棉花S-腺苷蛋氨酸脱羧酶基因(GhSAMDC2/3/4)的克隆及其诱导表达分析

利用电子克隆结合RT-PCR技术克隆获得陆地棉(Gossypium hirsutum L.)S-腺苷蛋氨酸脱羧酶(S-adenosylmethionine decarboxylase,SAMDC)基因家族3个基因,分别命名为Gh SAMDC2、Gh SAMDC3和GhSAMDC4。序列分析显示,该基因c DNA包含的upstream ORF(u ORF)和main ORF(m ORF)为植物SAMDC基因特征ORF,其中m ORF长度分别为1068 bp、1110 bp和1032 bp,分别编码355、369和343个氨基酸。聚类分析表明,Gh SAMDC2/3蛋白与可可树(Theobroma cacao)SAMDC聚为一类,且Gh SAMDC2与GhSAMDC3蛋白亲缘关系最近;Gh SAMDC4与拟南芥At SAMDC4聚为一类。实时荧光定量PCR分析表明,Gh SAMDC2在茎中表达相对较高,随着纤维发育其表达量不断增加,在纤维发育后期其表达量达到最高;Gh SAMDC2/3/4在不同的胁迫条件下表现出不同的表达模式,Gh SAMDC2受低温和干旱胁迫诱导最强烈,Gh SAMDC3响应盐胁迫显著,Gh SAMDC4受ABA诱导强烈。上述结果为进一步研究棉花SAMDC基因功能奠定了一定基础。     

棉花GhFTL1基因的克隆及初步功能分析

通过RT-PCR结合RACE技术,从新疆陆地棉品种新陆早33中克隆到一个FT类似基因,命名为GhFTLl基因(登录号:HM631972).该基因ORF(Open Reading Frame)全长为525 bp,可编码174个氨基酸,与其它植物中克隆的FT同源蛋白高度相似,含有FT蛋白亚家族两个关键的氨基酸残基及保守氨基...     

TcLr35小麦β(1,3;1,4)葡聚糖苷酶基因cDNA全长的克隆及分析

根据已发表的植物β(1,3;1,4)葡聚糖苷酶基因设计引物,利用RT-PCR和RACE技术,从被小麦叶锈菌诱导的小麦抗叶锈病基因近等基因系材料TcLr35中获得一个β(1,3;1,4)葡聚糖苷酶基因cDNA全长,命名为PR34,该基因全长序列为1416bp,具有一个编码335个氨基酸的开放阅读框(ORF),其起始密码子ATG位于13bp处,终止密码子TAG位于1015bp处,3'末端有20bp的poly(A)尾,379bp的3'非翻译区。与GenBank中小麦、大麦等多个葡聚糖苷酶基因具有较高同源性;对其推断的氨基酸序列进行分析,含有Glyco_hydro_17保守结构域,为葡聚糖苷酶基因蛋白结构域。Southern杂交显示,该基因在TcLr35小麦基因组中为低拷贝。     

高羊茅光周期调控基因CONSTANS的克隆与分析

本研究以坪用型"黔草1号"高羊茅为实验材料,基于多年生黑麦草CONSTANS(CO)基因序列设计引物,利用3'RACE和5'RACE方法扩增CO基因。结果表明,从高羊茅中分离出CO基因,命名为FaCON-STANS。经序列分析,cDNA全长1557bp,编码376个氨基酸,具有完整的开放阅读框(ORF,166～1296bp),氨基端具有B-box型锌指结构域,碳端具有CCT(CO,CO-like,TOC1)结构域。进一步的同源性分析表明,Fa-CONSTANS蛋白与禾本科植物的CO蛋白亲缘关系较近,与其它植物的亲缘关系较远。     

甜菜NAC转录因子BvNAC46基因的克隆及植物表达载体的构建

以干旱处理的强抗旱甜菜品种HI0466为材料,通过RT-PCR技术克隆到一个甜菜NAC类转录因子基因的cDNA序列,命名为BvNAC46(GenBank登录号:XM_010689163.2)。序列分析表明,该基因序列全长1 047 bp,包含一个576 bp的开放阅读框(ORF),编码191个氨基酸,为稳定的疏水性蛋白,推测理论分子量为88.725 kD,亚细胞定位于细胞核中。含有一个NAM保守结构域,具有NAC转录因子的典型特征。将该基因的cDNA编码序列连接到植物表达载体pCAMBIA2301中,成功构建了甜菜BvNAC46基因的植物表达载体pCAMBIA2301-BvNAC,为进一步通过转基因技术研究该基因的功能提供参考。     

青稞hblt4.2基因的克隆及功能分析

根­据大麦blt14.2基因序列设计引物, 用青稞的DNA为模板扩增低温反应基因的全长序列, 命名为hblt14.2, 在GenBank登录号为EF514912。该基因含470 bp, 包括249 bp的开放阅读框、69 bp的5''非翻译区和152 bp的3''非翻译区, 编码82个氨基酸残基, 富含Gly、Ala、Leu和Val氨基酸, 与其他冷诱导基因编码蛋白具相似性。与大麦blt14.2基因具98.9%同源性, 所编码的蛋白存在2个氨基酸的差别。将hblt14.2基因连接CaMV35S启动子和NOS终止子后定向插入质粒pCAMBIA1301的多克隆位点中, 构建植物表达载体pCAMBIA-BI-hblt, 通过农杆菌介导转化烟草, 并对转基因烟草进行抗寒性检测。结果表明, 青稞hblt14.2基因与植物的抗寒性有一定关系。     

甘蔗CIPK基因的同源克隆与表达

CIPK(calcineurin B-like-interacting protein kinase)是植物特有一类的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,该蛋白在植物响应逆境胁迫中发挥着重要的作用,尤其与非生物逆境胁迫(干旱、高盐、ABA等)的信号传导密切相关。根据玉米CIPK15基因(EU957447.1,2247 bp)核酸序列保守区域设计1对同源克隆PCR引物,以甘蔗品种崖城05-179的c DNA为模板,通过RT-PCR扩增得到甘蔗CIPK基因的一条全长c DNA序列(Gen Bank登录号为KM114052)。序列分析结果表明,甘蔗Sc CIPK基因全长1782 bp,具有完整的开放阅读框(ORF,91~1631 bp),编码513个氨基酸,该基因具有CIPK基因的2个特征结构域(Kc-like superfamily和AMPKA-C-like superfamily)。生物信息学分析显示该基因编码的蛋白定位于内质网,为可溶性蛋白,不存在信号肽,二级结构元件多为α-螺旋,含有多个保守功能域,主要参与中间代谢。实时定量PCR表达分析表明,该基因表达具有组织特异性,虽在甘蔗各组织中均有表达,但在芽中的表达量最高。该基因在PEG、Na Cl、ABA、SA和Me JA的胁迫诱导过程中,受ABA胁迫后表达量最高,约为对照的5.3倍,推测该基因的表达与甘蔗抗干旱和抗渗透胁迫有关。     

柽柳冷适应蛋白基因

冷适应蛋白(CAP)是指生物体受到寒冷刺激后,诱导表达的一类特异蛋白质,由冷诱导有关的基因在冷诱导过程中启动转录和翻译的。低温条件下,冷适应蛋白表达量在持续不断增加,对低温条件下蛋白质合成的调节以及mRNA的折叠起重要作用。是一类重要的与细胞耐寒相关基因。我们从构建的紫杆柽柳(Tamarixandrossowii)cDNA文库中分离得到了冷适应蛋白基因片段,并应用RACE技术获得其全长cDNA序列,该基因cDNA序列长度为1176bp,其中开放读码框(ORF)从49到663碱基位置,长度为615bp,编码204个氨基酸组成的多肽,预测其蛋白质分子量为23kD,预测其理论等电点为9.23。该基因已经在GenBank上注册,其基因序列登录号AY587773,氨基酸序列登录号为AAT01418。该基因的克隆为植物分子育种提供了新的基因资源。     

棉花种子特异表达的LEA启动子克隆及功能验证

以棉花品种新陆早33号为材料,克隆获得其胚胎发育晚期丰富蛋白LEA基因的种子特异性启动子。启动子序列全长为1228bp;作用元件分析表明该区域除了具有启动子核心调控序列外,还含有多个与组织特异性、激素、逆境等表达相关的顺式作用元件,如E-box、ABRE元件、A-box等。与已报道的棉花品种Coker 201的LEA基因D34的5'端上游调控序列1212bp相比,两者具有97%的一致性。拟南芥遗传转化的功能分析结果表明,所克隆的序列能驱动GUS基因在种子中特异表达,且GUS主要在转基因植物的种子发育后期表达;其表达强度要弱于组成型的CaMV35S启动子。研究结果不仅有助于进一步深入认识棉花LEA基因功能及其表达调控规律,也为植物遗传转化提供组织特异性的启动子。     

白菜S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶BrSAMDC基因的克隆、表达及生物信息学分析

S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶(S-adenosylmethionine decarboxylase, SAMDC)是生物体内亚精胺合成过程中的限速酶,在植物生长发育及抗逆境胁迫方面起到重要的调节作用。本研究通过RT-PCR技术从大白菜栽培种Chiifu-401中克隆得到一个BrSAMDC基因,并对其进行表达特性及其蛋白的结构与功能进行生物信息学分析。结果表明,BrSAMDC的cDNA扩增序列为1 566 bp,CDS区为1 107 bp,编码368个氨基酸。定量PCR结果显示,BrSAMDC基因在白菜的各个组织均有较高表达,其中角果中的表达量最高,其次为花、茎和根,而在叶片中的表达量最低。BrSAMDC蛋白分子量为40.52 kD,属于亲水、稳定蛋白;预测其分布于细胞核内,不存在信号肽和跨膜结构域;二级结构中以无规则卷曲和α-螺旋为主,三级结构同源建模成功。14种植物SAMDC蛋白的序列对比分析显示,均含有LSESSLF结构域和PEST结构域,且十分保守;十字花科的SAMDC蛋白同源性较高,且其氨基酸的进化与植物分化具有一致性。本研究为白菜SAMDC基因的功能研究及应用提供数据基础。     

棉花抗坏血酸过氧化物酶基因GhAPX的克隆及耐冷性初步鉴定

抗坏血酸过氧化物酶(ascorbate peroxidase,APX)是活性氧H2O2的清除剂,对抵抗植物逆境发挥着重要的作用。为了探究棉花APX基因的耐冷功能,本实验应用RT-PCR和RACE技术从苗期耐冷型棉花品种‘新陆早25号’叶片中克隆得到一个APX基因GhAPX,并对转基因烟草的主要抗氧化酶活性和快速荧光参数进行了分析。结果表明,该基因c DNA全长1763 bp,开放阅读框1137 bp,编码379个氨基酸。Blastx比对表明该基因与已克隆的棉花气孔APX相似性最高,达99%。进化分析表明该基因与刚毛怪柳关系较近,与拟南芥(AtAPX)和小麦(TaAPX)关系较远。蛋白质结构分析显示该基因属于植物过氧化物酶基因家族,亚细胞定位结果显示该蛋白位于叶绿体中。实验成功构建了植物表达载体PZP35S-GhAPX。转基因研究发现,转GhAPX基因会提高烟草的POD和CAT活性。在4℃冷害条件下,转基因烟草的POD和CAT活性及Fv/Fm和pI均大于野生(对照)株,且下降幅度和速度均小于野生植株,而SOD活性在转基因和野生植株间差异不大,初步推测GhAPX基因可以提高棉花幼苗的低温冷害抵抗力。本研究为揭示GhAPX基因的功能及其与棉花耐冷性的关系提供了理论参考。     

小麦新品种“成电麦1号”α-醇溶蛋白基因的分离与序列分析

以染色体工程方法培育小麦新品种“成电麦1号”基因组DNA为模板,用小麦种子醇溶蛋白保守引物进行PCR扩增。扩增产物经克隆测序,获得978-1310 bp的6个序列（CD-1、CD-9、CD-11、CD-12、CD-17和CD-21）,其中3个序列（CD-1、CD-12、CD-17）编码284~301个氨基酸的α-醇溶蛋白基因,所编码的氨基酸序列在多聚谷氨酰胺区和重复区出现较大差异,在编码序列的半胱氨酸的数量和位置上,CD-1和CD-12序列具有特殊性。与乳糜泻（celiac disease）病人毒性抗原相关序列的比对结果表明CD-12不具有Glia-α20表位,而CD-1和CD-17序列只具有Glia-α9,Glia-α20的抗原序列。根据已发表的小麦A、B或D染色体组的α-醇溶蛋白基因的序列建立系统树,发现所克隆的“成电麦1号”α-醇溶蛋白基因序列具有特殊性,说明染色体工程方法培育的小麦新品种具有较大的种子蛋白基因变异,这些基因对小麦品质育种的作用值得进一步研究。     

棉花精氨酸脱羧酶基因GhADC1克隆与表达分析

以抑制性消减杂交(SSH)文库序列为基础,采用生物信息学和RT-PCR方法从陆地棉中克隆出精氨酸脱羧酶基因,命名为GhADC1,GenBank登录号为KC851856.该基因全长2954 bp,其中5’非翻译区477 bp,具有多个参与胁迫响应的顺式作用元件和一个编码8个氨基酸的微型编码序列(uORF);主编码区(mORF)2181bp,共编码726个氨基酸,其中N端具有叶绿体定位信号肽.推测的GhADC1蛋白具有PLP结合位点及Orn/Dap/Arg脱羧酶的信号位点,属于典型的Ⅲ型PLP依赖型精氨酸脱羧酶家族成员.荧光定量RT-PCR结果表明,正常条件下,GhADC1在叶片中表达量高于茎和根部组织,且在抗黄萎病品种冀棉20中的表达水平高于耐病品种中521;黄萎病菌胁迫能够快速诱导抗病品种根部GhADC1表达,而在耐病品种中未见明显差异,推测在抗病品种中GhADC1可能参与根部对黄萎病菌胁迫的早期应答.     

陆地棉质体转录活性因子基因GhPTAC的克隆及其耐盐性分析

为了挖掘新的耐盐基因及调控途径，利用基因芯片技术及抑制性差减文库技术筛选到质体转录活性因子，通过RACE及RT-PCR技术克隆到该基因的cDNA全长，命名为GhPTAC。该cDNA全长1 564 bp，其中ORF 1 038 bp，推测编码345个氨基酸残基的多肽。生物信息学分析表明GhPTAC为拟南芥PTAC13同源基因，同源性60.6%。编码蛋白为转录活跃的染色体(TAC)的一个组分，参与叶绿体基因组转录终止/抗终止调节。Real-time PCR分析结果表明，GhPTAC受盐胁迫诱导上调表达，在耐盐材料中9806中表达水平明显高于盐敏感材料中S9612，这与芯片结果一致。     

油茶CoUXS1基因全长cDNA克隆及生物信息学分析

为了揭示油茶UDP-葡萄糖醛酸脱羧酶基因的序列特点和结构功能,为该基因的深入研究和开发应用奠定基础。根据油茶种子EST文库中调取的UDP-葡萄糖醛酸脱羧酶基因序列,设计特异引物,利用RT-PCR技术获得该基因全长cDNA克隆,并对其序列进行生物信息学分析。结果表明：该基因阅读框为1032 bp,编码344个氨基酸,具有典型的UXS家族模体序列。与海岛棉GhUXS3基因亲缘关系最近,定位于细胞质,有较强的亲水性,将该基因命名为CoUXS1,GenBank登录号为JN017094。     

铁皮石斛DoSAMDC-like基因的克隆及原核表达

本研究从药用植物铁皮石斛中克隆得到S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶(S-adenosyl-L-methionine decarboxylase)基因(DoSAMDC-like)并进行序列分析和原核表达。SAMDC基因家族具有多个成员,本研究采用同源克隆的方法对铁皮石斛中尚未报道的新成员DoSAMDC-like基因进行克隆,并与拟南芥SAMDC基因家族成员和铁皮石斛基因组注释序列进行比对分析、蛋白质特征及原核表达等分析。基因序列分析表明,DoSAMDC-like基因编码区全长1104 bp,推测编码368个氨基酸,氨基酸序列具有SAM_decarbox超家族共同的保守结构域。多序列比对及进化树结果表明,克隆获得的DoSAMDC-like基因序列对应于基因组测序注释的XM_020825443.2序列,一致性为99.55%,与铁皮石斛SAMDC1基因一致性为80.16%。异源表达结果表明,DoSAMDC-like基因受IPTG诱导,蛋白分子量约为47 kD。DoSAMDC-like基因的克隆和原核表达,可为参与铁皮石斛多胺代谢、生物碱合成相关基因的蛋白质生化活性等研究提供了帮助。     

陆地棉耐盐相关基因GhSAMS的克隆及表达

为了挖掘棉花耐盐相关基因,我们根据陆地棉耐盐性抑制消减文库中的一个S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的同源EST设计引物,利用RACE结合RT-PCR技术克隆陆地棉S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的cDNA全长,命名为GhSAMS。该cDNA全长1 576 bp,ORF为1 182 bp,编码393个氨基酸的多肽。生物信息学分析表明GhSAMS蛋白与拟南芥、盐地碱蓬、水稻中该蛋白的相似性分别为91%、93%和93%。系统发育树结果显示GhSAMS与盐地碱蓬中该蛋白的亲缘关系最近。Real-time PCR分析结果表明,GhSAMS的表达受盐胁迫诱导,在盐敏感材料中诱导被推迟,而且,该基因表达水平在耐盐材料中9835中明显高于在盐敏感材料中S9612中。我们构建了原核表达载体pET28-GhSAMS,经IPTG诱导,实现了GhSAMS在大肠杆菌中的表达,为进一步开展GhSAMS的遗传转化工作奠定了有益基础。     

编码酿酒酵母丙酮酸脱羧酶(Pdc6)基因克隆及其生物信息学分析

旨在从生物信息学角度更好地研究酿酒酵母丙酮酸脱羧酶(Pdc6)的结构和功能,克隆酿酒酵母H5的丙酮酸脱羧酶基因pdc6。利用Primer 5.0软件设计1对20 bp引物,以H5基因组DNA为模板克隆获得pdc6,并利用生物信息学分析方法对其序列进行验证及分析。该序列长度为1692 bp,无碱基缺失,且该基因具有完整的开放阅读框,该基因编码的Pdc6包含563个氨基酸残基,该蛋白质中酸性氨基酸残基数量和碱性氨基酸残基数量大致相同;Pdc6理论等电点5.8,疏水性最大值为2.32,亚细胞定位预测其位于细胞外基质,属于酸性蛋白质,并预测了空间结构模型。本研究说明该蛋白结构与Pdc1和Pdc5结构类似,对酿酒酵母H5编码丙酮酸脱羧酶(Pdc6)基因序列克隆和生物信息学分析后,可为后续单基因敲除选取基因顺序的研究提供一定的理论基础。