2株微孢子虫热激蛋白Hsp70的ORF研究

为探讨微孢子虫的起源、分类地位及亲缘关系,在系统发育分析的基础上,对家蚕微孢子虫(Nosema.bombycis)和柞蚕微孢子虫(N.antheraeae) Hsp70基因的ORF序列进行克隆、测序,同时将2种微孢子虫的Hsp70基因的ORF序列翻译成氨基酸序列,利用Expasy蛋白质数据库的分析工具和DNAstar软件对其功能进行理论分析和预测.结果表明:家蚕微孢子虫和柞蚕微孢子虫的Hsp70氨基酸序列在N端均有一个高度保守的基序GIDLGTT,另外还有被作为线粒体Hsp70标志的2个保守的基序;氨基酸序列相似性比较结果发现,家蚕微孢子虫广东株Hsp70的蛋白氨基酸序列和家蚕微孢子虫日本株的相似性最近,约为96％.系统发育分析发现,微粒子属和变形虫属有较近的亲缘关系.功能预测表明,2种微孢子虫在信号肽剪切位点、跨膜结构域及糖基化位点、二级结构、亲水性、柔韧性等方面均存在异同.     

蓝叶虫微孢子虫RPB1基因片段序列的测定及其系统发育分析

【目的】克隆蓝叶虫微孢子虫RPB1（RNA聚合酶II大亚基）基因片段,对其基因及编码的蛋白序列特征进行生物信息学分析,进一步明确蓝叶虫微孢子虫的分类学地位,为深入探究RPB1基因编码蛋白的具体生物学功能奠定基础。【方法】根据家蚕微孢子虫RPB1基因序列,采用Primer Premier 5.0软件设计6对同源引物,利用PCR技术克隆蓝叶虫微孢子虫RPB1基因片段;通过 GSDS、SMART、DNAstar、MEGA4.1等生物信息学分析软件对蓝叶虫微孢子虫RPB1基因片段进行系统发育分析。【结果】克隆得到了蓝叶虫微孢子虫RPB1基因片段序列,在GenBank登录号为KJ728831。该基因片段的长度为2 933 bp,包含一个长为2 922 bp的开放读码框,预测编码的蛋白质由974个氨基酸组成,蛋白分子量为109.38 kD,等电点为7.087。蓝叶虫微孢子虫RPB1基因片段结构为单外显子结构,编码的蛋白含有4个结构域：RPOLA_N、RNA_pol_Rpb1_4、RNA_pol_Rpb1_5和RNA_pol_Rpb1_6。其中,RPOLA_N结构域在原核和真核生物中都是非常重要的结构域。该蛋白质的二级结构主要由4种形式组成：α螺旋、无规则卷曲、延伸链和β转角。α-螺旋和无规则卷曲所占比例相当高,延伸链主要位于α-螺旋和无规则卷曲之间。N-末端以α-螺旋的形式存在。多序列比对与系统进化分析发现,蓝叶虫微孢子虫和Nosema bombycis、N. trichoplusiae、Nosema sp. CPP、N. fumiferanae、N. disstriae、N. tyriae、N. granulosis 7种Nosema属微孢子虫聚类在同一进化支。蓝叶虫微孢子虫RPB1基因编码的蛋白与同一进化支上的其他7种微孢子虫RPB1基因编码的蛋白相似度在81.9%-99.6%,分化度在0.004-0.049。蓝叶虫微孢子虫与N. bombycis的RPB1基因序列相似性高达99.6%,并与N. bombycis具有非常近的亲缘关系。【结论】成功克隆了蓝叶虫微孢子虫RPB1基因片段,对其系统进化分析进一步证实了蓝叶虫微孢子虫确实属于Nosema属。     

玉米MIR基因转录起始位点预测方法研究

MIR基因是由RNA聚合酶Ⅱ指导转录的,其核心启动子区域具有保守的顺式作用因子,主要是基因-30的TATA和-75的CAAT的特征,开发出一种转录起始位点的预测方法.利用该预测方法,对用深度测序技术获得的玉米胚萌发阶段杂种优势相关miRNA的编码MIR基因进行了顺式作用元件分析,得到了其转录起始位点和启动子区序列特征.同时,利用5'RACE技术对预测的一些转录起始位点进行了验证,证明该预测方法是可行的.     

东方蜜蜂微孢子虫丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因的 生物信息学分析

旨在解析东方蜜蜂微孢子虫丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（serine/threonine protein kinase）基因STPK的理化性质和分子特性，并对东方蜜蜂微孢子虫和其他微孢子虫的STPK进行结构域和保守基序预测及系统进化分析，以期丰富东方蜜蜂微孢子虫的STPK信息，并为深入开展STPK的功能研究提供基础。通过Expasy网站上的相关软件预测和分析STPK的理化性质、信号肽、磷酸化位点、二级结构和三级结构。使用MEME软件预测东方蜜蜂微孢子虫和其他物种STPK的保守基序。通过Mega 11.0软件对东方蜜蜂微孢子虫和其他物种的STPK进行氨基酸序列多重比对，并采用邻接法构建基于STPK的系统进化树。结果显示：东方蜜蜂微孢子虫STPK基因含2 595个核苷酸，编码的STPK蛋白含864氨基酸。分子量约为101.08 kDa，分子式为C₄₅₂₈H₇₁₅₀N₁₁₆₂O₁₃₇₉S₃₆，脂溶系数为88.48，等电点为5.47；STPK包含40个丝氨酸磷酸化位点，24个酪氨酸磷酸化位点及23个苏氨酸磷酸化位点。东方蜜蜂微孢子虫与其他9个微孢子虫及柑橘凤蝶（Papilio xuthus）的STPK均含有2个相同的结构域（PK_Tyr_Ser_Thr和Pkinase）与5个相同的保守基序（Motif 1, Motif 2, Motif 3, Motif 4和Motif 5）。东方蜜蜂微孢子虫与其他9个微孢子虫的STPK序列一致性介于38.14%~61.06%，东方蜜蜂微孢子虫和蜜蜂微粒子虫的STPK序列一致性最高（61.06%）。东方蜜蜂微孢子虫STPK（AAJ76_500008712）与颗粒病微粒子虫（Nosema granulosis）STPK（KAF9763807.1）聚为一支，微孢子虫属（KAH9412228.1）、脑炎微孢子虫（KAG5858968.1）和兔脑炎微孢子虫（ECU01_1320）的STPK聚为一支，康氏泰罗汉孢虫（KAF7683612.1）和蝗虫微孢子虫（AAT12343.1）聚为一支。研究结果明确了STPK的理化性质和分子特性，揭示东方蜜蜂微孢子虫和上述其他9种微孢子虫的STPK具有较高的保守性。     

东方蜜蜂微孢子虫RRDRP的分子特性及系统进化分析

【目的】通过对东方蜜蜂微孢子虫和其他物种的Rad18-like重组与DNA修复蛋白(Rad18-like recombination and DNA repair protein, RRDRP)进行系统进化分析,为进一步研究其功能提供理论依据。【方法】利用Protparam、ProtScale和SWISS-model等软件分析RRDRP的理化性质、亲水性和三级结构。利用SignalP 4.1 Server、NetPhos 3.1 Server、TMHMM和SOPMA等软件预测RRDRP的信号肽、磷酸化位点、跨膜结构域及二级结构。使用PSORTⅡ软件预测RRDRP蛋白的亚细胞定位。使用MEME软件预测东方蜜蜂微孢子虫和其他物种RRDRP的保守基序。通过Mega 11.0软件对东方蜜蜂微孢子虫和其他物种的RRDRP进行氨基酸序列多重比对,并采用邻接法构建系统进化树。【结果】东方蜜蜂微孢子虫RRDRP基因含有2 928个核苷酸,可编码975个氨基酸,分子质量约11.50 ku,脂溶系数93.58,等电点6.63,分子式C₅₁₃₅H₈₂₅₃N     

基于纳米孔全长转录组数据完善东方蜜蜂微孢子虫的基因组注释

【目的】利用已获得的纳米孔全长转录组数据对现有的东方蜜蜂微孢子虫（Nosema ceranae）参考基因组的基因序列和功能注释进行完善。【方法】采用TransDecoder软件预测东方蜜蜂微孢子虫基因的开放阅读框（open reading frame,ORF）及相应的氨基酸。利用gffcompare软件将全长转录本与参考基因组注释的转录本进行比较,对基因组注释基因的非编码区向上游或下游延伸,修正基因的边界。利用MISA软件鉴定长度在500 bp以上的全长转录本的简单重复序列（simple sequence repeat,SSR）位点,包括单核苷酸重复、双核苷酸重复、三核苷酸重复、四核苷酸重复、五核苷酸重复、六核苷酸重复、混合SSR等类型。通过Blast工具将鉴定到的新基因和新转录本比对Nr、KOG、eggNOG、GO和KEGG数据库,从而获得功能注释。【结果】共预测出2 353个完整ORF,其中长度分布在0—100个氨基酸的ORF最多,占总ORF数的72.12%。共对东方蜜蜂微孢子虫的2 340个基因进行了结构优化,其中5′端延长的基因有1 182个,3′端延长的基因有1 158个。共鉴定到1 658个SSR,其中单核苷酸重复、双核苷酸重复、三核苷酸重复、四核苷酸重复的数量分别为1 622、23、7和6个;单核苷酸重复类型的SSR密度最大,达到182.32个/Mb,其次为混合SSR、双核苷酸重复和三核苷酸重复,分别达到6.90、2.78和0.73个/Mb。共鉴定出954个新基因,其中分别有951、333、371、422和321个新基因可注释到Nr、KOG、eggNOG、GO和KEGG数据库。此外,还鉴定出6 164条新转录本,其中分别有6 141、2 808、2 932、3 196和2 585条新转录本可注释到Nr、KOG、eggNOG、GO和KEGG数据库。新基因和新转录本注释数量最多的物种均为东方蜜蜂微孢子虫,其次是蜜蜂微孢子虫（Nosema apis）。【结论】研究结果较好地完善了现有的东方蜜蜂微孢子虫参考基因组已注释基因的序列和功能注释,并补充和注释了大量参考基因组未注释的新基因和新转录本。     

家蚕微孢子虫类枯草杆菌蛋白酶Nbslp2的保守性及转录活性分析

为研究家蚕微孢子虫类枯草杆菌蛋白酶Nbslp2的保守性及转录活性,采用生物信息学相关软件对微孢子虫类枯草杆菌蛋白酶slp2基因共线性、多重序列及系统进化进行比对分析,并通过Western blot分析Nbslp2在家蚕微孢子虫、柞蚕微孢子虫及纳卡变形微孢子虫中的表达特征,以验证其保守性;进一步以感染家蚕微孢子虫不同天数的家蚕中肠组织为材料,利用RT-PCR检测Nbslp2的转录活性。共线性、多重序列比对及系统进化分析发现,Nbslp2在微孢子虫基因组中的位置较保守,Western blot结果显示Nbslp2抗体在柞蚕微孢子虫总蛋白中杂交出2条带,而在纳卡变形微孢子虫没有杂交条带,说明Nbslp2相对保守,并且可将Nbslp2作为区分柞蚕微孢子虫和纳卡变形微孢子虫的靶标;RT-PCR结果显示Nbslp2在感染家蚕微孢子虫后72 h检测到转录活性,进一步推测Nbslp2可能在家蚕微孢子虫感染家蚕早期发挥作用,为分子水平深入研究Nbslp2的功能奠定理论基础。     

1株抗生素耐药微小脲原体hebnu3h07的全基因组测序及序列分析

目的对1株从患者标本分离出的具有耐药性的微小脲原体hebnu3h07进行全基因组测序和生物信息学分析,为深入研究微小脲原体的基因组学特征及耐药机制提供依据。方法对从临床分离的微小脲原体hebnu3h07株进行培养鉴定并进行药敏试验,采用Ion torrent高通量测序技术对其进行全基因组测序,再使用相关软件对测序数据进行基因组组装、基因预测与功能注释、共线性分析、直系同源簇(COG)聚类分析、菌株分型和介导耐药的相关基因检测分析。结果微小脲原体hebnu3h07株对数种抗生素表现出不同程度的耐药性,其完整基因组大小为723 292bp,GC含量为25.4%,与现存3株微小脲原体完整序列比对发现其基因组序列较为保守,多位点序列分型属于ST1型,对介导耐药的基因检测发现数个突变位点。结论通过对此株抗生素耐药的微小脲原体的全基因组测序和导致耐药的基因位点分析,丰富了我国微小脲原体基因组数据,为微小脲原体的耐药机制研究提供了依据。     

10株微孢子虫Hsp70基因克隆及系统发育分析

对10株不同来源的微孢子虫Hsp70基因部分序列进行扩增,并进行了系统发育分析,结果表明:所设计的引物可以有效地扩增出10株家蚕等昆虫微孢子虫Hsp70基因中1136 bp大小的片段。遗传距离矩阵和系统发育分析表明,家蚕微孢子虫与野外昆虫微孢子虫的亲缘关系密切,再次从分子水平上证明了家蚕病原微孢子虫来自环境中的野外昆虫微孢子虫的可能性;不同微孢子虫在不同寄主中的寄生生活是一个相互选择和适应的过程;微孢子虫Hsp70基因具有遗传多样性;家蚕微孢子虫是一个种复合体。     

广西昆虫微孢子虫资源调查及其特性分析

[目的]全面掌握广西昆虫微孢子虫资源及其分布情况,并进行感染性和分类研究,为经济昆虫微孢子虫病的防控提供参考依据.[方法]通过人工捕捉或诱虫灯引诱方式在广西蚕区的桑园、菜地及周围收集野外昆虫,显微镜检验各种野外昆虫微孢子虫的自然感染率;通过生物试验鉴定部分野外昆虫微孢子虫对家蚕的食下感染性,并分别检测桑尺蠖微孢子虫和菜粉蝶微孢子虫对原始寄主的胚种传染性;基于SSU rRNA序列构建昆虫微孢子虫系统发育进化树,明确昆虫微孢子虫的分类特征.[结果]广西昆虫微孢子虫资源分布广泛,大部分昆虫已感染微孢子虫,其中菜粉蝶、稻纵卷叶螟、桑螟、桑尺蠖、斜纹夜蛾和红腹灯蛾的微孢子虫自然感染率分别为54.95%、4.38%、0.08%、0.28%、0.64%和1.14%,其他鳞翅目昆虫的总体微孢子虫感染率为0.75%.部分昆虫微孢子虫可食下感染家蚕,交叉感染率达40.00%;部分昆虫微孢子虫还具有很强的胚种传染力,其中桑尺蠖微孢子虫和菜粉蝶微孢子虫对原始寄主的胚种传染率分别为77.48%和66.15%.从桑尺蠖分离获得的3株微孢子虫虽然为不同的微孢子虫,但均属于Nosema属,与家蚕微孢子虫同属异种.[结论]在广西各地区存在丰富的昆虫微孢子虫资源,种类多样,且大部分昆虫微孢子虫属于Nosema属,与家蚕微孢子虫亲缘关系密切;部分野外昆虫微孢子虫还对家蚕形成交叉传染危害的风险,因此杜绝昆虫微孢子虫污染桑叶交叉感染家蚕是控制家蚕微粒子病发生的重要措施.     

兰花eIF5A基因家族鉴定与生物信息学分析

为了系统分析兰花真核翻译起始因子5A(Eukaryotic translation initiation factor 5A,eIF5A)基因家族在兰花中如何发挥作用,利用兰花基因组数据库,通过生物信息学的方法,鉴定兰花eIF5A基因家族的基因结构、编码蛋白和磷酸化位点预测,通过序列比对进行进化分析。结果表明,兰花eIF5A基因家族含有eIF5A1和eIF5A2两个基因,分别含有5个和6个外显子。MEME保守基序分析显示,兰花eIF5A1和eIF5A2蛋白均含有1个保守的DNA结合寡核苷酸结合结构域(PF01287)。磷酸化位点预测分析表明兰花eIF5A1和eIF5A2蛋白均含有大量的潜在磷酸化位点。以上结果将为今后揭示兰花eIF5A1和eIF5A2蛋白的功能提供重要的线索。     

PMC47-8株OmpH蛋白结构的初步预测

[目的]初步预测牦牛源多杀性巴氏杆菌C47-8株(PmC47-8)OmpH蛋白结构特点。[方法]对PmC47-8型菌株OmpH基因的测序结果进行在线BLAST比对、信号肽预测、二级结构预测及蛋白特性等方面的分析。[结果]PmC47-8株OmpH基因与已公布的81条OmpH基因相似性在84%～99%间;OmpH蛋白序列中存在信号肽,切割位点在第20号和21号氨基酸残基之间;OmpH蛋白二级结构预测中,折叠结构占49.8%,环状结构占50.2%;推测OmpH蛋白有7个O型糖基化位点,分别是位于第2、45、48、330、716、721、723号位的氨基酸残基,2个N型糖基化位点,即第15和35号位的氨基酸残基。[结论]该蛋白可能存在于细胞菌膜的外侧,而非跨膜蛋白。     

PmC47-8株OmpH蛋白结构的初步预测(英文)

[目的]对牦牛源多杀性巴氏杆菌C47-8株(PmC47-8)OmpH蛋白结构进行初步预测。[方法]对PmC47-8型菌株OmpH基因的测序结果进行在线BLAST比对、信号肽预测、二级结构预测及蛋白特性等方面的分析。[结果]PmC47-8株OmpH基因与已公布的81条OmpH基因相似性在84%～99%间;OmpH蛋白序列中存在信号肽,切割位点在第20号和21号氨基酸残基之间;OmpH蛋白二级结构预测中,折叠结构占49.8%,环状结构占50.2%;推测OmpH蛋白有7个O型糖基化位点,分别是位于第2、45、48、330、716、721、723号位的氨基酸残基,2个N型糖基化位点,即第15和35号位的氨基酸残基。[结论]该研究为牦牛源OmpH基因的免疫研究奠定基础。     

小麦转基因系中B、D基因组上的Bar基因转移至联合山羊草中的风险评价

通过调查杂交和回交后代的结实率 ,评价小麦转基因系中位于 B、 D基因组上的 Bar基因向联合山羊草转移的风险。B基因组含有 Bar基因的 Bobwhite 3 1系、D基因组含有 Bar基因的 Bobwhite 71系和联合山羊草作为亲本。采用不去雄、天然授粉 ,去雄、天然授粉和去雄、人工授粉 3种授粉方式以鉴定不同授粉方式对 Bar基因转移的影响 ;通过测定回交后代 Bar基因抗性植株的比例对分别位于 B基因组和 D基因组中的Bar基因进行安全评价。结果表明 ,在不去雄、天然授粉的条件下 ,结实率是非常低的 ,在本次试验中未得到种子。但是 ,在人工授粉条件下 ,可以获得杂种。基因位点在 B基因组或在 D基因组上 ,Bar基因的转移有很大差别。位于 B基因组上 Bar基因向联合山羊草转移比位于 D基因组上的 Bar基因更为困难。因为小麦基因组构成为 AABBDD,联合山羊草为 CCDD,它们有公共的 D基因组 ,在配子形成时 D基因组的染色体不会形成单价体而丢失。试验中 ,( 71系×联合山羊草 )×联合山羊草群体中 Bar基因抗性植株比例较高 ,( 3 1系×联合山羊草 )×联合山羊草未检出抗性植株。因此 ,B或 A基因组带 Bar基因的转基因小麦可以用来控制杂草 ,以减轻抗性基因从转基因小麦中向联合山羊草转移的风险。     

74种鸟类线粒体基因组碱基组成及特征分析

 在鸟类线粒体基因组中,不同物种的线粒体碱基组成和特性存在明显的差异。截至2008年5月,GenBank细胞器基因组资源数据库共公布了74种鸟类线粒体全基因组数据。本研究利用已公布的鸟类线粒体基因组全序列分析其碱基组成特征。结果表明：(1)鸟类线粒体基因组密码子第二位的GC含量值波动范围十分狭窄,而密码子第三位的GC含量值波动范围很大。(2) 密码子第三位碱基中C的含量波动范围较大,为32.60%-50.70%。(3)线粒体基因组GC含量主要由密码子第三位的碱基C和T的变化引起。(4)密码子第三位碱基的GC含量与线粒体基因组的GC含量的变化存在相关性。这些结果,为今后鸟类线粒体基因组的深入研究提供借鉴和参考资料。     

玉米黑粉菌基因组编码蛋白作用位点的计算机预测

利用已公布的玉米黑粉病菌基因组全序列数据及信号肽预测软件SignalP v3．0、亚细胞器中蛋白定位分布预测软件TargetP v1．01、跨膜螺旋结构预测软件TMHMM v2．0和膜锚定位点预测软件Big-PI Predictor预测分析了玉米黑粉病菌基因组编码蛋白的作用位点。结果表明,在6522个ORF中,具有分泌功能的有543个,占全基因组基因总数的8．3％;作用位点在线粒体的有1552个,占全基因组基因总数的23．4％;具有跨膜结构的有1269个,占全基因组基因总数的19．5％;锚定在膜上的有56个,占全基因组基因总数的0．9％。     

一种实用的双链RNA病毒基因组克隆方法

以克隆水稻矮缩病毒(Rice dwarf virts,RDV)基因组片段S11、S12为例,报道一种克隆植物dsRNA病毒基因组的方法.具体过程为:利用T4 RNA连接酶将5′-磷酸、3′-氨基修饰的引物Primer 1连接到RDV病毒基因组第11、12片段dsRNA的3′-OH端,经逆转录、退火、补齐形成全长双链cD-NA,使用单一的互补引物Primer 2进行PCR扩增,扩增产物克隆在pMD 18-T载体上,对重组子进行两次限制性内切酶分析,结合序列测定分离鉴定S11、S12.结果表明,这种方法能同时克隆RDV基因片段S11、S12,是一种有效实用的dsRNA病毒基因组克隆方法.     

对虾科物种线粒体基因组特征和系统发育分析

本研究综合分析了对虾科（Penaeidae）21个物种线粒体基因组的全序列,发现其线粒体基因组的长度为15893~16071 bp,A+T含量为64.59%~70.61%。Ka/Ks分析表明,对虾科物种线粒体13个蛋白质编码基因（protein-coding genes, PCGs）中,atp8基因的Ka/Ks最高,表明在对虾科中atp8基因受到了较弱的选择压力;在差异位点的分析中,发现nd5和rrnL基因的差异位点比例较高,是理想的分子标记,可用于分析对虾不同群体之间的遗传多样性;在密码子的使用中,被编码的氨基酸均体现相似的偏好性。同时,本研究采用ML（maximum likelihood）和BI（bayesian inference）方法构建系统发育树,结果显示,这两种方法构建的系统发育树拓扑结构完全一致,且同属物种也都归为一类或者单独归为一支。本研究为快速鉴定对虾科生物提供了可靠的分子标记,为分析对虾科物种遗传多样性提供理论依据。     

基因组时代的植物系统发育研究进展

系统发育研究是进化生物中的基本问题,也是其他众多生物学分支学科的基础问题,其核心在于研究不同生物类群间的亲缘关系与进化命运。利用分子数据研究生物之间的进化关系是系统发育研究的重要手段。随着测序技术的提升和测序成本的持续下降,系统发育研究由早期基于单基因或联合少数片段逐步发展到现阶段利用大规模基因组数据对个体、群体、物种以及更高水平的进化关系进行探讨。讨论了目前植物体内的3套基因组(叶绿体基因组、线粒体基因组与核基因组)在系统发育研究中的代表性成果,总结了植物不同基因组的特征及其在系统发育研究中的优势与局限,探讨了系统发育树构建的主要方法,并对未来研究进行了展望。目前,植物体内的3套基因组适用于不同阶元和类群的系统发育研究,不同基因组之间的遗传特性差异使其在系统发育研究中具备不同的优势和应用:① 叶绿体基因组结构相对简单,序列保守,不易重组,单亲遗传,是广泛应用于系统发育学和进化生物学等研究领域的理想分子数据资源;②植物线粒体基因组序列进化速率较慢,目前仅适用于早期植物和大尺度水平的系统发育研究;③核基因组为双亲遗传,可综合揭示双亲谱系及系统网状进化关系,在系统发育研究中具有巨大的应用潜力。不同建树方法适用于不同特征的数据集,在建树过程中应采用合理的方法避免长枝吸引和不完全谱系分选带来的影响。未来核基因组将成为系统发育研究的主流方向,其双亲遗传特性能够为物种形成过程中的杂交和基因组渗入等事件提供充分的见解。随着越来越多的类群系统位置被确定,物种形成和进化过程中的杂交、回交等双亲遗传,以及核质互作、多倍化、功能适应和趋同进化等问题将会成为系统发育研究的重点。表1参78