甘蓝型油菜和甘蓝CRISPR/Cas9编辑效果的快速检测

CRISPR/Cas9系统是目前最常用的基因组定点编辑工具，通过瞬时表达试验提前验证Cas9/sgRNA载体诱导的突变效率，可以提高基因组定点编辑成功的几率，且显著节省费用及时间。本研究开发了一种利用农杆菌介导的操作简单、适用性好、成本低廉的叶片瞬时表达技术，可用于快速检测甘蓝型油菜和甘蓝中CRISPR/Cas9的编辑效果。针对甘蓝型油菜BnaC.WRKY11.a设计了2个靶位点Tgt1（Target 1）和Tgt2（Target 2），并构建了Cas9/sgRNA-Tgt1/2多重突变载体，在甘蓝型油菜叶片中瞬时表达后，2个靶位点都出现突变，突变效率达11.2%～82.2%。针对甘蓝BolPDS3基因设计了1个靶位点Tgt3（Target3），并构建了Cas9/sgRNA-Tgt3敲除载体，在甘蓝叶片瞬时表达后，Tgt3发生了突变，且大部分为碱基缺失突变，缺失的数目为1～18bp不等，同时还存在少量碱基插入以及碱基替换等突变类型。结果表明这种甘蓝型油菜和甘蓝的叶片瞬时表达技术操作简单、适用性好、成本低廉，CRISPR/Cas9的编辑效果快速易检测。     

CRISPR/Cas9系统在植物育种中的应用

人工核酸酶系统是在特定的基因组位点,进行切割进而利用生物内源的修复系统对目标基因进行编辑,创造新基因型的基因编辑技术。CRISPR/Cas9系统是原核生物抵御噬菌体侵染的天然适应性免疫系统。经过优化的CRISPR/Cas9编辑系统凭借操作简单,突变效率高,成本低等特点优越于其他核酸酶系统,比如锌指核酸酶系统和TALE核酸酶系统。目前,优化改造后的CRISPR/Cas9编辑系统已经在植物功能基因研究和新材料创制中得到了广泛地应用。本研究简述了CRISPR/Cas9编辑系统的结构和作用机理,归纳并论述了CRISPR/Cas9系统在植物中的编辑效率与脱靶效应和在改良作物农艺性状中的应用。最后,总结了CRISPR/Cas9系统在功能基因组学研究中应用扩展,以及展望了该系统在作物育种中的发展前景及应用价值,期望为高效利用CRISPR/Cas9系统进行新材料创制、作物品种改良提供参考。      

CRISPR/Cas9定点编辑水稻穗发育Osa1基因

CRISPR/Cas9是一种快速发展的基因组定点编辑技术。利用该技术对水稻穗发育基因Osa1进行定点编辑,精准敲除Osa1基因,获得Osa1功能缺失突变体,为Osa1基因功能的深入研究提供了准确可靠的突变体材料。     

水稻穗发育基因OsD1功能的初步分析

利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术对一个水稻穗发育相关基因OsD1进行了定点编辑。通过定点编辑载体的构建、水稻愈伤组织的转化、转基因植株的鉴定及突变类型的分析,获得了4株OsD1功能缺失型突变体,其中2株属于纯合突变类型。表型分析发现,OsD1突变体的内外稃出现显著的畸形发育,花粉粒的淀粉充实度降低且颖花不结实,初步推断水稻OsD1基因可能参与花器官的建成和发育。     

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术优化作物育种

介绍1项目前应用广泛的基因编辑技术CRISPR/Cas9。CRISPR是细菌有效防止病毒和噬菌体侵入的手段。在sgRNA的指导下,Cas9定点切割DNA,导致双链DNA断开,随即可以直接对细胞进行基因编辑。CRISPR/Cas9是一种创造性的分析和编辑植物基因序列的新技术。其高效性和快捷性对农业生产具有重大的发展意义。科学家可以利用其高度靶向的特点对基因进行定位和编辑,在不改变作物农艺性状的同时优化它们的产量、营养品质和对环境的适应性。     

基于提高CRISPR/Cas基因编辑效率的研究进展

CRISPR基因编辑技术发展迅速,为功能基因的研究及遗传改良提供了技术支持。提高基因组编辑效率成为使用基因编辑技术的基本点,目前已取得了重要进展。本文结合CRISPR/Cas系统的作用原理、晶体结构,着重介绍目前提高编辑效率的最新研究进展,对CRISPR/Cas基因编辑效率的提高进行分析并提出改进策略。     

基因编辑技术的研究及在玉米中的应用

尽管人类已经发现并应用ZFN、TALEN基因编辑技术来实现对基因的定向改变,但由于操作复杂、成本较高,一直限制着基因组学的研究进展。基因的低成本、高效率、操作简单的编辑技术一直是生物分子领域亟待解决的问题。2013年《科学》(Science)杂志上两篇有关CRISPR/Cas的报道标志着基因编辑技术取得了重大突破。CRISPR是从细菌、古菌基因组中发现特殊的DNA重复序列家族。目前,该技术已经成功应用于水稻、斑马鱼、小鼠等动植物中,实现了对特定基因的定向修饰。简要介绍CRISPR/Cas的发现历史、组成、作用原理和最新研究进展,对该技术在玉米研究中的应用进行展望。     

利用发根农杆菌体系检测大豆CRISPR/Cas9系统的靶点

作为一种基因编辑的新技术，CRISPR/Cas系统已被广泛应用于各种生物的基因工程中。但CRISPR/Cas9 基因编辑系统还存在着一定的脱靶现象，确定基因编辑靶点选择的可行性可提高基因编辑效率。本研究选用大豆 GmCO 基因为靶标，使用CRISPR/Cas9基因编辑系统来构建靶点的基因敲除载体，并且利用发根农杆菌K599菌株 对大豆子叶进行侵染，再通过植物组织培养的方法促使大豆外植体长出不定根，通过不定根检测发现在靶点2处出 现了碱基的缺失，说明成功实现了对大豆目标基因的编辑。此方法操作简单，周期短，实现了对大豆中选择靶点的 可行性的快速鉴定，为研究大豆的GmCO 基因功能和遗传改良方面提供了新的技术支持。     

利用CRISPR/Cas9系统定向改良水稻粒长和穗粒数性状

【目的】基因组定点编辑技术已成为分子育种的重要手段。本研究拟对GS3和Gn1a功能缺失突变对目标性状的改良效应进行分析,以期为培育高产水稻提供理论基础。【方法】利用CRISPR/Cas9系统,以控制粒型基因GS3和控制每穗粒数基因Gn1a为编辑对象,构建了共敲除载体p C1300-2×35S::Cas9-g~(GS3)-g~(Gn1a)a,用农杆菌介导法转化4个优质水稻品种,分析了基因突变的特征和相应农艺性状。【结果】构建的敲除载体成功地实现了对GS3和Gn1a基因的定点编辑。在4个转化受体的T_0代均分别获得了gs3和gs3gn1a的移码突变体。对T_1 代中无选择标记突变体的农艺性状分析表明,突变体gs3和gs3gn1a与野生型相比粒长变长,千粒重增加;突变体gs3gn1a与突变体gs3相比,每穗粒数显著增加。【结论】利用CRISPR/Cas9系统进行水稻基因编辑可以快速改良品种的目标性状,在水稻品种的定向改良方面具有巨大的潜力。     

CRISPR/Cas9介导的多基因编辑系统在大豆中的应用

自CRISPR/Cas9（clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9）基因 组编辑技术发现以来，迅速在作物中得到广泛应用。但是，CRISPR/Cas9多基因编辑系统在大豆中的研究尚待开 发。本文利用CRISPR/Cas9介导的多基因编辑系统，分别构建了两个载体，一个载体含6个靶点，编辑7个大豆基因 （4个Glycine max ASYMMETRIC LEAVES1（GmAS1）同源基因和3个GmAS2 同源基因），另一个载体含8个靶点，编辑 11个G. max AGAMOUS 家族同源基因（4个GmAG 同源基因，2个G. max SEEDSTICK（GmSTK）同源基因和5个G. max SHATTERPROOF1（GmSHP1/2）同源基因）。大豆遗传转化后，经表型鉴定和靶点检测发现，CRISPR/Cas9介导的多 基因编辑系统在大豆中成功实现了多基因编辑。当3个GmAS1 同源基因和3个GmAS2 同源基因同时突变时，导致 大豆叶片向远轴面弯曲、皱缩且叶柄变短的表型。当2个GmSHP1 同源基因和2个GmSTK 同源基因同时突变时，导 致豆荚停止发育的不育表型。     

Progress of CRISPR/Cas9 technology in breeding of Brassica napus

Gene editing technology provides important technical basics for the research in plant functional genes and crop genetic improvement. CRISPR/Cas9-mediated gene editing is an effective experimental tool for crop genome directed editing in recent years, which has been widely used in many crops as rice, wheat and other crops. CRISPR/Cas9 system was expected to be a powerful experimental tool in genetic improvement and molecular design breeding of rapeseed. This paper, which based on the development history and the latest research of CRISPR/Cas9-mediated gene editing technology in rapeseed, summarized the progress of CRISPR/Cas9 including plant type improvement, yield traits, quality improvement, disease and stress resistance improvement, yellow seed creation and other utilizes at present. The application scope, development direction and target analysis method of this technology in rape were focused. The problems of CRISPR/cas9 system in rapeseed breeding were analyzed and the improvement strategies were discussed. Finally, views on direction of rapeseed breeding by gene editing were emphasized.     

基因编辑技术及其水稻中的发展和应用

CRISPR/Cas系统作为一种新兴的基因编辑系统,以其简单、高效、特异性高等特点已广泛应用于植物功能基因组研究和品种改良。在本文中,首先,我们系统总结了CRISPR/Cas技术及其衍生技术在植物中的开发和优化;其次,重点介绍了基于基因组编辑技术的水稻种质和品种改良的最新进展,并描述了基于基因编辑技术的水稻育种新策略,这是传统育种很难实现的;最后,还讨论了基因编辑技术在未来作物和粮食生产中所要面对的挑战。     

Improvement of Grain Shape and Fragrance by Using CRISPR/Cas9 System

【Objective】 CRISPR/Cas9-mediated genome editing has become an important way for molecular breeding in rice. To promote rice breeding, the non-fragrant japonica rice variety Longjing11 was used as the test material. This study aims to edit GS3, GS9 and Badh2 genes for obtaining valuable and stable long-grain fragrant rice materials. 【Method】 The target genes GS3, GS9 and BADH2 were selected to construct the vector pYLCRISPR/ Cas9-GS3/ GS9/Badh2-gRNA by using CRISPR/Cas9 gene editing technology. The Agrobacterium-mediated transformation was used to transform Longjing11. Specific mutations were introduced into the GS3, GS9 and Badh2 genes in Longjing 11. 【Result】 The grain length of the transgenic free homozygote gs3/gs9/badh2 increased by 26.43% to 27.01%, yield per plant by 10.82% to 12.11%, 1000-grain weight by 18.34% to 41.36%, rice became fragrant as compared with wild type of Longjing 11. This study efficiently transformed round-grain rice into long-grain fragrant rice. 【Conclusion】The homozygous mutant lines featured by stable inheritance and long-grain fragrant quality were obtained by using CRISPR/Cas9 system. This study provides a convenient and effective way of combining multiple quality traits together, which could significantly accelerate breeding process from a breeding perspective.