、茎、叶、花及纤维发育不同时期均有表达,GhPPRH1在根中表达较高,而GhPPRH2在根、叶及15 d的纤维中表达较高;亚细胞定位结果显示,GFP标记的GhPPRH1蛋白的绿色荧光与线粒体Marker的红色荧光重叠,表明该蛋白可能定位于线粒体,GFP标记的GhPPRH2蛋白的绿色荧光与叶绿体自发的红色荧光重叠,表明GhPPRH2可能定位在叶绿体。【结论】从棉花中获得2个新的PPR基因,均属于PLS亚家族成员,亚细胞定位显示可能在线粒体和叶绿体中,推测其功能可能与细胞器中RNA的加工、修饰等过程有关。     

棉花咖啡酸-O-甲基转移酶基因的克隆及特征分析

【目的】克隆棉花木质素合成关键酶基因GhCOMT1、GhCOMT2和GhCOMT3全长cDNA序列,分析其在不同组织部位的表达情况并进行原核表达研究。【方法】根据棉花纤维特异表达cDNA文库分析得到的EST序列设计引物,采用RT-PCR技术克隆基因,用生物信息学方法对获得的cDNA序列及推定的氨基酸序列进行分析。采用半定量RT-PCR方法研究GhCOMT1、GhCOMT2和GhCOMT3在不同组织中的表达。构建了基因的原核表达载体,经酶切鉴定后转化到大肠杆菌BL21(DE3)中并诱导表达。【结果】从发育的棉花纤维中克隆了3个COMT基因cDNAs,GhCOMT1(GenBank登录号为FJ479708)、GhCOMT2(GenBank登录号为FJ479709)和GhCOMT3(GenBank登录号为FJ848869)分别具有1101bp、1098bp、1071bp的开放阅读框,各自编码366、365和356个氨基酸。GhCOMT1、GhCOMT2和GhCOMT3在棉花各个组织中都有表达,GhCOMT1和GhCOMT2在根部的表达量最高,GhCOMT3在茎中表达量最高。SDS-PAGE电泳分析表明,3个蛋白的最佳诱导表达条件均为0.2mmol·L-1IPTG在37℃下诱导6h。【结论】从棉花中克隆了3个木质素合成关键酶基因GhCOMT1、GhCOMT2和GhCOMT3,为进一步的生物学功能研究及其应用奠定了基础。     

棉纤维特异表达蓝铜蛋白基因(GhBCP1)的克隆与鉴定

【目的】对从棉纤维细胞分离获得的基因GhBCP1进行序列和表达分析,初步分析其功能。【方法】采用mRNA荧光差异显示结合cDNA末端快速扩增技术克隆基因全长cDNA序列,用生物信息学方法对获得的cDNA序列及推定氨基酸序列进行分析,并用荧光实时定量PCR法研究基因在不同组织中的表达。【结果】克隆了一个棉纤维特异表达基因的全长cDNA,命名为GhBCP1(GenBank登录号:EF222282),该cDNA全长721bp,含有一个编码176个氨基酸蛋白的开放阅读框。BLAST分析表明该基因所编码产物为一个蓝铜蛋白。Southern杂交分析表明该基因在陆地棉(Gossypium hirsytum L.)中有2个拷贝。实时荧光定量PCR分析发现该基因在棉花纤维细胞特异表达,在纤维发育过程中,GhBCP1转录产物的累积主要发生在纤维细胞发育由伸长向次生壁合成转换阶段。【结论】GhBCP1基因的组织特异性和发育阶段性表达初步证明该基因的功能可能与次生壁合成的起始密切相关。     

棉花精氨琥珀酸合成酶基因GhASS1的克隆及表达分析

【目的】克隆棉花精氨琥珀酸合成酶基因GhASS1的cDNA序列,并利用原核表达系统高效表达融合蛋白,检测融合蛋白的精氨琥珀酸合成酶活性及其表达对工程菌生长、耐盐能力及与游离L-瓜氨酸（L-Cit）和L-精氨酸（L-Arg）含量的影响,为解析该基因的功能及作用机制奠定基础。【方法】以拟南芥推断的精氨琥珀酸合成酶cDNA序列作为探针,利用电子克隆和RT-PCR技术,从棉花幼叶中获得cDNA片段,T/A克隆测序后得其序列信息,利用生物信息学软件分析其DNA结构、蛋白质结构、功能域和同源性,并构建系统进化树。利用qRT-PCR检测其在盐胁迫下的表达模式;将GhASS1的开放阅读框连接到原核表达载体pCold-TF上,构建融合表达载体pCold-GhASS1,转化到大肠杆菌Rosetta(DE3)plysS中进行IPTG诱导表达,利用SDS-PAGE法测定表达产物分子量,焦磷酸荧光法测定酶活性和比活力,HPLC法测定工程菌中L-Cit和L-Arg的含量,对比不同温度和不同NaCl浓度下工程菌与对照菌的生长速度及其体内L-Cit、L-Arg含量及L-Arg/L-Cit。【结果】棉花GhASS1存在于D基因组的第1染色体上,由10个外显子和9个内含子构成,其cDNA全长序列共1 584 bp,其中5′非翻译区22 bp,开放阅读框1 485 bp,3′端非翻译区77 bp,编码产物由494个氨基酸组成,推断分子量为54 kD,等电点6.74;序列比对分析表明GhASS1与大肠杆菌、酵母和拟南芥中同源蛋白序列一致性分别为21.81%、41.1%和78.5%,且具有典型的精氨琥珀酸合成酶结构模序;系统进化分析显示GhASS1与番茄、马铃薯和烟草中同源蛋白亲缘关系最近,而与云杉、卷柏中同源蛋白亲缘关系最远;盐胁迫可上调叶片中GhASS1的表达,1 d时达到峰值,随后逐渐下降,推测GhASS1参与棉花对盐胁迫的早期响应。表达载体pCold-GhASS1在工程菌中表达的融合蛋白分子量约108 kD,与预期相符,在体外具有精氨琥珀酸合成酶活性;与对照菌相比,pCold-GhASS1工程菌中游离L-Cit含量下降,L-Arg含量上升,且在生长周期中较快进入对数生长期;在含高浓度NaCl的培养基中pCold-GhASS1工程菌表现出更强的生长活力和较高的L-Arg/L-Cit值,显示了其具有较强的L-Cit向L-Arg的代谢流。【结论】从棉花中克隆了植物精氨琥珀酸合成酶基因cDNA序列GhASS1,推测其在植物体内可参与植物的生长和耐盐能力的调控。     

月季丁香酚合成酶基因RhEGS1的克隆及表达分析

【目的】克隆月季丁香酚合成酶基因RhEGS1的全长cDNA序列,分析其序列及表达特征,并对该基因编码的蛋白进行原核表达分析,为深入探讨丁香酚合成酶的生化特性奠定基础。【方法】根据已发表的其它植物EGS基因序列的保守结构域设计简并引物,结合RACE技术,获得RhEGS1的全长cDNA序列,并进行生物信息学分析;利用半定量RT-PCR对不同组织及不同花发育时期RhEGS1进行表达分析。采用Gateway克隆技术,构建原核表达载体,并进行原核蛋白表达。【结果】月季RhEGS1 的cDNA全长为1 207 bp,包含一个927 bp的ORF,编码309个氨基酸。同源序列比对发现RhEGS1与仙女扇的CbEGS2有83.87%的同源性,与矮牵牛PhEGS1具有81.55%同源性。表达谱分析表明,RhEGS1主要在雄蕊中表达, 且在花盛开期表达最强,而在花蕾期及凋谢期表达较弱。原核表达分析发现,在37℃、0.5 mmol•L-1 IPTG 诱导4 h 后,携带RhEGS1 ORF 的原核表达载体在大肠杆菌中生成了大量的分子量约为35 kD 的蛋白质,其分子量大小与预测的理论值相一致。【结论】从月季雄蕊中克隆到丁香酚合成酶基因RhEGS1,具有EGS基因的结构特征和完整的编码框,且在盛开期雄蕊中表达量最高。     

海岛棉GbCO基因的克隆和表达分析

[目的]海岛棉GbCO基因的克隆和表达分析.[方法]利用RT-PCR技术,从海岛棉中克隆CONSTANS(CO)的同源基因,利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术分析基因的组织表达.[结果]从新海14号花后9d的纤维中克隆得到了一个棉花CO蛋白基因,命名为GbCO.GbCO cDNA的ORF为1 008 bp,编码335个氨基酸.序列分析表明GbCO和GhCO的相似性只有78.2;,棉花CO蛋白同蓖麻RcCO、苹果MaCO等亲缘关系较为接近.qRT-PCR结果表明,GbCO基因在棉花的根、茎、叶、花瓣等组织中均有表达,但在叶片中的表达相对较高.并且CbCO在棉花胚珠及纤维发育的起始和伸长阶段都有表达,在开花前1d和开花后5d的胚珠中表达量很高.GbCO基因的表达受到光周期的调节,在夜间表达量高于白天.[结论]GbCO基因可能在陆地棉的开花发育中起着重要的作用.     

编码棉花胞质铜锌超氧物歧化酶基因的克隆与表达分析

 【目的】克隆编码棉花胞质铜锌超氧化物岐化酶基因并分析其表达特性。【方法】采用 RACE 技术克隆基因，Northern blotting 检测基因的表达谱；采用氮蓝四唑（NBT）光下还原法测定不同生育期的酶活性。【结果】获得了棉花胞质铜锌超氧化物岐化酶基因cDNA 全长序列（GenBank 注册号：DQ445093）；该基因cDNA全长共682 bp，开放阅读框456 bp，编码152个氨基酸。分子结构预测结果：酶蛋白理论分子量约为15.03 kD，理论等电点为6.09，与其它植物的蛋白质氨基酸序列同源性在82%～87%之间。Southern blotting显示不同棉种该基因的拷贝数基本一致，均属于低拷贝基因。Northern blotting显示该基因在不同的组织、不同的生育期表达量不同；酶活性测定显示盛花期最高。【结论】棉花胞质铜锌超氧化物岐化酶基因在陆地棉中属于低拷贝数基因；在整个生育期中mRNA的含量呈规律性动态变化，前期较低，后期较高，在盛花期达到顶峰；变化曲线与不同时期的酶活性变化一致；不同器官的基因表达检测结果显示：基因在根中表达量最高，叶片次之，花中的表达最低。     

Cloning and Expression Analysis of a Brassinosteroid Biosynthetic Enzyme Gene, GhDWF1, from Cotton （Gossypium hirsuturm L.）

Brassinosteroids （BRs） are an important class of plant steroidal hormones that are essential in a wide variety of physiological processes. To determine the effects of BRs on the development of cotton fibers, through screening cotton fiber EST database and contigging the candidate ESTs, a key gene （GhDWF1） involved in the upstream biosynthetic pathway of BRs was cloned from developing fibers of upland cotton （Gossypium hirsutum L.） cv. Xuzhou 142. The full length of the cloned cDNA is 1 849 bp, including a 37 bp 5＇-untranslated region, an ORF of 1 692 bp, and a 120 bp 3＇-untranslated region. The cDNA encodes a polypeptide of 563 amino acid residues with a predicted molecular mass of 65 kD. The deduced amino acid sequence has high homology with the BR biosynthetic enzyme, DWARF1/DIMINUTO, from rice, maize, pea, tomato, and Arabidopsis. Furthermore, the typical conserved structures, such as the transmembrane domain, the FAD- dependent oxidase domain, and the FAD-binding site, are present in the GhDWF1 protein. The Southern blot indicated that the GhDWF1 gene is a single copy in upland cotton genome. RT-PCR analysis revealed that the highest level of GhDWF1 expression was detected in 0 DPA （day post anthesis） ovule （with fibers） while the lowest level was observed in cotyledon. The GhDWF1 gene presents high expression levels in root, young stem, and fiber, especially, at the fiber developmental stage of secondary cell wall accumulation. Moreover, the expression level was higher in ovules （with fibers） of wildtype （Xuzhou 142） than in ovules of fuzzless-lintless mutant at the same developmental stages （0 and 4 DPA）. The results suggest that the GhDWF1 gene plays a crucial role in fiber development.     

Molecular Identification and Expression Analysis of GhHYDRA 1 Gene,a Homologue of HYDRA1 Gene From Upland Cotton （Gossypium hirsutum L.）

Beside as precursors of BRs biosynthesis,more and more evidences supposed that phytosterols play an important role in plant growth and development.To investigate the effects of phytosterols on the fiber development of upland cotton(Gossypium hirsutum L.)and the molecular base of sterol regulating cotton fiber growth,a homologue of HYDRA1 was cloned from upland cotton(cv.Xuzhou 142)by screening cotton fiber EST database and contigging the candidate ESTs.The GhHYDRA1 encoded a polypeptide of 218 amino acid residues and the deduced amino acid sequences had high homology with the members of HYDRA1 in Populus trichocarpa,Solanum tuberosum,and Arabidopsis thaliana.Moreover,GhHYDRA1 had comparable transmembrane regions to AtHYDRA1 in sequence,length,order,and spacing,except for a C-terminal polylysine cluster.Quantitative real-time RT-PCR analysis revealed that the higher expression levels of GhHYDRA1 gene were detected in 6 to 12 DPA(days post anthesis)fibers,while the lower levels were observed in 0 DPA ovule(with fibers)and 16 to 18 DPA fibers.These results indicated that GhHYDRA1 is the homologue of HYDRA1 gene and plays a crucial role in fiber elongation.Furthermore,auxin and BL up-regulated the expression level of GhHYDRA1 while ABA and KT down-regulated the expression level of GhHYDRA1 in cotton ovule and fiber growth.The result suggested that phytosterols play a role in the interaction of plant hormones.     

荧光实时定量PCR研究GA负调控因子基因在棉花纤维不同发育时期的表达模式

棉花纤维发育经历起始期、延伸期、次级细胞壁加厚期、脱水期共4个发育时期。为了了解GA负调控因子基因在整个纤维发育时期的调节作用,采用敏感的实时定量PCR对GA负调控因子基因Gh RGL在棉花纤维不同发育时期中的转录水平进行了定量研究,通过提取来源于不同纤维发育阶段[包括-3~0 DPA(开花后)胚珠,3 DPA胚珠,5 DPA胚珠,10 DPA胚珠,15 DPA纤维,25 DPA纤维]的样品总RNA,探讨不同发育时期Gh RGL基因的表达模式。结果显示,Gh RGL基因在所有被选的样品中都有表达,其中在5 DPA胚珠和10 DPA胚珠中转录水平较高,在10 DPA胚珠中表达水平最高,在-3~0 DPA胚珠、3 DPA胚珠、15 DPA纤维、25 DPA纤维中的表达水平较低,表明Gh RGL基因在纤维伸长期表达水平较高,暗示Gh RGL可能对纤维伸长起着重要作用。     

棉花GhGT-2转录因子的克隆及其功能分析

【目的】棉花是重要的纤维作物,其生长常遭受非生物逆境危害,严重影响棉花的生长和产量。Trihelix转录因子在植物抵御各种逆境胁迫中扮演重要作用。克隆棉花Trihelix转录因子基因并分析其表达特性和功能,为最终利用转基因手段改良棉花抗逆性奠定基础。【方法】通过BLAST分析比对,从棉花EST数据库中获得1个高度同源基因,通过基因序列分析,发现其属于Trihelix转录因子GT-2亚家族,命名为GhGT-2。以棉花叶片总RNA为模板,根据EST序列设计引物,利用RT-PCR结合RACE技术,获得GhGT-2的编码序列。使用MEGA5对蛋白序列及其同源序列进行多序列比对分析,并构建同源物种间系统进化树,通过SMART网站（http://smart.embl- heidelberg.de/）进行蛋白结构预测。以陆地棉品种新陆早26号为研究材料,在棉花15 d苗龄时（一对真叶期）,分别对其植株进行非生物胁迫和ABA处理0、1、3、6和12 h,然后采集相应时段棉苗叶片。另外采集同一品种棉花的不同发育时期的根、茎、叶、花、开花后当天胚珠以及开花后12 d（12 days post anthesis,DPA）纤维等不同组织样品,利用实时荧光定量PCR方法分析GhGT-2在棉花不同组织间的表达差异及其在低温、干旱、高盐和ABA处理下的表达模式。将GhGT-2克隆至GFP表达载体pBI221,和GAL4 DNA结合结构域载体,在拟南芥原生质体中验证GhGT-2在细胞内的定位情况和转录激活活性。利用凝胶迁移试验（EMSA）检测DNA结合元件。【结果】克隆了棉花GhGT-2的cDNA全长序列。该基因cDNA全长1 579 bp,开放阅读框为1 428 bp,编码475个氨基酸的蛋白,推导编码蛋白质的分子量为54.07 kD,等电点为8.96。SMART蛋白结构预测发现,该蛋白含有2个Trihelix家族典型的SANT蛋白结合域。系统进化树分析表明,GhGT-2属于Trihelix转录因子GT-2亚家族,与拟南芥AtGTL1、白杨PtaGTL1 GT2-Box、GT3-Box、GT-1b（BoxⅡ）和MYB元件MBS1、MRE1、MRE3、MRE4亲缘关系最近。实时荧光定量PCR表明,GhGT-2在棉花的根、茎、叶、花、开花后当天胚珠以及开花后12 d（12 DPA）纤维中均有表达,其中,在叶中表达量最高,在根中表达量最低。在冷胁迫下,GhGT-2除在3 h时表达量接近0 h外,在1、6和12 h的表达量均低于0 h,呈现抑制表达特征。在高盐、干旱和ABA处理3种胁迫下,GhGT-2在1 h的表达量均低于0 h,但3、6和12 h的表达量均高于0 h,表现为先抑制后上调表达特征。推测该基因可能参与棉花ABA信号通路中对逆境胁迫的抗性反应。利用拟南芥原生质体分析,GhGT-2主要定位于细胞核中,转录激活活性不明显。凝胶阻滞（EMSA）分析发现,GhGT-2可以结合GT元件。【结论】获得棉花GhGT-2的全长cDNA序列,其编码蛋白含有2个SANT蛋白结合域,属于棉花Trihelix转录因子GT-2亚家族。在干旱、高盐和ABA逆境胁迫下,GhGT-2属于依赖于ABA胁迫响应基因调控网络,推测GhGT-2在陆地棉的非生物胁迫适应过程中可能具有重要的作用。     

棉花3个脂肪酸碳链延长基因的cDNA克隆和表达分析

【目的】克隆棉花脂肪酸合成碳链延长的3个重要基因,分析它们的基因表达及其对逆境胁迫的反应,为棉花高油分育种和抗逆育种提供候选基因。【方法】采用同源克隆的方法,克隆陆地棉脂肪酸合成碳链延长3个重要基因GhKAR、GhHAD和GhENR的cDNA全长;应用生物信息学方法,分析克隆基因编码蛋白的特性;通过RT-PCR,分析目标基因的组织表达特征、时空表达水平和非生物胁迫条件下的表达特性。【结果】GhKAR和GhENR属于NADB Rosemann超基因家族,GhHAD属于hotdog超基因家族;GhKAR、GhHAD和GhENR的cDNA全长分别为1 119、906和1 318 bp,分别编码283、221、394个氨基酸;它们在根、茎、叶及胚珠发育不同时期均有表达。3个基因在高油材料中的基因表达水平都高于低油材料;20DPA（days post anthesis）到30DPA是高低油材料油分积累的主要时期,而30DPA到成熟期是高低油材料油分含量差距产生的关键时期。20DPA低油材料3个基因均有一个表达低值,高油材料基因表达量则持续升高;30DPA时表达量达到最高,其中,对于GhHAD和GhENR的表达量,棉花高油材料为低油材料2倍以上。不同非生物胁迫的诱导表达分析表明,GhKAR、GhHAD和GhENR都不同程度地受低温诱导,GhKAR和GhHAD在ABA诱导时上调表达,但都不受MeJA诱导表达;而GhENR在MeJA诱导2 h时上调表达,之后逐渐下调,受ABA诱导不明显。【结论】获得了GhKAR、GhHAD、GhENR 3个基因cDNA全长,通过基因表达特征分析,3个基因的表达可能对种子油分积累起着重要作用,同时在棉花抗逆方面也起一定的生理作用。     

棉纤维起始分化期基因枪介导的GhSuSy表达分析

蔗糖合酶(sucrose synthase)通过调节植物糖代谢介导棉纤维的起始和发育。为进一步研究棉纤维起始分化过程中蔗糖合酶的转录调控机制,克隆了GhSuSy基因5'端上游2 000 bp的启动子片段,构建了含LUC荧光报告基因的重组载体,采用基因枪瞬时转化技术,把重组载体DNA分别转化到棉花叶片和花瓣,比较分析了不同载体膜压力、不同轰击距离与孵育时间等条件下的荧光素酶(luciferase,LUC)活性。用优化后的条件检测了棉纤维起始分化期蔗糖合酶基因GhSuSy偶联的LUC在叶片和花瓣中的活性,并与GhSuSy表达、蔗糖合酶活性比较分析。结果显示:-0.09 MPa真空度下,可裂膜压力设为6.80 MPa,载体膜距离叶片7 cm,轰击2次转化效率最高,转化后样品孵育16 h左右LUC荧光信号最强;与叶片中LUC表达相比,花瓣中LUC荧光信号强、活性高,特别是开花当天(0 d)和开花后1 d(1 DPA)差异明显;在纤维起始分化的开花前3 d(-3 DPA)到开花后3 d(3 DPA),叶片和花瓣中LUC活性先升高后降低,在0和1 DPA的LUC活性最高,这一结果与GhSuSy的定量分析、蔗糖合酶活性检测结果趋于一致,同时纤维起始时期胚珠中GhSuSy的表达和蔗糖合酶活性也显著升高。这些结果暗示GhSuSy基因或编码的蔗糖合酶在0和1 DPA可能调控了棉纤维的起始和分化,表明基因枪介导的瞬时转化系统可用于进一步的GhSuSy基因启动子转录调控分析。     

陆地棉Ghuhrf1基因及其启动子的克隆与功能分析

在分子育种过程中，优良基因和组织特异表达启动子的缺乏是制约棉花纤维品质改良的重要因素之一。分析转录组数据库中差异基因表达谱发现，Ghuhrf1为开花当天胚珠优势表达基因，推测该基因可能参与或调控棉纤维的合成。根据其EST序列设计引物，通过RACE技术获得Ghuhrf1基因的全长cDNA序列。荧光定量PCR分析表明，Ghuhrf1在开花当天的胚珠中显著表达。通过同源序列分析获得Ghuhrf1的上游启动子Ghuhrf1 Pro。Ghuhrf1 Pro全长为1 417 bp，含有GC box、CAAT box、CAT box、CCGTCC box和ACGT motif等顺式作用元件和组织特异性调控元件。根据组织特异性调控元件的分布位置构建了4个不同程度的缺失体转化烟草和拟南芥进行分析。GUS组织化学染色结果表明，全长启动子Pro和缺失体Pro1（-1 180～+226 bp）、Pro2(-867～+226 bp)、Pro3(-726～+226 bp)都能特异地驱动Gus基因在转基因拟南芥的叶片边缘尖部和莲座叶基部等分化生长旺盛部位表达，说明与分生组织表达相关的CAT box元件和CCGTCC box元件在启动子种子特异表达中起到重要的作用。同时，通过启动子缺失分析也表明，Ghuhrf1基因可能不是直接参与棉纤维的合成，而是间接的参与棉纤维原始细胞分化起始的调控。该结果为棉花纤维品质基因Ghuhrf1的功能研究提供了参考，并为棉花分子育种工程提供了新的调控元件。     

棉花GhPME1和GhPME2基因的克隆及表达分析

本研究旨在对棉花来源的果胶甲酯酶基因进行克隆和功能分析。通过RACE技术克隆了2个棉花果胶甲酯酶基因的cDNA,命名为GhPME1和GhPME2。序列分析发现:GhPME1和GhPME2的最大开放阅读框分别为1 704和1 752bp,分别编码含有567和582个氨基酸的蛋白质。蛋白质结构预测显示这2个蛋白结构相似,包含PMEI和Pectinesterase结构域。RT-PCR和实时荧光定量PCR结果显示在陆地棉的纤维发育过程中,GhPME1和GhPME2的表达峰值分别在9和4DPA(开花后天数),然后依次降低。而在海岛棉纤维中,这2个基因的表达均呈现逐渐上升的趋势,表达峰值分别出现在开花后24和29DPA。GhPME1和GhPME2在海岛棉和陆地棉棉纤维中的表达差异初步证明该基因家族的功能可能与棉纤维品质相关。