茶树咖啡碱合成酶CRISPR/Cas9基因组编辑载体的构建

CRISPR/Cas9技术是一门新兴的基因组定点编辑技术,具有操作简单、高效的优点,可轻松实现对目标基因的敲除、替换和定点突变等操作。该技术刚诞生,就受到了全球生命科学领域研究者的关注,不到3年的时间就已经成功应用于多种动、植物当中。然而CRISPR/Cas9技术在茶树中的应用面临载体构建问题,本文以茶树咖啡碱合成酶为例,联合采用常规PCR、Overlapping PCR和Golden Gate Cloning技术,构建了包含茶树咖啡碱合成酶双靶点的CRISPR/Cas9基因编辑载体,为CRISPR/Cas9介导的基因组编辑技术在茶树中的应用奠定了坚实基础。     

茯茶冠突散囊菌发酵生产吲哚生物碱的研究

冠突散囊菌是茯砖茶"发花"过程中的优势菌,其体内含有丰富的吲哚类生物碱类代谢产物。吲哚生物碱类化合物具有抗菌、抗过敏、抗辐射、抗紫外和抗肿瘤等重要的生物活性,开发前景广阔。为提高吲哚类生物碱类代谢产物的产量,本研究考察了冠突散囊菌繁殖、生长与发酵的影响因素,并利用薄层色谱(TLC)、高效液相色谱(HPLC)、液相色谱-质谱联用技术(LC-MS)对其发酵产物内含成分进行了分析。结果表明冠突散囊菌在察氏固体培养基上能快速繁殖,8 d内能产生大量的成熟孢子,液体培养的最佳条件与时长分别为pH 6.0、温度30℃、转速200 r·min~(-1)和培养时长6 d;鲜茶干粉、鲜茶提取物、茯茶粉、茯茶提取物和色氨酸等能显著诱导吲哚生物碱的合成,其中色氨酸诱导效应最强;内含成分分析表明,TLC可分离出至少10种冠突散囊菌代谢物质,HPLC与LC-MS检测分析其代谢产物的主要成分为吲哚类生物碱,产量达到2.45 g·L~(-1)。本研究为茯茶冠突散囊菌的高值化开发提供了技术支撑。     

黄花蒿中双键还原酶基因AaDBR3全长克隆与功能研究

黄花蒿中含有大量的香气类物质,在食品和医药行业有广泛的应用前景,但对其生物合成的分子机理研究非常欠缺。本研究采用SMART-RACE-PCR技术从黄花蒿花组织差异文库中获得了1个新的双键还原酶编码基因AaDBR3,其cDNA序列全长为1 279 bp,开放阅读框(ORF)长度为1 038 bp编码345氨基酸,蛋白分子量为38.46 kD,等电点(p I)为6.05。通过生物信息学的分析,AaDBR3属于中链脱氢酶超级家族中leukotriene B4 dehydrogenases类酶。系统发育进化树结果表明,该基因与烟草的烯丙醇脱氢酶(NtADH,Gen Bank:BAA89423.1)的同源性最高,相似性为77%。体外酶研究发现,重组蛋白酶能催化3-壬烯-2-酮向2-壬酮的转化,表明其属于双键还原酶。本研究为进一步丰富黄花蒿优异基因资源,及黄花蒿的品种改良提供了重要的靶基因。