猪支原体肺炎可疑肺组织PCR检测方法的建立

建立了病猪肺脏组织的处理方法和DNA提取方法,根据猪肺炎支原体的P36基因设计一对引物,建立猪肺炎支原体PCR检测方法,并对该方法进行了特异性和敏感性试验,使用建立的方法检测了临床样品。结果表明,建立的检测方法能成功从猪支原体肺炎可疑肺组织中扩增出目的条带,成功建立了猪支原体肺炎可疑肺组织PCR检测方法,为该病的诊断提供了条件。     

检测疫苗中猪肺炎支原体污染的PCR-斑点杂交法和套式PCR法比较研究

为建立一种敏感、特异的检测疫苗中猪肺炎支原体污染的方法,设计了猪源支原体PCR通用外套引物和猪肺炎支原体种特异性内套引物及地高辛标记寡核苷酸探针,建立了PCR-斑点杂交技术,应用于猪瘟活疫苗中猪肺炎支原体污染的检测,并与套式PCR技术进行比较研究.结果显示,探针最低检出DNA量为23.4 pg,比套式PCR(最低检出量为62.5 pg)敏感性更高,且探针与鸡毒支原体和大肠杆菌DNA无交叉反应.对来自6个生产厂家共90批疫苗的检测结果显示,PCR-斑点杂交法比套式PCR法对疫苗猪肺炎支原体污染的检出率高10%.以上结果表明PCR-斑点杂交法具有更高的敏感性和特异性,在疫苗猪肺炎支原体污染的检测中具有推广应用价值.     

猪肺炎支原体人工感染引起易感猪各肺叶病变差异的研究

为研究猪肺炎支原体对易感猪肺脏及各肺叶部位的损伤差异性,选二元猪(大白×二花脸)和三元猪(杜洛克×长白×大白) 2个品系,共6批次的猪肺炎支原体(Mhp)阴性猪,经人工"气管定位注射"途径感染猪肺炎支原体,于感染后28 d剖检,通过肉眼观察,运用"猪支原体肺炎的肺病变28分制评分法"对肺脏及各个肺叶部位所显示的病变情况进行测算、评分、统计和分析,并对所收集的肺泡灌洗液(BAFL)中猪肺炎支原体病原进行PCR检测。结果表明:猪肺炎支原体能引起肺脏各个肺叶产生特异性"虾肉样"病变,该病变主要呈现在心叶和尖叶部位。不同肺叶所呈现的病变程度存在一定的差异,其中猪肺炎支原体对心叶造成病变最严重,且右心叶比左心叶严重。猪肺炎支原体引起的右肺的病变程度高于左肺,推测其在右肺部位的定植水平可能高于左肺。通过猪肺炎支原体人工感染引起易感猪各肺叶病变差异的研究,为丰富猪支原体肺炎的临床诊断方法和致病机制、疫苗免疫效果评价研究提供了参考依据。     

猪肺炎支原体与猪鼻支原体分离鉴定及鉴别检测

为建立猪肺炎支原体与猪鼻支原体的鉴别诊断方法,对从河南省及周边地区猪场采集的患呼吸道疾病的猪只样品进行支原体的分离培养,针对猪肺炎支原体与猪鼻支原体设计了2对引物,扩增片段大小分别为480 bp和360 bp,对所分离纯化的病原微生物进行了菌落形态观察及分子鉴定。结果显示,分离的病原微生物为支原体,菌落呈典型的"煎蛋样"特征;通过单一PCR扩增反应,分别得到了猪肺炎支原体与猪鼻支原体相应的目的扩增片段。表明分离到了猪肺炎支原体与猪鼻支原体。在单一扩增的基础上,建立了猪肺炎支原体与猪鼻支原体二重PCR反应方法,可同时得到2条目的条带,与单一PCR扩增结果一致。表明建立的二重PCR方法可用于猪肺炎支原体与猪鼻支原体的同时检测和鉴别诊断。     

猪肺炎支原体气溶胶富集检测技术的建立(英文)

[目的]建立一个高效的猪肺炎支原体气溶胶富集和检测技术,以弥补临床上猪肺炎支原体气溶胶检测技术的空白。[方法]结合液体冲击式采样器和过滤式采样器的原理,自行设计一个气溶胶双重富集装置,并在密闭环境下采集人工制备的猪肺炎支原体气溶胶,荧光定量PCR检测以确定该装置的采集效率。再通过收集不同猪群中的气溶胶进行检测以确定该装置临床应用的可行性。首先,收集人工感染Mhp阴性仔猪后不同时间猪舍内的气溶胶;其次,收集1个猪支原体肺炎发病猪场和1个阳性未发病猪场的产房、保育舍和育肥舍共11个猪舍的气溶胶,荧光定量PCR或套式PCR检测所收集的气溶胶。[结果]实验室模拟采样的采集效率达到(37.04±6.43)%,人工感染猪肺炎支原体后7天即在饲养房间的气溶胶中检到猪肺炎支原体;2个猪场共11个不同猪舍气溶胶中猪肺炎支原体检测结果均为阳性,检出率100%。[结论]成功建立了一个高敏感性的猪肺炎支原体气溶胶富集检测技术,适用于临床上猪肺炎支原体气溶胶的检测。     

猪肺炎支原体的分离方法

为了寻求分离猪肺炎支原体更好的方法,本试验采用剪碎法、研磨法、匀浆法和灌洗法对猪肺组织进行处理,并研究了不同肺脏组织处理方法对猪肺炎支原体活力的影响。结果显示,剪碎法与灌洗法获得的处理液对猪肺炎支原体的影响小于研磨法与匀浆法。采用剪碎法、灌洗法和研磨法对100份猪肺组织进行猪肺炎支原体野毒株分离的结果显示,经PCR鉴定,剪碎法分离到1株猪肺炎支原体,分离率为1%;研磨法分离到7株猪肺炎支原体,分离率为7%;灌洗法分离到2株猪肺炎支原体,分离率为2%。以上结果表明,研磨法获得的组织处理液对支原体活力有一定的影响,但其分离率好于剪碎法和灌洗法。因此,研磨法是一种较好的猪肺炎支原体分离方法。     

PCR技术检测猪肺炎支原体的研究进展(英文)

猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneu-moniae)是引起猪支原体肺炎的重要病原,该病常引起继发感染和混合感染,严重威胁养猪业发展,引起巨大的经济损失。利用PCR技术对猪支原体肺炎早期正确诊断具有非常重要的意义。本文从猪肺炎支原体的特异性靶基因、临床样品采集方法及样品DNA处理方法关键技术因素及普通PCR技术、多重PCR技术、套式PCR技术、荧光定量PCR技术、芯片检测、环介导等温扩增技术等在猪肺炎支原体检测中的研究进展、主要优缺点及应用进行综述,为有效地诊断和防治气喘病提供便利。     

猪肺炎支原体PCR检测方法的建立及初步临床应用

根据GenBank中猪肺炎支原体（Mhp）J株P36蛋白基因（登录号X67286）的核苷酸序列设计1对引物,建立了快速检测Mhp的PCR方法。该方法能扩增出948bp的Mhp特异性条带,其敏感性达到可检测出0．735ng的MhpDNA,但对鸡毒支原体、猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒、猪流感病毒、猪呼吸与繁殖综合征病毒均未检测出相应目的条带;将克隆获得的目的片段与GenBank已发表的MhpJ株的P36基因进行比较,同源性达到99．9％。采用所建立的PCR方法对42份疑似猪支原体肺炎（MPS）病料进行临床诊断,发现有13份呈阳性（31．0％）。可见,该PCR方法适合于MPS的临床诊断,可为其防控提供可靠依据。     

猪鼻支原体套式PCR诊断方法的建立及应用

为建立猪鼻支原体快速诊断方法,根据猪鼻支原体P69基因序列设计2对引物,建立了猪鼻支原体套式PCR诊断方法,对建立的方法进行特异性、敏感性检测,同时进行临床检测。结果表明,应用建立的套式PCR方法对猪鼻支原体DNA的检出限为1.4×10~(-5)ng/μL,与常见感染猪的细菌、病毒均无交叉反应。利用建立的套式PCR方法对23份临床样品进行检测,阳性检出率为73.9%。本研究建立的猪鼻支原体套式PCR具有特异性强、敏感性高等优点,可用于猪鼻支原体的临床诊断。     

猪支原体肺炎的流行病学调查及病理学诊断

对陕西省宝鸡、杨凌地区感染猪支原体肺炎的病例进行流行病学调查和症状观察.结果表明,不同年龄、性别和品种的猪均能感染猪支原体肺炎,但其中哺乳仔猪及幼龄猪发病率及病死率最高;临床症状可表现为急性、慢性或隐性经过.病理剖检和组织学观察表明,MPS病理变化的主要特征是融合性支气管肺炎,于肺脏的不同部位呈"肉样"实变;组织学变化主要以细支气管腔和肺泡腔内细胞浸润为特征.     

利用巢式PCR和荧光定量PCR比较检测猪场中感染猪肺炎支原体研究(英文)

[目的]2012年3月至12月从江苏泰州某猪场采集303份鼻拭子样品,利用巢式PCR和荧光定量PCR比较检测猪肺炎支原体的感染情况。[方法]采集7、14、21、28、30和35日龄的猪的鼻拭子,4℃浸泡于PBS过夜,TIANamp?细菌DNA提取试剂盒提取DNA。然后进行Mhp183的荧光定量PCR及P36的巢式PCR检测。[结果]通过巢式PCR检测,12.5%(38/303)份样品为猪肺炎支原体阳性,用荧光定量PCR检测,50.2%(152/303)的样品为阳性。两种方法检测均为阳性的样品为22份,占7.3%,两种方法检测均为阴性的样品为127份,占41.9%。两种检测方法的感染模式相同,均在7日龄和35日龄的小猪中感染率最高,巢式PCR的感染率分别为15.6%和18.4%,荧光定量PCR的感染率分别为53.1%和56.6%。[结论]两种PCR方法均适用于猪场感染状态的检测。     

Immune Responses to the Attenuated Mycoplasma hyopneumoniae 168 Strain Vaccine by Intrapulmonic Immunization in Piglets

To investigate the immune responses to the attenuated Mycoplasma hyopneumoniae 168 strain vaccine, 8-15 d old piglets were immunized with M. hyopneurnoniae 168 strain vaccine by intrapulmonic route. And the specific IgG antibody in serum, lymphoproliferation, IFNT, and specific secretory IgA （SIgA） antibody in bronchoalveolar lavage fluid were detected on 30 and 60 d post-immunization （DPI）, respectively. On 60 DPI, all the pigs except for those in health control group were challenged with a field M. hyopneumoniae strain JS. Necropsy was performed on 30 d post-challenge （DPC）. The results showed that IFN7 and specific SIgA were stimulated on surface of respiratory tract after immunization. And peripheral blood mononuclear cells could also be proliferated about 1.81 and 2.12 fold on 30 and 60 DPI when stimulated by M. hyopneumoniae protein in vitro. However, no serum IgG antibody against M. hyopneumoniae was detected during the whole immune phage. After challenge, vaccinated pigs were observed with only very slight histological lesion in individual lobes. None of vaccinated pigs showed any clinical signs. While the unvaccinated pigs from challenge control group showed varying degrees of clinical sign and severe macroscopical lesion of mycoplasmal pneumonia of swine （MPS）. The result suggested that the attenuated M. hyopneumoniae 168 strain vaccine inoculated by intrapulmonic route could activate the systemic cellular immunity, the local mucosal immunity and IFNγ secretion in respiratory tract to against M. hyopneumoniae infection in piglets.     

猪圆环病毒2型与猪支原体混合感染的诊断

2015年1月,河南某地猪场60日龄仔猪出现腹泻、呼吸困难并伴有后肢端坐状咳嗽为主要特征的疾病。PCR检测PCV2和MH均为阳性,结合发病情况、临床症状和剖检变化,诊断为猪圆环病毒2型与猪支原体混合感染。     

猪支原体肺炎发生的品种敏感差异及分子基础

【目的】检测并验证猪支原体肺炎发生的品种敏感差异,筛选相关差异表达基因,探究猪支原体肺炎发生的分子遗传基础,为猪该病发生的分子机制研究提供依据。【方法】以对肺炎支原体易感的梅山猪、耐受的长白猪及二者杂交选育的苏钟猪为材料,设立试验组（15头/品种）和对照组（5头/品种）,试验组猪接种肺炎支原体 Js 强毒株,对照组猪注射等量生理盐水,所有猪隔离、无抗生素饲养,监测临床表现;处理后18、28 d测定日增重、抗体水平及肺部病变,28d试验结束时集中屠宰,评定肺部损伤,检测病原,确定肺炎支原体感染情况;选择肺炎支原体感染的梅山、长白、苏钟猪各2头,未感染猪各2头,构成芯片杂交试验猪群,应用Agilent猪表达谱基因芯片及品种内、品种间双重比较法,筛选差异表达基因,结合Gene Ontology（http://www. geneontology.org）及KEGG (http://www.genome.jp/kegg/)分析差异基因涉及的信号通路及调控网络。【结果】肺炎支原体处理后1-18d,试验组猪平均日增重显著低于对照猪 (0.01＜P＜0.05),尤以梅山猪较为典型;19-28d,体重出现负增长,平均日增重极显著低于对照猪(P＜0.01)。同时,病原处理后18d,长白猪和苏钟猪抗体水平变化不大,仍表现为阴性(s/p＜0.3),而梅山猪抗体水平则迅速上升至阳性水平(s/p ≥ 0.4),并显著高于长白、苏钟猪(均为0.01≤P＜0.05);处理后28d,梅山猪抗体水平高达（0.97±0.26）,极显著高于长白(0.15±0.10)、苏钟猪(0.46±0.20)(均为P＜0.01)。而试验组猪在病原接种后的18d,梅山猪有11头表现出明显的支原体肺炎临床症状,长白猪仅2头出现轻微咳嗽,苏钟猪则有5头出现咳嗽、精神萎靡等初期病状;处理后23d,试验组1头梅山猪死于肺炎支原体感染;处理后28d,试验组梅山猪全部表现出支原体肺炎症状,长白猪7头出现初期感染症状;苏钟猪5头症状典型,6头稍有咳嗽,其余无明显异常。猪肺炎支原体检测与上述结果大体一致。试验猪的肺部X-ray透射及病理剖检结果则表明：处理后18d,试验组15头梅山猪肺部均见云絮状阴影,其中6头为典型的肺炎感染影像特征;长白猪仅1头出现肺炎影像特征,4头现少量云絮状阴影;苏钟猪病变数量和程度介于长白、梅山猪之间。处理后28d,梅山猪全部表现为典型的肺炎感染影像特征,长白猪和苏钟猪则分别有7头、13头出现肺炎影像特征。肺部病理剖检评分显示,梅山猪极显著高于长白猪(P＜0.01),显著高于苏钟猪( 0.01≤P＜0.05)。表达谱芯片筛选结果表明,支原体肺炎患猪较健康对照猪表达上调基因49个,下调基因70个,涉及免疫反应、补体凝集、类固醇合成及代谢等18条信号调控通路。【结论】猪支原体肺炎的发生确实存在明显的品种间敏感差异,先天性免疫缺陷调控通路、Toll样受体信号通路及类固醇代谢通路在猪支原体肺炎感染炎症反应调控过程中发挥重要作用。     

猪肺炎支原体P46基因的克隆及表达

参考GenBank登录的猪肺炎支原体(Mhp)P46基因序列,利用Primer 5.0软件设计合成引物,通过重叠延伸PCR(SOE-PCR)对猪肺炎支原体P46基因的3个位点进行定点突变,将此突变基因插入到表达载体pET-32a( )中,经IPTG诱导后成功地在大肠杆菌Rosetta(DE3)宿主菌中表达分子量约为63 500的融合蛋白.Western blotting分析表明,该融合蛋白具有较好的免疫原性.为猪肺炎支原体抗体ELISA检测方法的建立奠定了基础.     

1型鸭肝炎病毒R株全基因组分析与检测技术的研究

 【目的】测定1型鸭肝炎病毒（DHV1）毒株R全基因组,建立鸭肝炎病毒1型巢式PCR与实时荧光定量RT-PCR。【方法】设计特异性引物测定DHV1毒株R全基因组,以3D为靶基因序列的引物P1和P2,P3 和P4进行巢式PCR,引物F和R进行实时荧光定量RT-PCR。【结果】序列分析发现该毒株与其它GenBank上发表的DHV1毒株基因组核苷酸序列同源性为94.2%～99.2%,编码聚合蛋白氨基酸序列同源性为98%～98.8%,表明DHV1-R株与其它DHV1毒株之间病毒基因组一级结构有较高的同源性。基因组结构5′UTR-VP0-VP3-VP1-2A1-2A2-2B-2C- 3A-3B-3C-3D-3′UTR在遗传进化关系上与副肠孤病毒属（Parechovirus）亲缘关系较近。参照鸭肝炎病毒1型基因序列设计特异性引物,分别进行巢式PCR和SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR 方法检测鸭肝炎病毒1型, 结果表明巢式PCR敏感性为6 pg•ml-1。实时荧光定量RT-PCR确定特异性产物的Tm值,同时做普通RT-PCR。试验结果表明,特异性产物的Tm值为85.6℃,最低能检测到含0.015 fg•μl-1 阳性质粒标准品。【结论】建立的巢式PCR与SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR 检测方法显示了较好的特异性、敏感性,为鸭肝炎病毒1型的临床检测和流行情况调查提供了新的技术手段。     

猪肺炎支原体PCR鉴定方法的建立

根据猪肺炎支原体的P36基因序列设计一对引物,建立猪肺炎支原体PCR检测方法,并对该方法进行了特异性和敏感性试验。成功建立了猪肺炎支原体特异且敏感的PCR检测方法,可区别猪鼻支原体、絮状支原体和鸡毒支原体,最低检出量为4.26 ng。     

抗猪肺炎霉形体血清在几种血清学反应上的研究 Ⅱ高中剂量浓缩抗原免疫家兔的抗血清

制备的猪肺炎霉形提纯浓缩抗原用其高剂量和中剂量免疫家兔所制造的抗血清,与猪肺炎霉形体提纯浓缩抗原在琼脂——凝胶免疫双扩散及免疫电泳上进行了试验,试验前进行了园盘生长抑制试验,代谢抑制试验,微粒凝体试验等检验了血清效价,试验结果表明高、中剂量的猪炎霉形体提纯浓绪抗原免疫家兔所制抗血清,在免疫双扩散及免疫电泳上均产生特异性反应,形成各种不同的沉淀线、抗血清与正常动物血清则不发生反应。建议在使用血清前进行效力测定。