白芨环阿屯醇合酶基因BsCAS的克隆及序列分析

环阿屯醇合酶(cycloartenol synthase, CAS)在植物甾醇和三萜类物质的合成途径中发挥重要调节作用,研究白芨环阿屯醇合酶BsCAS的序列信息,为进一步研究环阿屯醇合酶的功能奠定基础。基于白芨转录组数据,利用RT-PCR技术扩增BsCAS基因的CDS全长,通过生物信息学软件分析BsCAS蛋白的理化性质和结构特征,并进行氨基酸多序列比对分析与系统进化树分析。结果表明扩增获得的Bs CAS基因CDS全长为2 277 bp,编码758个氨基酸。BsCAS蛋白是无跨膜结构无信号肽的亲水性蛋白,BsCAS蛋白具典型的DCTAE结构域和QW结构域,属于氧化鲨烯环化酶超基因家族成员。BsCAS与铁皮石斛和小兰屿蝴蝶兰的CAS蛋白具有很高的同源性,亲缘关系最近,并聚为一支。对白芨Bs CAS基因的克隆和序列特征分析为进一步阐明BsCAS基因在调控植物甾醇类物质合成途径中的功能提供数据支持。     

冬凌草HMGS基因的克隆与表达分析

羟甲基戊二酰辅酶A合酶（3-Hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A synthase,HMGS）是甲羟戊酸途径（MVA）中的第一个催化酶。根据冬凌草转录组数据库中HMGS基因序列设计特异引物,采用RT-PCR技术克隆冬凌草IrHMGS基因cDNA全长,并对其序列进行生物信息学分析,通过荧光定量PCR的方法分析其组织表达特性。IrHMGS基因cDNA全长1 382bp,编码460个氨基酸,序列分析结果表明该基因编码的氨基酸序列含有羟甲基戊二酰辅酶A合成酶N末端、C末端等保守结构域。荧光定量PCR表明,IrHMGS在冬凌草组培苗叶和根中的表达量显著高于在组培苗花、茎和愈伤组织中的表达量。本研究为后续深入研究IrHMGS在冬凌草二萜类物质合成途径中的功能奠定了基础。     

草莓叶黄素循环关键酶基因VDE和ZEP的克隆与分析

叶黄素循环在逆境胁迫中对植物光系统起着重要的保护作用。紫黄质脱环氧化酶(VDE)和玉米黄质环氧化酶(ZEP)是调控叶黄素循环的关键酶。本研究采用RT-PCR和RACE技术率先从草莓中克隆获得VDE和ZEP基因。VDE基因c DNA全长1 842 bp,ORF为1 467 bp,编码489个氨基酸;ZEP基因c DNA全长2 325 bp,ORF为1 980 bp,编码660个氨基酸。生物信息学分析表明草莓VDE与ZEP基因所编码的氨基酸序列与蔷薇科的苹果、桃和梅等植物的亲缘关系较近。荧光定量分析发现VDE和ZEP基因在草莓根、茎、叶、花、果实中皆有表达,说明二者均为组成型表达基因,并且叶片中基因的表达量最高而根中最低,推测与其在草莓叶黄素循环调控的作用有关。     

夏枯草苯丙氨酸解氨酶基因的克隆与表达分析

苯丙氨酸解氨酶(PAL)是迷迭香酸合成途径中的关键酶之一,根据其他植物PAL基因的保守区域设计特异引物,利用3’-RACE-PCR技术,本研究首次从夏枯草中克隆得到了PAL基因的cDNA片段序列,命名为PvPAL,Gen-Bank登录号为JN65446。PvPAL基因cDNA片段长1 306 bp,其中编码区域为1 047 bp,编码349个氨基酸。蛋白质序列多重比较结果显示,PvPAL蛋白质序列与丹参、地黄、黄芩、藿香等植物的PAL蛋白质高度同源。PAL系统进化树分析结果表明,PvPAL与唇形科植物的PAL基因亲缘关系最近。组织表达分析结果显示,PvPAL基因在根、茎、叶中均表达,其中根中表达量最高。PvPAL基因的克隆为进一步研究夏枯草迷迭香酸合成的分子机制奠定了基础。     

两个烟草多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因的克隆和表达分析

为了研究多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(PGIP)在烟草中的生物学功能,运用生物信息学方法,结合RT-PCR和SMART RACE技术,从烟草中克隆到2个多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(PGIP)基因c DNA和DNA全长序列,分别命名为Nt PGIP1(Gen Bank登录号:KF317203)和Nt PGIP2(Gen Bank登录号:KF317204)。Nt PGIP1基因全长为1 413 bp,编码338个氨基酸;Nt PGIP2基因全长为1 185 bp,编码329个氨基酸;两基因均没有内含子序列,核苷酸序列有50%的一致性,编码的氨基酸序列有54%的一致性。两基因编码蛋白均含有植物PGIP蛋白特有的重复保守序列LXXLXXLXXLXLXXNXLXGXIPXX。对PGIP基因在烟草不同组织表达量分析发现,两基因在根、茎、叶和芽中均有表达,其中均在茎中表达量最高,其次是根,叶中表达量很低。     

TcLr35小麦β(1,3;1,4)葡聚糖苷酶基因cDNA全长的克隆及分析

根据已发表的植物β(1,3;1,4)葡聚糖苷酶基因设计引物,利用RT-PCR和RACE技术,从被小麦叶锈菌诱导的小麦抗叶锈病基因近等基因系材料TcLr35中获得一个β(1,3;1,4)葡聚糖苷酶基因cDNA全长,命名为PR34,该基因全长序列为1416bp,具有一个编码335个氨基酸的开放阅读框(ORF),其起始密码子ATG位于13bp处,终止密码子TAG位于1015bp处,3'末端有20bp的poly(A)尾,379bp的3'非翻译区。与GenBank中小麦、大麦等多个葡聚糖苷酶基因具有较高同源性;对其推断的氨基酸序列进行分析,含有Glyco_hydro_17保守结构域,为葡聚糖苷酶基因蛋白结构域。Southern杂交显示,该基因在TcLr35小麦基因组中为低拷贝。     

毛白杨植物络合素合酶(PtPCS)基因克隆及其表达研究

植物络合素(PCs)是植物细胞中一类螯合重金属离子的多肽,对细胞解毒和重金属的富集有重要的作用。植物络合素合酶(PCS)是合成PCs途径中的关键酶。本研究克隆了毛白杨的植物络合素合酶基因PtPCS,该基因cDNA序列全长1512bp,可编码503个氨基酸;与其它8种植物同源基因比对显示,它们的氨基酸序列相似性在67%～74.1%之间;构建进化树发现,这9种植物明显的分为两大分支,并且两大分支PCS蛋白的高级结构显示出明显的差异,一种呈月牙状,一种为伞状,重金属超富集植物均为月牙状结构。对毛白杨在不同镉浓度处理下PtPCS基因的表达情况分析发现,毛白杨根、茎、叶中PtPCS基因均表现出先升高后缓慢降低的表达趋势,并且在同一镉浓度处理下,毛白杨不同器官PtPCS基因的表达具有规律性,即根表达量最强,茎次之,叶片最弱。研究结果不仅为植物育种提供了重要的基因资源,也为剖析毛白杨的镉抗性和富集特性的研究奠定了良好的基础。     

花生蔗糖合酶基因AhSuSy的克隆和干旱胁迫表达分析

蔗糖合酶(sucrose synthase, SuSy)是蔗糖代谢途径中的关键酶, 在植物生长、发育和渗透调节过程中起着重要的作用。本研究利用同源克隆、RACE和TAIL-PCR相结合的方法从花生叶片中分离了蔗糖合酶基因, 命名为AhSuSy (GenBank登录号JF346233)。该基因cDNA序列全长2 790 bp, 包含一个2 421 bp的开放阅读框(ORF), 5′端非编码区57bp, 3¢端非编码区为312 bp。根据编码区预测AhSuSy编码806个氨基酸, 与大豆、拟南芥、玉米等植物中相关蛋白的氨基酸序列同源性达75%以上; 成功构建了该基因的原核表达载体pET32a-AhSuSy, 在IPTG诱导下得到92 kD左右的蛋白, 与理论值一致。半定量RT-PCR分析表明AhSuSy在花生根、茎、叶中均有表达。利用10%PEG模拟干旱处理花生幼苗, 分析胁迫后AhSuSy的转录水平, 同时测定蔗糖合酶活性和蔗糖含量, 发现三者均表现为处理后4~12 h逐渐升高, 相关性分析显示花生中蔗糖含量与蔗糖合酶活性的相关系数达0.993(P=0.007<0.01), 处理后12~24 h逐渐降低。推测该基因响应干旱调控, 在花生抗旱胁迫中可能起着一定的作用。     

油菜柠檬酸合酶基因的克隆及在逆境下的表达

柠檬酸合酶是植物多种代谢途径的限速酶, 及代谢变化的标志酶。为了解油菜柠檬酸合酶基因的生理功能, 以甘蓝型油菜叶片cDNA为模板, 设计特异性引物, 获得一编码柠檬酸合酶基因的cDNA序列, 全长1 659 bp, ORF区含476个氨基酸残基, 序列比对显示其蛋白序列与拟南芥有较高的同源性(96.0%), 氨基末端含一线粒体靶信号。聚类分析表明, 油菜柠檬酸合酶基因与其他植物内该基因高度同源。对油菜幼苗进行植物生长调节物质、高温和低温、强光照和弱光照、盐、菌核病、干旱和水渍等处理, 采用半定量PCR法对油菜叶片柠檬酸合酶基因的表达模式进行检测, 发现在盐胁迫、暗光和强光的处理下, 柠檬酸合酶基因的表达基本没有变化;在水渍、干旱、IAA和6-BA胁迫下, 其表达有所升高, 但出现峰值的时间不同, ABA对表达模式的影响与IAA相反;感染菌核病后其表达降低;对GA₃的应答呈鞍型。对部分处理采用荧光定量PCR验证, 其结果与半定量PCR结果基本一致。     

两种苎麻纤维素合酶基因cDNA序列的克隆及表达

从苎麻转录组数据出发, 利用Blast工具从中分析出与多种植物纤维素合酶高度相似的片段CL789和Unigene20360。根据片段信息设计特异性引物, 从苎麻[Boehmeria nivea (Linn.)Gaud.]栽培种湘苎3号中克隆纤维素合酶核心片段, 并利用5'及3'RACE技术获得2个片段的全长cDNA。两者都具有典型的纤维素合酶特征结构域, 表明为2个苎麻纤维素合酶基因CesA的cDNA序列, 分别命名为BnCesA2和BnCesA3。BnCesA2基因编码区全长度3240 bp, 编码1 079氨基酸多肽; BnCesA3基因编码区全长3120 bp, 编码1039氨基酸多肽。对BnCesA2和BnCesA3基因在湘苎1号、湘苎3号、湘潭大叶白和城步青麻苎麻品种木质部和韧皮部荧光定量PCR分析显示, 2个基因在不同品种苎麻的木质部及韧皮部都有表达, 但表达量存在着一定差异, 整体而言BnCesA2具有更高的表达水平, 其木质部和韧皮部的表达都为BnCesA3的2~5倍。推测BnCesA2和BnCesA3都参与了苎麻细胞壁的次生合成。     

黄灯笼辣椒CcCAD1基因的克隆与植物表达载体的构建

肉桂醇脱氢酶(cinnamyl alcohol dehydrogenase, CAD)在木质素生物合成中有着重要作用,为了探讨辣椒中CAD基因在木质素合成中的作用,本研究利用RT-PCR方法从黄灯笼辣椒幼嫩叶片中克隆得到CAD1基因全长cDNA,命名为CcCAD1。序列分析表明,CcCAD1 cDNA序列全长1 074 bp,编码357个氨基酸。同源比对显示其与番茄CAD1蛋白的一致性高达96.09%。荧光定量PCR检测结果显示,CcCAD1基因在辣椒根、茎、叶、胎座和果肉中的表达量差异显著,其相对表达量为叶果肉茎根胎座。利用Bam HⅠ和SacⅠ双酶切连接成功构建pBI121-CcCAD1植物表达载体,为CcCAD1基因转化以及后续的功能分析提供依据。     

菊花CgF3’H基因克隆及表达特性分析

根据菊花花器官表达序列标签序列设计引物,采用PCR和5’-RACE技术对类黄酮3'-羟化酶(F3’H)基因进行全长cDNA克隆.克隆获得F3'H cDNA全长为1 760 bp,其开放阅读框(ORF)为1 524 bp,编码一条包含508个氨基酸残基的多肽,GenBank登录号为AB523844.预测该基因编码的蛋白分...     

棉花中两个新的F-box蛋白基因的克隆与表达分析

 以棉花EST序列分析为基础,利用电子克隆和RT-PCR技术,从棉花中克隆了2个新的F box蛋白基因,分别命名为GhFB1 (GenBank核酸数据库登录号：EF419428)和GhFB2 (GenBank登录号：EF503623)。GhFB1cDNA全长866bp,编码162个氨基酸;GhFB2 cDNA全长657bp,编码161个氨基酸,而且两者均含有植物F-box蛋白家族特有的F-box结构域。序列比较分析表明,GhFB1和GhFB2蛋白与水稻OsGID2,拟南芥AtSLY1具有高同源性,是棉花中F-box蛋白家族的新成员。RT-PCR结果表明,GhFB1和GhFB2在根、下胚轴、叶、茎、花和纤维中都有表达,而且均在棉花纤维起始和伸长时期有优势表达,推测这2个基因在棉纤维早期发育中可能起重要作用。     

海南粗榧GGPPs基因克隆与诱导表达分析

濒危植物海南粗榧富含多种抗癌活性次生代谢产物。为研究这些产物的生物代谢途径和表达调控,通过同源克隆和RACE技术获得了海南粗榧紫杉醇生物合成途径中通用前体牻牛儿基牻牛儿焦磷酸合成酶(GGPPs)基因全长并进行了生物信息学分析。该基因命名为CmGGPPs(GenBank登录号:JX971119),并进一步利用不同激发子诱导研究了该基因对不同逆境信号的响应情况。结果表明:海南粗榧GGPPs基因cDNA全长1694bp,包含一个1182bp的ORF框,编码393个氨基酸;预测该基因编码蛋白质分子量为42.91kD,其等电位为7.12。通过BLAST比对结果分析,海南粗榧GGPPs基因全长核苷酸序列与红豆杉科植物的同源性最高可达91%,氨基酸序列有89%的相似性。同时,GGPPs基因氨基酸序列同其他植物也有较高的同源性。用不同类型激发子处理发现,GGPPs在诱导后表达量均上升,但不同激发子诱导的基因表达强度和速率存在明显区别。     

西伯利亚蓼PsLEA基因的克隆及在NaHCO_3胁迫下的表达

根据西伯利亚蓼叶片cDNA文库中获得的胚胎发育晚期丰富蛋白(late embryogenesis abundant proteins,LEA)基因的部分序列,采用cDNA末端快速扩增(RACE)技术成功克隆了胚胎发育晚期丰富蛋白基因(LEA),命名为PsLEA(GenBank登录号:FJ478172)。该基因全长686bp,5'非翻译区为102bp,3'非翻译区为131bp,开放读码框为453bp,编码150个氨基酸。荧光定量PCR分析表明:正常情况下PsLEA基因在西伯利亚蓼的叶、茎和地下茎中皆有表达,其中茎中表达量最高。3%NaHCO3诱导胁迫下,叶、茎、地下茎中PsLEA表达均受到影响且表达模式存在差异,说明PsLEA基因与西伯利亚蓼的耐盐性相关。     

杜仲胶合成相关基因EuFPS的克隆及序列分析

本文采用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)方法，以杜仲树叶总RNA为模板扩增出杜仲法呢基焦磷酸合酶基因EuFPS，克隆至质粒pUCm-T中。序列分析表明，所克隆的cDNA序列全长1271bp，开放阅读框共编码320个氨基酸残基，其核酸序列与拟南芥菜、银胶菊和巴西橡胶树FPP合酶的序列同源性分别为81％，87％，82％。     

甜瓜PGIP基因的克隆及表达初步分析

以甜瓜叶片基因组DNA为模板,PGIP基因保守序列设计引物,PCR扩增到1条全长978 bp的目的片段。该基因包含有1个完整的开放阅读框,没有内含子,编码326个氨基酸,其编码的氨基酸序列中含有一段典型的亮氨酸重复序列。序列比对表明:该基因编码的氨基酸序列与GenBank中的PGIP基因氨基酸序列(AAP41199)同源性为100%;RT-PCR表达分析表明,该基因在甜瓜叶、茎、根、果实中表达,在花中不表达。为植物分子抗病育种提供了1条基因资源。     

玉米淀粉分支酶基因SBEⅡb的克隆与过表达载体的构建

【研究目的】克隆玉米分支酶基因SBEⅡb并构建该基因的过表达载体pCASBEⅡb。【研究方法】从糯玉米（Waxy corn）新鲜胚乳中提取总RNA,利用RT-PCR方法克隆玉米淀粉分支酶基因SBEⅡb的全长cDNA。【结果】克隆得到了玉米淀粉分支酶基因SBEⅡb的全长cDNA,用BLAST软件作同源序列比对的结果显示,该片段的核苷酸序列与GenBank上报道的序列具有99%的同源性,全长2719bp,编码799个氨基酸。【结论】将该基因连接到携带GUS报告基因的植物表达载体pCAMBIA1303中,并通过了GUS活性检测,说明已成功构建了玉米淀粉分支酶基因SBEⅡb的过表达载体pCASBEⅡb。     

甘薯番茄红素β-环化酶基因的克隆与转化烟草的研究

番茄红素β-环化酶（LYC-B）催化番茄红素形成β-胡萝卜素，是β-胡萝卜素生物合成的关键酶之一。从甘薯块根总RNA逆转录的cDNA中扩增出lyc-b的保守序列后，用cDNA末端快速扩增方法（RACE）获得了该基因全长cDNA，共1 844 bp，开放阅读框1 503 bp，编码501个氨基酸。构建了lyc-b植物表达载体p23-lyc-b，通过农杆菌介导法转化烟草，经PCR及Southern杂交表明该基因已整合到烟草的基因组中。     

甘蔗葡聚糖酶ScBG1基因的电子克隆及序列分析

为了揭示甘蔗β-1,3-葡聚糖酶基因的结构特点和功能特性,从而为该基因的研究和应用提供基础。本研究以水稻β-1,3-葡聚糖酶基因(U72255.1)为搜寻探针,运用电子克隆技术,获得一条甘蔗β-1,3-葡聚糖酶基因全长cDNA,命名为ScBG1,并对其进行生物信息学分析。结果表明：该基因的cDNA序列全长为1842 bp,包含一个1488 bp完整的开放读码框,编码495个氨基酸残基,属于糖基水解酶第十七家族,为疏水性蛋白,含有信号肽。将ScBG1与其他植物种的β-1,3-葡聚糖酶基因进行序列比对,发现该基因具有保守和典型的葡聚糖酶结构域,碱基序列的保守性为45%~73%。研究结果为该基因的实验克隆奠定基础,也为甘蔗β-1,3-葡聚糖酶基因的分子功能研究提供参考。