唐鱼生长激素基因的克隆及序列分析

[目的]为开展唐鱼转自源基因研究提供基本构架。[方法]采用RT-PCR和RACE技术分离唐鱼生长激素基因(GH)全长cD-NA序列,同时利用PCR克隆了唐鱼生长激素基因的基因组(gDNA)序列。[结果]序列分析表明:唐鱼GH cDNA的5非编码区为64bp,3非编码区为448 bp,开放阅读框(ORF)633 bp,共编码210个氨基酸,包括22个氨基酸的信号肽和188个氨基酸的成熟肽。应用MEGA 3.1软件进行序列同源性比较分析的结果显示,唐鱼GH cDNA所编码的氨基酸序列与近缘鱼种(草鱼、青鱼、鳙鱼、鲤鱼、斑马鱼等)的生长激素氨基酸序列有很高的同源性,其中与草鱼和鳙鱼的同源性高达98%。该研究获得的唐鱼生长激素基因的gDNA序列共有1403 bp,包括4个外显子和3个内含子,外显子大小分别150、117、162、204 bp;3个内含子都以GT开头、AG结尾,符合GT-AG法则。[结论]该研究为下一步构建自源GH基因构件,进行唐鱼的转自源GH基因研究,培育出生长快、体型大的唐鱼新品系奠定了基础。     

草鱼MyoD cDNA的克隆和序列分析

 用RACE技术从受精后约22 h的草鱼胚胎总RNA中扩增获得了草鱼MyoD基因的全序列,并对其序列进行了分析。结果表明，草鱼MyoD基因全长cDNA为1 597 bp,其中开放阅读框为825 bp，共编码275个氨基酸，结构分析表明该肽链第1～84个氨基酸为草鱼MyoD基因的Basic区,第98～142个氨基酸为草鱼MyoD基因的HLH结构域，该序列所编码的肽链没有信号肽；通过对比分析已知的GeneBank中其它脊椎动物MyoD基因发现，该基因编码的氨基酸肽链随动物由低等向高等进化有加长的趋势,且核苷酸以及推测的氨基酸同源性和动物之间的亲缘关系相一致；草鱼MyoD基因的克隆为研究家鱼的肌肉发育调控的机理以及肉质改良奠定了基础。     

葱蝇ADH基因的克隆及序列分析

[目的]对葱蝇(Delia antiqua)ADH基因进行克隆,并对其进行序列分析。[方法]通过RACE的方法克隆葱蝇ADH基因的cDNA序列,同时对该序列进行同源性分析、氨基酸序列比对和系统发育分析。[结果]试验获得的cDNA全长1 088 bp,其中ORF 771 bp,编码256个氨基酸,推测其相对分子质量为30.80 kDa,等电点为8.22;通过该基因推导的氨基酸序列与其他物种的ADH进行相似性比较和系统发育分析,发现葱蝇与刺舌蝇(Glossina morsitans)氨基酸序列的同源性最高。[结论]该研究为ADH基因的进一步研究提供了基础。     

鲤鱼白细胞介素10(IL-10)基因cDNA克隆及序列分析(英文)

[目的]获取鲤鱼全长IL-10(interleukin 10)cDNA,并对其序列进行分析。[方法]利用DD-RTPCR(differential display RT-PCR)方法获得差异表达IL-10cDNA片段,以地高辛标记做为探针,对有丝分裂原刺激的鲤鱼外周血白细胞cDNA文库进行核酸杂交筛选,克隆鲤鱼IL-10全长cDNA,并对该序列进行序列分析和同源性比较。[结果]鲤鱼全长IL-10cDNA共1117bp,包含55bp的5’端非编码区,一个540bp的编码179个氨基酸的开放阅读框及522bp的3’端非编码区。其中,3’非编码区包含3个mRNA不稳定基序"ATTTA";该蛋白序列具有IL-10家族的典型序列特征;序列同源性比较表明,所获得的序列与GenBank上登录的鲤鱼IL-10基因同源性为89.1%。[结论]该试验为进一步研究IL-10在体内的表达方式、功能特点、调控机理及其在炎症反应和免疫应答中的作用机制奠定了基础。     

鲤鱼白细胞介素10(IL-10)基因cDNA克隆及序列分析

[目的]获取鲤鱼全长IL-10(interleukin 10)cDNA,并对其序列进行分析。[方法]利用DD-RTPCR(differential display RT-PCR)方法获得差异表达IL-10 cDNA片段,以地高辛标记做为探针,对有丝分裂原刺激的鲤鱼外周血白细胞cDNA文库进行核酸杂交筛选,克隆鲤鱼IL-10全长cDNA,并对该序列进行序列分析和同源性比较。[结果]鲤鱼全长IL-10 cDNA共1 117 bp,包含55 bp的5'端非编码区,一个540 bp的编码179个氨基酸的开放阅读框及522 bp的3'端非编码区,其中,3'非编码区包含3个mRNA不稳定基序"ATTTA";该蛋白序列具有IL-10家族的典型序列特征;序列同源性比较表明,所获得的序列与GenBank上登录的鲤鱼IL-10基因同源性为89.1%。[结论]该试验为进一步研究IL-10在体内的表达方式、功能特点、调控机理及其在炎症反应和免疫应答中的作用机制奠定了基础。     

塞内加尔鳎Survivin基因的电子克隆与生物信息学分析

[目的]克隆分析塞内加尔鳎的Survivin基因。[方法]利用生物信息学手段克隆塞内加尔鳎Sunvivin基因的全长cDNA序列,并对其序列进行分析。[结果]结果表明,该cDNA序列包含444bp的开放阅读框,编码147个氨基酸。氨基酸序列同源性分析表明,塞内加尔鳎Survivin氨基酸序列与半滑舌鳎、斑马鱼、非洲爪蟾、鸡、小鼠和人Surivin氨基酸序列具有较高的同源性。[结论]该研究结果为进一步研究塞内加尔鳎的Survivin基因提供基础。     

葱蝇ADH基因的克隆及序列分析(英文)

[目的]对葱蝇(Delia antiqua)ADH基因进行克隆,并对其进行序列分析。[方法]通过RACE的方法克隆葱蝇ADH基因的cDNA序列,同时对该序列进行同源性分析、氨基酸序列比对和系统发育分析。[结果]试验获得的cDNA全长1088bp,其中ORF771bp,编码256个氨基酸,推测其相对分子质量为30.80kDa,等电点为8.22;通过该基因推导的氨基酸序列与其他物种的ADH进行相似性比较和系统发育分析,发现葱蝇与刺舌蝇(Glossina morsitans morsitans)氨基酸序列的同源性最高。[结论]该研究为ADH基因的进一步研究提供了基础。     

异齿裂腹鱼PYY基因的克隆、组织分布及其调节摄食功能研究

【目的】克隆异齿裂腹鱼肽YY基因(PYY)的编码区(CDS)全长序列,对其生物信息学进行分析,并研究PYY基因在异齿裂腹鱼组织中的分布情况,以及餐前餐后和禁食复喂对PYY基因表达量的影响,为异齿裂腹鱼摄食调控机制研究提供依据。【方法】以采集于西藏雅鲁藏布江的7～12龄,体质量为(1.22±0.20) kg/尾的异齿裂腹鱼为对象,采用RT-PCR和Race-PCR技术克隆异齿裂腹鱼PYY基因的CDS全长序列,分析其编码蛋白质的氨基酸序列和蛋白结构;采用实时荧光定量PCR,分析PYY基因在异齿裂腹鱼组织中的分布情况,以及餐前餐后和禁食复喂对PYY基因在异齿裂腹鱼脑组织中表达量的影响。【结果】异齿裂腹鱼PYY基因CDS序列长度为735 bp,其中开放阅读框(ORF)为294 bp,编码98个氨基酸。系统进化分析表明,异齿裂腹鱼PYY基因与同属裂腹鱼属的鱼类亲缘关系最近;氨基酸序列分析表明,PYY蛋白质包括典型的特征序列和信号肽,其蛋白结构中具有亲水性结构和跨膜结构。PYY基因在异齿裂腹鱼脑组织中高度表达,在其他组织中微弱表达;餐前异齿裂腹鱼PYY基因的表达量无显著性差异,但餐后PYY基因的表达量显著升高,且随着餐后时间的逐渐延长,其表达量继续升高;禁食使异齿裂腹鱼脑组织中的PYY基因表达量下降,复喂后PYY基因的表达量极显著升高。【结论】成功克隆了异齿裂腹鱼PYY基因的CDS全长序列,PYY基因在异齿裂腹鱼脑组织中高度表达,但在肠道中微量表达,异齿裂腹鱼PYY基因是餐后饱感信号因子,具有调节动物摄食的功能。     

鲤鱼干扰素γ-2β全长cDNA的克隆及序列分析(英文)

[目的]进行鲤鱼干扰素γ-2β(IFNγ-2β)全长cDNA的克隆、鉴定及序列分析。[方法]以鲤鱼外周血白细胞干扰素γ-2β(interferon γ-2β,IFNγ-2β)EST序列为基础,以地高辛标记作为探针对有丝分裂原刺激的鲤鱼外周血白细胞cDNA文库进行核酸杂交筛选,克隆鲤鱼IFNγ-2β的全长cDNA,并进行序列分析。[结果]获得了3个阳性克隆。对其序列分析结果显示,该序列包含119bp的5’非编码区,218bp的3’非编码区,开放阅读框ORF长537bp,共编码178个氨基酸,在其3’非编码区存在几个ATTTA不稳定基序。序列同源性比较结果表明,所获序列与GenBank上登录的鲤鱼IFN基因的同源性达97%;蛋白质序列和结构分析发现,该序列其具有IFN家族的典型序列特征。[结论]为进一步研究IFNγ-2β在体内的表达方式、功能特点和调控机理以及在炎症反应和免疫应答中的作用机制奠定了基础。     

鲤鱼干扰素γ-2β 全长cDNA的克隆及序列分析

[目的]进行鲤鱼干扰素γ-2β(IFNγ-2β)全长cDNA的克隆、鉴定及序列分析。[方法]以鲤鱼外周血白细胞干扰素γ-2β(inter-feronγ-2β,IFNγ-2β)EST序列为基础,以地高辛标记作为探针,对有丝分裂原刺激的鲤鱼外周血白细胞cDNA文库进行核酸杂交筛选,克隆鲤鱼IFNγ-2β的全长cDNA,并进行序列分析。[结果]获得了3个阳性克隆,对其进行序列分析,结果显示,该序列包含119 bp的5'非编码区,218 bp的3'非编码区,开放阅读框ORF长537 bp,共编码178个氨基酸,在其3'非编码区存在几个ATTTA不稳定基序;序列同源性比较结果表明,所获序列与GenBank上登录的鲤鱼IFN基因的同源性达97%;蛋白质序列和结构分析发现,该序列具有IFN家族的典型序列特征。[结论]为进一步研究IFNγ-2β在体内的表达方式、功能特点和调控机理以及在炎症反应和免疫应答中的作用机制奠定了基础。     

鲤鱼HSP70基因组织表达差异研究

1材料与方法 1．1材料 供试鲤鱼购自成都市洗面桥市场。主要试剂：TR—Iaol总RNA提取试剂盒购自Invitrogen公司,反转录试剂盒、pMD-18T载体、D12000DNA和如DNA聚合酶购自大连宝生物工程有限公司;琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自Axygen公司;DEPC原液（Sigma分装）、JM-109感受态细胞购自大连宝生物工程有限公司,其他试剂均为国产分析纯。     

锦鲤维氏气单胞菌感染症及其病原生物学特性研究

[目的]报道锦鲤的发病情况及其病原的主要生物学性状。[方法]对5尾发病及新鲜病死的锦鲤病变组织进行细菌检查及分离,对分离菌进行形态特征、理化特性等表观分类学指征鉴定;同时择代表菌株进行16S rRNA基因的分子鉴定、健康锦鲤的人工感染试验和药敏试验。[结果]根据2株分离菌的形态特征及理化特性,结合16S rRNA序列测定与系统发育分析结果,判定其为气单胞菌属的维氏气单胞菌,其代表菌株HC050630A-1的16S rRNA基因序列长度为1457bp。人工感染试验表明,HC050630A-1株具有较强的致病作用。药敏试验结果显示,HC050630A-1菌株对供试37种抗菌药物中的头孢拉定等16种高度敏感,对头孢唑啉等13种敏感,对青霉素G等8种药物耐药。[结论]该研究为对该病的有效检验与防制等提供参考。     

黄河鲤生长激素基因cDNA的克隆和原核高效表达

[目的]研究黄河鲤生长激素基因cDNA的克隆和原核高效表达。[方法] 从黄河鲤脑垂体中提取总RNA,用RT-PCR方法扩增并克隆黄河鲤的生长激素（GH）基因cDNA,分析其核苷酸序列和推测的氨基酸序列。[结果] 经克隆得到的黄河鲤生长激素基因的开放阅读框包括633个核苷酸,编码210个氨基酸,其中包括22个氨基酸的信号肽和188个氨基酸的成熟肽。将GH成熟肽的cDNA扩增并克隆入表达载体pET-28a,在大肠杆菌BL21（DE3）表达N 端含6个组氨酸的融合多肽。SDS-PAGE结果表明,0.1 mmol/L IPTG 诱导表达的蛋白约为23.5 kD,其表达量超过蛋白总量的50%,主要为不溶性的包涵体。包涵体经尿素溶解和亲和层析,获得了单一蛋白条带。[结论]该研究克隆到黄河鲤的生长激素基因,构建其原核表达质粒,得到了高效表达的基因工程菌。     

雅砻江长丝裂腹鱼胚胎形态发育及仔鱼生长研究

[目的]研究雅砻江长丝裂腹鱼胚胎形态发育及仔鱼生长。[方法]通过人工干法授精获得长丝裂腹鱼受精卵,在水温(15.9±0.6)℃下进行孵化,对其胚胎和仔鱼的发育过程进行了研究。[结果]长丝裂腹鱼成熟卵卵径为(2.89±0.30)mm,吸水充分膨胀后卵径为(4.17±0.09)mm。在水温(10.8±0.8)和(15.9±0.6)℃下胚胎均能孵化,(19.5±0.6)℃条件下胚胎发育至原肠中期即全部死亡。胚胎发育有效积温为1 275.46℃·h,生物学零度为6.27℃。在水温(15.9±0.6)℃的条件下,胚胎受精后3 h 35 min胚盘隆起,14 h45 min和34 h 50 min进入囊胚期和原肠胚期,51 h 35 min胚孔封闭,132 h 25 min开始出膜,217 h全部出膜。初孵仔鱼全长为(10.22±0.25)mm。全长(TL)与体重(BW)的关系式为:BW=1.209 3E-4(TL-10.54)~(2.512 8)(R~2=0.975 7);体长(TL)和体重(BW)与日龄(D)的最佳关系式分别为:TL=0.380 5D~3-0.002 6D~2+2.868 7E-5D+10.741 8(R~2=0.984 0),BW=1.010 82E-7(D+9.568 3)~(3.451 8)(R~2=0.983 4)。[结论]研究结果可为了解长丝裂腹鱼早期生活史、繁殖生物学等积累资料。     

3种硝基芳烃化合物对锦鲤鱼的急性毒性研究

[目的]研究硝基芳烃化合物对锦鲤鱼的急性毒性效应,从而为硝基芳烃化合物的水环境风险评价提供基础数据。[方法]以锦鲤鱼(Cyprinus carpio)为试验生物,将其暴露于不同浓度的对硝基甲苯、邻硝基苯胺和对硝基苯胺3种化合物试验液体中,分别采用改良寇氏法和概率单位法计算半数致死浓度(LC50),并采用u检验法比较两种计算结果的差异。[结果]通过两种计算方法,所得LC50之间无显著差异,均能表示3种化合物对锦鲤鱼的毒性水平。以两种结果的平均值作为最终LC50。对硝基甲苯、邻硝基苯胺和对硝基苯胺96 h LC50分别为41.43、20.42和49.36 mg/L。[结论]对邻硝基苯胺、对硝基甲苯和对硝基苯胺对锦鲤鱼均属于中等毒性物质,其急性毒性依次降低。     

用团头鲂精子诱导红白锦鲤雌核发育研究

[目的]研究用团头鲂（Megalobrama amblycephala）精子诱导红白锦鲤（Cyprinus carpioL.）雌核发育。[方法]用紫外线灭活的团头鲂精子刺激性成熟的红白锦鲤卵子,进行雌核发育,并采用热休克方法诱导染色体加倍。[结果]成功获得了红白锦鲤雌核发育二倍体鱼苗28尾。诱导红白锦鲤雌核发育的最佳条件为：团头鲂精子采用紫外线照射20min后,在孵化水温20~22℃条件下,与红白锦鲤卵子授精后3min进行热休克处理,41℃水温下持续处理2min,此时雌核发育率最高（1.78%）。形态学比较表明,单倍体与雌核发育F1代二倍体和正常二倍体在发育过程中存在明显差异,从肌节开始沉积大量黑色素,胚体扭曲严重,呈＂C＂型;而雌核发育二倍体与正常二倍体对照组相比,在体长、体高、体色和卵黄囊长等方面都极为相似。[结论]该研究为进一步探讨红白锦鲤色素遗传机制及定向培育优良新品种奠定了基础。     

鲤鱼HSP70基因组织表达差异研究

[目的]研究HSP70是否可作为鲤鱼养殖中的应激监测指标。[方法]根据鲤鱼HSP70序列（AY120894）设计并合成1对引物,提取鲤鱼肝脏组织总RNA,通过RT-PCR方法克隆得到鲤鱼HSP70部分cDNA片段,然后检测其在鲤鱼心脏、肠、粘液、性腺、鳔、鳃、鳍等不同组织中的表达差异。[结果]RT-PCR扩增获得鲤鱼HSP70基因cDNA部分序列为480 bp。将测序后推测的氨基酸序列与其他种类的鱼进行同源性比较,结果发现与鲤鱼、斑马鱼、虹鳟、牙鲆、剑尾鱼、鲋鱼的同源性依次为96%、98%、98%、96%、96%、96%。HSP70在鲤鱼8个组织中均检测到表达,其中在心脏中表达最高,其次是鳔、鳍,二者之间无显著差异（P〉0.05）,在肠、粘液与脂肪3个组织中的表达无显著差异（P〉0.05）,但显著高于在性腺与鳃中的表达水平（P〈0.05）。[结论]HSP70作为鲤鱼养殖中应激程度、应激能力、健康状况检测的分子标记物是可行的。     

建鲤内参基因EF-1α的实时荧光定量PCR方法的建立

真核生物延伸因子基因(EF-1α)在蛋白质翻译过程中起着重要的作用,其序列具有高度的保守性,常作为内参基因应用于real time PCR中。通过RT-PCR克隆出建鲤(Cyprinus carpio var.jian)EF-1α的部分cDNA序列,其长度为425 bp,翻译成140个氨基酸,Blast结果显示与其它鱼类leptin的相似性为98%。同时也克隆出建鲤EF-1α相应的DNA序列,共506 bp。cDNA和DNA的序列比对显示克隆出的建鲤EF-1α含有1个相位为0的内含子,在此基础上设计一对跨越内含子的引物,采用SYBR GreenⅠ染料建立了real time PCR方法。以肝脏cDNA为标准品,建立了标准曲线,并进行了融解曲线分析。结果表明,所建立的方法具有特异性强、相关系数高、线性范围广等优点,可应用于建鲤的功能基因表达研究。     

鲤Myf-6基因的克隆及其表达分析

根据斑马鱼(Danio rerio)Myf-6基因序列设计引物,用鲤(Cyprinus carpio)肌肉组织总RNA,经RT-PCR扩增获得Myf-6基因开放阅读框(ORF序列)720 bp,GenBank登陆号为GU339054。编码239个氨基酸,与斑马鱼、大西洋鲑、刀鱼、河豚等同源性分别为90%、76%、76%和72%,但与哺乳动物如人、牛、兔、小鼠和绵羊的同源性较低,为59%~60%。利用半定量RT-PCR分析鲤Myf-6基因的mRNA表达特性,结果在心脏、肾脏、脂肪、肝胰脏、肌肉和脾脏中均检测到Myf-6基因的表达,并且在肌肉组织中表达量显著高于其他组织(P0.05)。Myf-6基因表达随着生长发育变化呈下降趋势,在较大规格试验鱼(500 g)的表达极显著低于其他两种规格(50~60 g1、20~130 g)试验鱼的表达(P0.01)。