茶树咖啡碱合成酶CRISPR/Cas9基因组编辑载体的构建

CRISPR/Cas9技术是一门新兴的基因组定点编辑技术,具有操作简单、高效的优点,可轻松实现对目标基因的敲除、替换和定点突变等操作。该技术刚诞生,就受到了全球生命科学领域研究者的关注,不到3年的时间就已经成功应用于多种动、植物当中。然而CRISPR/Cas9技术在茶树中的应用面临载体构建问题,本文以茶树咖啡碱合成酶为例,联合采用常规PCR、Overlapping PCR和Golden Gate Cloning技术,构建了包含茶树咖啡碱合成酶双靶点的CRISPR/Cas9基因编辑载体,为CRISPR/Cas9介导的基因组编辑技术在茶树中的应用奠定了坚实基础。     

CRISPR/Cas9系统在植物育种中的应用

人工核酸酶系统是在特定的基因组位点,进行切割进而利用生物内源的修复系统对目标基因进行编辑,创造新基因型的基因编辑技术。CRISPR/Cas9系统是原核生物抵御噬菌体侵染的天然适应性免疫系统。经过优化的CRISPR/Cas9编辑系统凭借操作简单,突变效率高,成本低等特点优越于其他核酸酶系统,比如锌指核酸酶系统和TALE核酸酶系统。目前,优化改造后的CRISPR/Cas9编辑系统已经在植物功能基因研究和新材料创制中得到了广泛地应用。本研究简述了CRISPR/Cas9编辑系统的结构和作用机理,归纳并论述了CRISPR/Cas9系统在植物中的编辑效率与脱靶效应和在改良作物农艺性状中的应用。最后,总结了CRISPR/Cas9系统在功能基因组学研究中应用扩展,以及展望了该系统在作物育种中的发展前景及应用价值,期望为高效利用CRISPR/Cas9系统进行新材料创制、作物品种改良提供参考。      

基于提高CRISPR/Cas基因编辑效率的研究进展

CRISPR基因编辑技术发展迅速,为功能基因的研究及遗传改良提供了技术支持。提高基因组编辑效率成为使用基因编辑技术的基本点,目前已取得了重要进展。本文结合CRISPR/Cas系统的作用原理、晶体结构,着重介绍目前提高编辑效率的最新研究进展,对CRISPR/Cas基因编辑效率的提高进行分析并提出改进策略。     

利用发根农杆菌体系检测大豆CRISPR/Cas9系统的靶点

作为一种基因编辑的新技术，CRISPR/Cas系统已被广泛应用于各种生物的基因工程中。但CRISPR/Cas9 基因编辑系统还存在着一定的脱靶现象，确定基因编辑靶点选择的可行性可提高基因编辑效率。本研究选用大豆 GmCO 基因为靶标，使用CRISPR/Cas9基因编辑系统来构建靶点的基因敲除载体，并且利用发根农杆菌K599菌株 对大豆子叶进行侵染，再通过植物组织培养的方法促使大豆外植体长出不定根，通过不定根检测发现在靶点2处出 现了碱基的缺失，说明成功实现了对大豆目标基因的编辑。此方法操作简单，周期短，实现了对大豆中选择靶点的 可行性的快速鉴定，为研究大豆的GmCO 基因功能和遗传改良方面提供了新的技术支持。     

水稻OsDUF393基因编辑突变体的创建

DUFs家族是一类未知功能结构域蛋白家族,转录谱和蛋白谱分析发现,DUFs蛋白在生物的生长和发育中发挥着至关重要的作用,因此对DUFs基因功能的研究将有助于了解生物体复杂的生长发育机制。目前该家族基因功能仍鲜见报道。为了探究水稻(Oryza sativa)OsDUF393(Domains of Unknown Function 393)基因的生物学功能,利用CRISPR/Cas9技术构建了水稻DUFs家族基因OsDUF393的载体,同时利用农杆菌介导的遗传转化将构建的CRISPR/Cas9载体转化水稻品种中花11中,经潮霉素抗性基因鉴定,获得了100株T0代转基因植株。对转基因植株的靶位点进行测序分析后发现有单碱基插入和大片段DNA序列缺失2种类型。通过RT-PCR分析突变体中OsDUF393基因的表达水平,结果表明,目的基因在不同纯合编辑突变体中转录水平均有下降。上述结果表明,CRISPR/Cas9重组载体成功实现了对OsDUF393基因的定向编辑。这些编辑突变体材料为后续该基因功能研究奠定了基础。     

产油微藻基因组编辑技术研究进展

微藻生物量与油脂产量偏低是目前微藻油脂难以商业化生产的主要原因之一,新型基因编辑技术TALEN和CRISPR/Cas9在解析油脂合成代谢的关键基因以及进一步遗传改造产油藻株方面有巨大潜力。本文主要介绍了TALEN和CRISPR/Cas9技术的基本原理,以及它们在产油微藻中的研究进展,并展望了两种技术在研究产油微藻功能基因和构建工业株系方面的应用前景。     

抗除草剂水稻种质资源研究进展

概述了除草剂的常见类型及其作用机制,综述了抗除草剂水稻育种的研究进展,展望了CRISPR/Cas9基因编辑技术在抗除草剂水稻育种研究中的应用与发展前景。     

CRISPR/Cas9介导的多基因编辑系统在大豆中的应用

自CRISPR/Cas9（clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9）基因 组编辑技术发现以来，迅速在作物中得到广泛应用。但是，CRISPR/Cas9多基因编辑系统在大豆中的研究尚待开 发。本文利用CRISPR/Cas9介导的多基因编辑系统，分别构建了两个载体，一个载体含6个靶点，编辑7个大豆基因 （4个Glycine max ASYMMETRIC LEAVES1（GmAS1）同源基因和3个GmAS2 同源基因），另一个载体含8个靶点，编辑 11个G. max AGAMOUS 家族同源基因（4个GmAG 同源基因，2个G. max SEEDSTICK（GmSTK）同源基因和5个G. max SHATTERPROOF1（GmSHP1/2）同源基因）。大豆遗传转化后，经表型鉴定和靶点检测发现，CRISPR/Cas9介导的多 基因编辑系统在大豆中成功实现了多基因编辑。当3个GmAS1 同源基因和3个GmAS2 同源基因同时突变时，导致 大豆叶片向远轴面弯曲、皱缩且叶柄变短的表型。当2个GmSHP1 同源基因和2个GmSTK 同源基因同时突变时，导 致豆荚停止发育的不育表型。     

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术优化作物育种

介绍1项目前应用广泛的基因编辑技术CRISPR/Cas9。CRISPR是细菌有效防止病毒和噬菌体侵入的手段。在sgRNA的指导下,Cas9定点切割DNA,导致双链DNA断开,随即可以直接对细胞进行基因编辑。CRISPR/Cas9是一种创造性的分析和编辑植物基因序列的新技术。其高效性和快捷性对农业生产具有重大的发展意义。科学家可以利用其高度靶向的特点对基因进行定位和编辑,在不改变作物农艺性状的同时优化它们的产量、营养品质和对环境的适应性。     

基因编辑技术及其水稻中的发展和应用

CRISPR/Cas系统作为一种新兴的基因编辑系统,以其简单、高效、特异性高等特点已广泛应用于植物功能基因组研究和品种改良。在本文中,首先,我们系统总结了CRISPR/Cas技术及其衍生技术在植物中的开发和优化;其次,重点介绍了基于基因组编辑技术的水稻种质和品种改良的最新进展,并描述了基于基因编辑技术的水稻育种新策略,这是传统育种很难实现的;最后,还讨论了基因编辑技术在未来作物和粮食生产中所要面对的挑战。     

Progress of CRISPR/Cas9 technology in breeding of Brassica napus

Gene editing technology provides important technical basics for the research in plant functional genes and crop genetic improvement. CRISPR/Cas9-mediated gene editing is an effective experimental tool for crop genome directed editing in recent years, which has been widely used in many crops as rice, wheat and other crops. CRISPR/Cas9 system was expected to be a powerful experimental tool in genetic improvement and molecular design breeding of rapeseed. This paper, which based on the development history and the latest research of CRISPR/Cas9-mediated gene editing technology in rapeseed, summarized the progress of CRISPR/Cas9 including plant type improvement, yield traits, quality improvement, disease and stress resistance improvement, yellow seed creation and other utilizes at present. The application scope, development direction and target analysis method of this technology in rape were focused. The problems of CRISPR/cas9 system in rapeseed breeding were analyzed and the improvement strategies were discussed. Finally, views on direction of rapeseed breeding by gene editing were emphasized.     

基因编辑新技术研究进展

基因编辑是一项旨在对基因组进行定点修饰的新技术,目前主要有人工核酸酶介导的锌指核酸酶（ZFN）技术、转录激活子样效应物核酸酶（TALEN）技术和RNA引导的CRISPR—Cas核酸酶（CRISPR-CasRGNs）技术。它们都能特异性地识别靶位点,对其单链或双链进行精准切割后,由细胞内源性的修复机制来完成对靶标基因的敲除和替换。本文比较了这3种基因编辑技术,并对其应用进展做了介绍。