橡胶树对条溃疡病的抗性和施用乙烯利提高抗性原因的探讨

在橡胶树受条溃疡菌(Phytophthora sp.)侵染后的某个时间,在受侵染组织周围会形成一个肉眼可见的深褐色层——褐变层。实验表明,(1)褐变层形成以后病斑即停止扩展;(2)形成褐变层后受侵染组织中的病原仍然是生活的;(3)原病斑形成褐变层后,在靠近它的地方进行再接种,结果新的病斑不能扩展到原病斑的褐变层。根据这些事实,我们认为褐变层在限制侵染扩展中起主要的作用。施用乙烯和限制侵染扩展的原因在于它使褐变层的形成较为迅速,所以能更有效地阻止病斑的扩展。     

褐皮病橡胶树休割期病害径向扩展的超微结构研究

光学和透射电子显微镜观察证实了褐皮病橡胶树在休割期间病害能够从老的病组织沿着径向扩展到形成层新产生的组织。在病害扩展过程中乳管最先表现出症状。感病乳管最初可见的超微结构症状是:除了一些橡胶粒子原位凝固外,还形成相当多的髓鞘状结构和在细胞核中出现细纤维。作者认为,关于橡胶树褐皮病的起因和扩展机制的流行观点很难解释这种休割褐皮病树的径向扩展。     

胶孢炭疽菌侵染橡胶树叶片染色方法的建立及显微观察

本研究建立了一种橡胶树叶片中胶孢炭疽菌的染色方法,通过显微观察明确胶孢炭疽菌在橡胶树叶片中的侵染结构,为橡胶树炭疽病的预测预报提供理论依据。在脱色剂（0.15%三氯乙酸乙醇溶液∶氯仿=5∶1）处理12 h,1%刚果红染色剂抽滤染色3 h的条件下,能清晰观察到胶孢炭疽菌在橡胶树叶片上的发育进程和侵染结构。结果表明,在28 ℃、100%相对湿度培养条件下,接种橡胶树淡绿期叶片2~6 h为分生孢子萌发高峰期,12 h后分生孢子萌发率大于85%;8~12 h为附着胞形成高峰期,接种12 h约75%的芽管顶端产生附着胞,少数附着胞中央部位开始形成侵染钉;24 h为侵染钉形成高峰期,同时分生孢子萌发形成多个芽管;36 h时附着胞顶端再次萌发产生次级附着胞,从而进一步侵染周围细胞,叶片出现零星病斑;48 h时芽管不断分支异化成菌丝并产生次级分生孢子,叶片出现大量典型的炭疽病病斑;72 h后菌丝在叶片表面纵横扩展,随机分支,逐步形成网状分布。随着菌丝的扩展,叶片组织发生一系列的病理变化,侵染部位组织出现褐色坏死病斑。本研究建立了一种着色效果好,简便易行,经济有效的橡胶树叶片中胶孢炭疽菌的染色方法,进一步明确了胶孢炭疽菌的侵染结构。     

香蕉枯萎病菌1号和4号生理小种菌株侵染和定殖巴西蕉和粉蕉根系的观察

尖孢镰刀菌古巴专化型1号和4号生理小种菌株对巴西蕉和粉蕉的致病性不同,其在巴西蕉和粉蕉根系的侵染和定殖过程是否不同仍未阐明。笔者将绿色荧光蛋白标记的1号（T320）和4号（B2-63）生理小种菌株分别接种巴西蕉和粉蕉,借助激光共聚焦显微镜观察侵染过程。发现这2个生理小种菌株菌丝均可沿巴西蕉和粉蕉根系表层细胞之间的凹槽生长,并进一步侵入维管束;而且B2-63侵入粉蕉根系维管束快于其侵入巴西蕉根系维管束。在接种T320 菌株15 d后,在轻微褐变的巴西蕉球茎组织中未观察到其菌丝体,而在褐变粉蕉球茎中可观察到。推测T320在粉蕉根系维管束中的扩展较其在巴西蕉根系维管束中的扩展容易。结果为进一步研究尖孢镰刀菌古巴专化型生理小种与不同基因型香蕉的互作奠定基础。     

橡胶树丛枝病及其与褐皮病关系的研究

丛枝病在橡胶树小苗、幼树及开割的实生树或芽接树上均有发生,苗圃小苗和开割树的平均发病率分别为0.32%和0.96%。植株罹病后出现丛枝,病枝末端呈不规则的弯曲等畸形症状。病枝经常过早干枯。芽接传病试验结果,橡胶丛枝病潜育期为21个月,芽接传病发病率为22%左右。芽接丛枝病树(4龄)开割后,出现不同程度的褐皮病干皮。用四环素、青霉素及保01等农药处理离体病枝或药液浸泡芽条,对橡胶树丛枝病的病原均有一定的抑制作用。在电镜下,可以观察到橡胶丛枝病嫩枝小叶柄的韧皮部筛管细胞中有典型的类菌原体(MLO)及球形,椭圆形的类立克次氏体(RLO)。MLO大小为78～720nm,RLO大小为390～920nm,限界膜厚度约为20nm。未发现健树上有上述菌体存在。血清学的试验结果表明,橡胶树丛枝病与橡胶树褐皮病有亲缘关系。上述研究结果表明,橡胶树丛枝病是由MLO和RLO混合侵染引起的传染性病害,而用丛枝病芽片嫁接健康苗木又能引起丛枝病和褐皮病。因此,增殖苗圃丛枝病芽条是大田褐皮病的重要初侵染来源之一。     

施用乙烯利对提高巴西橡胶树抗条溃疡病的作用

在橡胶树高部位未割胶树皮上刮皮涂乙烯利乳剂(含乙烯丰1～10％),然后在紧挨涂药带上方或下方铲皮接种条溃疡病菌丝,结果表明,施用乙烯利明显地提高了橡胶树对条溃疡病扩展的抵抗能力。     

椰心叶甲感染绿僵菌后的组织病理变化

对感染绿僵菌的椰心叶甲幼虫进行组织切片观察,结果表明,绿僵菌可通过体壁及气门侵染虫体,其中经体壁侵染是主要的方式。接菌后第1天即可在血腔中发现菌丝段,感染早期可见大量血细胞在皮细胞层下聚集,血腔中的菌丝段随血液循环到达各组织器官,并可逐渐侵入脂肪体、肌肉、食道、气管、唾腺等组织,被侵染组织器官的结构均遭到不同程度的破坏。     

12种杀菌剂对橡胶树褐根病菌的毒力测定

采用菌丝生长速率法测定了12种杀菌剂对3株橡胶树褐根病菌的抑菌能力。结果表明：百菌清、腈菌唑、咪鲜胺、三唑酮、戊唑醇、异菌脲、抑霉唑、十三吗啉、丙环唑9种药剂对橡胶树褐根病菌的毒力较强,抑菌效果较好,对橡胶树褐根病菌的EC50在0.013 2～2.972 6 μg/mL,其中丙环唑和戊唑醇的EC50均小于0.1 μg/mL,对橡胶树褐根病菌的抑制效果最佳;嘧菌酯、甲基硫菌灵的效菌效果较差;多菌灵对褐根病菌的抑制效果最差,3株褐根病菌的EC50在138.655 0～492.298 2 μg/mL。     

乙烯丰诱导橡胶树对条溃疡病抗性的超微结构

用透射电镜技术研究了柑桔褐腐疫霉(Phytophthora citrophthora)引起的橡胶树(Hevea brasiliensis Mull.Arg.)无性系 RRIM600条溃疡病,比较了正常树皮(即不施乙烯丰树皮)和施用乙烯丰(2—氯乙基磷酸,乙烯释放剂)树皮接种后菌丝的侵染和寄主细胞的反应。在正常树皮中,菌丝主要在寄主细胞间生长并引起细胞壁分解。菌丝也常常垂直穿透寄主细胞壁而在细胞内形成吸器和细胞内菌丝。当开始垂直穿透时,寄主细胞壁常常形成乳头状突起。吸器具有吸器外基质(extrahaustorial matrix),也常常具有领(collar)。施用乙烯丰的树皮病斑比正常树皮上的较早停止扩展而且病斑小得多,但是未发现菌丝侵染和寄主细胞反应的方式有明显差别。据用商品纤维素酶和果胶酶对树皮细胞壁试验,乙烯丰处理的树皮比正常树皮较能抵抗这些酶的分解。这些事实表明,乙烯丰诱导的寄主细胞的变化使菌丝侵染延迟,但并未杀伤病原,也没有完全阻止穿透。     

黑胫病菌（Leptosphaeria biglobosa）在油菜叶片和茎中的侵染过程观察

为明确黑胫病菌（Leptosphaeria biglobosa）在甘蓝型油菜叶片和茎中的侵染及扩展过程，利用绿色荧光蛋 白（GFP）标记的黑胫病菌株接菌油菜叶片，利用激光共聚焦显微镜观察菌株在油菜叶片和茎中的侵染过程。结果 表明，接种油菜叶片7 h后，分生孢子萌发并长出芽管；17 h后，芽管侵入气孔；24 h后，分生孢子全部萌发；36 h后萌 发的芽管形成菌丝；120 h后，菌丝在叶片表皮细胞间隙蔓延，并侵入叶肉细胞。13 d后，菌丝侵入茎部皮层组织； 15 d后，菌丝在皮层细胞间隙蔓延，并侵染至茎表皮；21 d后，菌丝侵染至维管组织；23 d后，菌丝侵染至茎韧皮部； 25 d后，茎导管被侵染，并向木质部扩展。本研究发现的L. biglobosa 在油菜叶片和茎中的侵染过程，可为油菜与黑 胫病菌互作的研究、黑胫病致病机理及防治提供参考。     

橡胶树褐根病病原菌生物学特性研究

对橡胶树褐根病病原菌Phellinus noxius Corner生物学特性进行研究.结果表明,菌丝生长的最适温度为28℃,最适pH值为6～7,该菌可有效地利用部分碳源和氮源,碳源以D-果糖和酵母浸出液最好,氮源以L-天门冬酰胺最好.光照处理对菌丝的生长有明显影响,黑暗利于菌丝生长,光照和黑光有抑制作用.菌丝的致死温度为55℃,10 min.     

甘蔗梢腐病轮枝镰刀菌侵染甘蔗叶片的显微观察

轮枝镰刀菌(Fusarium verticillioides)是引起甘蔗梢腐病的主要病原真菌之一。利用苯胺蓝染色法,对轮枝镰刀菌分生孢子在甘蔗叶片上的侵染过程进行显微观察,发现在28℃保湿条件下,24 h分生孢子形成芽管,48 h芽管发育为菌丝,从气孔或毛状体侵入叶片,之后菌丝在气孔下腔细胞处及毛状体细胞内增殖,并缠绕在气孔及毛状体周围,然后进一步侵染周边细胞;72 h菌丝从气孔往外伸出,96 h受侵染组织坏死。     

油菜菌核病菌致病机理的研究 Ⅱ.病菌侵染过程的组织病理学

本文研究了菌核病菌(Sclerotinid Sclerotiorum)侵染油菜叶片的组织病理学。其侵染过程包括:叶片表面侵染垫的形成,寄主表皮的机械直接侵入,侵染菌丝(平均直径16.4μm)的胞间扩展以及分枝菌丝(平均直径7.8μm)的胞间胞内扩展。结果还证实了木质部导管腔内及叶片其它部位菌丝体周围形成草酸盐晶体以及耐、感品系病菌侵染的差异。     

玉米弯孢菌侵染过程的组织学观察

采用组织透明技术,研究了亲合性互作体系中新月弯孢菌在玉米叶片上的侵染过程。结果表明,接种2 h后分生孢子即可萌动,4、6 h的萌发率分别为80%和99%,12～24 h之间侵染丝从细胞间隙和气孔侵入表皮细胞,穿透细胞壁在细胞间迅速扩展。侵染丝穿透寄主细胞壁时菌丝明显变细。菌丝在穿过气孔时,气孔结构明显被破坏,保卫细胞被降解。接种3 d后,病菌从气孔或细胞间隙伸出,形成分生孢子梗和分生孢子,叶片表现明显症状。     

橡胶树褐根病菌的分子检测

利用褐根病菌的一对特异性引物G1F/G1R,对不同来源橡胶树褐根病菌菌株的r DNA-ITS区进行PCR扩增,对发病组织进行分子检测,并构建橡胶树褐根病菌系统发育树。结果表明:10株不同来源橡胶树褐根病菌菌株DNA均能扩增出一条653 bp的特异性片段,而橡胶树红根病菌、紫根病菌、臭根病菌、白根病菌和清水对照均无扩增条带。发病组织检测结果表明,该引物能特异性检测到橡胶树褐根病菌的存在。引物对基因组DNA检测灵敏度为100 ag/μL。基于r DNA-ITS系统发育分析结果表明,供试菌株与Gen Bank中的菌株KF233592、KM079591聚在同一分支上,其亲缘关系最近,均属于Phellinus noxius。     

巴西橡胶树HbMlo8基因的功能研究

Mlo基因是植物体内具有负向调控功能的一类基因。为揭示Hb Mlo8基因在橡胶树中的功能,分析了该基因在巴西橡胶树不同组织中的表达情况,在机械损伤、干旱、白粉菌侵染、ABA、ETH、JA和H_2O_2处理下的表达模式。结果表明:Hb Mlo8基因在橡胶树的树皮、胶乳、花和叶中均有表达,主要在树皮和花中表达。机械损伤、干旱、白粉菌侵染均会使Hb Mlo8在橡胶树叶片中的表达量显著上调。橡胶树叶片中Hb Mlo8基因在ETH处理早期下调表达,处理10 h后开始显著上调。在ABA、H_2O_2和JA处理下,Hb Mlo8基因均呈现下调表达现象。说明Hb Mlo8可能参与橡胶树对白粉菌和非生物胁迫的响应过程以及激素信号转导路径,为阐明Hb Mlo8基因在橡胶树生长和逆境响应机制中的功能研究打下良好基础。     

基因型对橡胶树胚状体遗传转化瞬时表达影响的研究

侵染后抗性胚状体诱导频率低是影响橡胶树遗传转化发展的主要原因,而橡胶树次生体胚发生体系具有体胚增殖效率及植株再生率高的优点。以3个综合性状优良的橡胶树无性系次生体细胞胚状体为受体,研究其对根癌农杆菌的耐侵染能力、GUS基因的瞬时表达情况,探讨不同无性系胚状体对农杆菌转化的反应。结果表明：3个无性系农杆菌污染情况无显著差异,长菌的外植体经无菌水和抗生素水洗涤3 d后即可恢复生长;侵染后每30个胚褐化了1.2～5个胚,占侵染总胚数的4.00%～16.67%,品种间褐化面积无显著差异;热研87-6-62的总蓝斑数显著高于其它2个无性系,平均每个胚染上14.29个蓝斑,热研7-33-97和PR107稍差,但每个胚也能分别染上8.14和8.72个蓝斑。因此3个无性系均可以胚状体作为遗传转化的受体。此结果对利用胚状体为受体改良橡胶树优良无性系奠定良好基础。     

借助ITS序列用GFP标记巴西橡胶树棒孢霉落叶病病原菌

由多主棒孢菌(Corynespora cassiicola)侵染引起的巴西橡胶树棒孢霉落叶病是影响橡胶树产胶量的主要病害之一。为了开展该病原菌在活体叶片中的病理学研究,本实验将绿色荧光蛋白gfp基因表达盒插入了多主棒孢菌经定点突变后的ITS序列中,构建了重组质粒p ITGH,并经PEG介导转化了原生质体,获得了GFP标记的多主棒孢菌转化子,所获得的转化子经过连续7次转接培养后仍能在分生孢子、分生孢子梗、芽管和菌丝中稳定地发出强烈的绿色荧光,其生长特性和致病性与野生菌株无明显差异。     

两种镰刀菌引起的橡胶树病害

报道云南西双版纳新发生由镰刀菌引起的橡胶树基腐病、橡胶树茎干褐腐病的初步研究结果。     

茎点霉真菌Phoma adianticola引起的一种茶树新病害

对一种引起茶树芽头褐变的病原进行了分离鉴定研究。通过柯赫氏法则,成功分离得到了致病菌株。菌株PDA培养条件下的形态学和rDNA-ITS分子鉴定结果表明,此病原菌为茎点霉属真菌。按照茎点霉属真菌鉴定程序开展了鉴定研究。此菌在OA和MA培养基上培养7 d后,菌落平均直径6.0~6.4 cm;分生孢子器圆球形,具孔口,器外壁光滑或有菌丝附着;分生孢子橄榄球形,无隔,多数具2个游球,大小为4.9~6.3μm×2.1~2.8μm;NaOH颜色反应呈黄绿色。根据上述特征,初步鉴定此病原菌为Phoma adianticola。由P.adianticola引起的茶树芽头褐变可能是茶树的一种新病害。根据此菌侵染后的症状,暂将其表述为茶树褐芽病。