巴西橡胶树钙调蛋白基因的克隆及表达分析

为了进一步研究橡胶生物合成的分子机制,根据巴西橡胶树（Hevea brasiliensis）cDNA文库中的EST序列,利用cDNA末端快速扩增（RACE）技术分离了一个巴西橡胶树钙调蛋白基因,命名为HbCAM1。分析结果显示,该基因cDNA全长775 bp,含有完整的阅读框架,编码区为450 bp,编码149个氨基酸,5’非编码区26 bp,3’非编码区299 bp。通过序列比对以及结构预测分析,HbCAM1编码的氨基酸序列与蓖麻、毛葡萄、烟草、麻风树中相应基因氨基酸序列的一致性分别达到100%、100%、99%、99%。半定量RT-PCR分析显示,HbCAM1基因可能通过对相关代谢基因表达调节参与了乙烯利刺激橡胶树增产的分子调控。     

棉花八氢番茄红素脱氢酶GhPDS1基因的克隆与表达谱分析

八氢番茄红素脱氢酶(PDS)在胡萝卜素生理代谢和病毒诱导外源基因沉默中起着非常重要的作用.本研究通过同源克隆方法,分析已报道植物八氢番茄红素脱氢酶氨基酸保守区,设计筒并引物,扩增出编码棉花PDS基因cDNA中间片段.通过RACE技术成功地克隆了棉花PDS基因的全长cDNA,命名为GhPDS1(GenBank No.HQ...     

西红花β-胡萝卜素羟化酶CsBCH1-z基因的分离与生物信息学分析

为更好地理解西红花类胡萝卜素合成代谢途径，从西红花中分离和克隆了1 个新的β-胡萝卜素羟化酶基因CsBCH1-z，并从柱头cDNA中克隆了该基因的全长编码序列为906 bp，编码301 个氨基酸残基，对应的基因组序列为1261 bp，5 个外显子由4 个内含子子间隔开。与已知的CsBCH1 基因的氨基酸序列比较，发现在N端由于6 个碱基的缺失，造成了2 个氨基酸的缺失和1 个氨基酸由异亮氨酸突变为亮氨酸，另外还有一处单碱基的变异造成苏氨酸突变为丙氨酸。通过预测其蛋白含有3 个明显的跨膜结构域，C端包含了2 组“HXXXXH”和“HXXHH”结构域，是典型的脂肪酸羟化酶。β-胡萝卜素羟化酶是西红花苷合成的重要前体物质，CsBCH1-z 柱头中的表达量>叶片>花瓣；雄蕊中表达很低；球茎中表达不可见。     

巴西橡胶树SNARE蛋白全长cDNA克隆及其序列特征分析

从巴西橡胶树Hevea brasiliensis差减cDNA文库中筛选到一个与SNARE蛋白同源性较高的基因片段,根据其序列信息设计特异引物, 采用cDNA末端快速扩增技术RACE（Rapid Amplification of cDNA Ends）进行差异片段的5’和3’端的扩增,获得了长度为1 070 bp的全长cDNA克隆R295。序列分析表明该基因包含600 bp的开放阅读框,5’-UTR为93 bp, 3’-UTR为377 bp,编码199个氨基酸。该基因编码的蛋白具有一个SNARE coiled-coil保守区、一个典型的VAMP基元及一个羧基端的CAAX基元。同源分析表明该蛋白属于一类特殊的longins蛋白。RT-PCR检测表明它在胶乳中特异表达,在叶中没有表达。     

小麦耐盐相关基因TaSTK的克隆

利用RACE方法,从小麦耐盐突变体RH8706-49中扩增获得小麦丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（Triticum aestivum serine-threonine protein kinase）基因TaSTK的全长cDNA序列,含1 958 bp,其中开放阅读框1 431 bp,编码476个氨基酸。其编码区基因组DNA全长为4 095 bp,含5个外显子。该基因的全长cDNA序列及基因组序列均已提交GenBank数据库（登录号：DQ103756和DQ341377）。经过NCBI比对发现该基因的氨基酸序列与丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶、酪氨酸蛋白激酶、蛋白激酶都具有较高的同源性。Northern杂交检测表明,TaSTK在小麦中属于盐诱导增强型基因,并且在耐盐材料RH8706-49中诱导增强程度高于敏盐材料H8706-34。TaSTK的杂交信号非常弱,表明TaSTK在小麦幼苗的叶片组织中属于低表达的基因类型。     

烟草SKP1基因cDNA的克隆分析及原核表达

应用DDRT-PCR法获得可被壳寡糖诱导的枯斑三生烟SKP1基因cDNA的3’端序列,通过5’ RACE扩增该基因cDNA的5’ 端,进而扩增此基因cDNA的全长,通过同源性比较分析,与本塞姆氏烟草的SKP1基因同源性达81%,其cDNA全长653 bp(GenBank登录号：AY702087),其中编码区位于73~540 bp,编码一条155个氨基酸的多肽。经预测该多肽的分子量为17 527.78 Da,等电点为4.57,定位于细胞质,功能结构域分析结果显示在4~105位氨基酸有一明显的Skp1结构域,其E值为1.25e-52,因此推断该基因为枯斑三生烟的SKP1基因。将该基因编码区亚克隆到原核表达载体pET23b(+)上,转化大肠杆菌BL21(DE3),表达出与预测分子量一致的蛋白。为进一步研究该基因的功能奠定了基础。     

桃果实乙烯反应因子PpERF1全长基因的克隆及序列分析

以成熟肥城桃果实的cDNA为模板,根据EST库中的核苷酸序列,设计2条特异引物分别与B26进行PCR扩增,结果得到了该基因下游包括3′ 端非编码区的765 bp大小的cDNA片段。PpERF1基因全长为1 263 bp,包含一个708 bp大小的完整开放阅读框(ORF)。序列分析表明,PpERF1与番茄、拟南芥、苹果和葡萄等在DNA结合功能域的约58个氨基酸中,同源性可达68.4%-100%,且在该区域中存在1个α-螺旋和3个反平行链构成的β-折叠结构。经同源性分析,该序列与拟南芥、葡萄、豌豆等植物的氨基酸同源性为58.8%～67.5%,属于同一类ERF家族成员。     

烟草β-胡萝卜素羟化酶基因的特征分析

β-胡萝卜素羟化酶基因在植物类胡萝卜素的合成代谢过程中起着关键的作用。烟草中的类胡萝卜素是烟叶香气物质的主要前体物之一。本研究克隆了烟草4个β-胡萝卜素羟化酶基因。烟草β-胡萝卜素羟化酶基因与其它作物的BCH基因具有相似的结构,由7个外显子和6个内含子组成。其编码的蛋白包含BCH蛋白的保守结构域,即脂肪酸羟化酶超家族保守域。进化分析表明,烟草Nt BCH蛋白与番茄、枸杞、辣椒等茄科作物的BCH蛋白遗传距离较近。组织特异性表达分析表明,Nt BCH1和Nt BCH2基因主要在叶和花中表达,Nt BCH3和Nt BCH4主要在根和花中表达。从本研究结果推断,可以通过调控Nt BCH1和Nt BCH2基因的表达控制烟叶中类胡萝卜素的含量。     

栀子果实中西红花总苷合成途径GjLCY b2基因的克隆与表达

西红花总苷是栀子果实中的次生代谢产物,具有重要的药理作用,也是国际流行的天然色素"栀子黄"的主要成分。番茄红素β-环化酶b(lycopeneβ-cyclase,LCY b)催化合成了西红花总苷代谢途径的前体化合物-β-胡萝卜素。本研究利用RACE技术,从栀子果实中克隆了一条长1 672 bp的序列,含有一个1 500 bp的开放阅读框,编码499个氨基酸组成的蛋白质。该蛋白具有番茄红素β-环化酶的结构域,分子量为56.39 k D,N端有一个40个氨基酸组成的质体定位的信号肽,属于LCY b亚家族,因此命名为GjLCY b2。进行密码子优化后,利用两种原核表达系统诱导GjLCY b2融合蛋白表达,p SYNO-1系统可以在大肠杆菌中表达出可溶蛋白,p ET-28a(+)系统表达的蛋白以包涵体形式存在。荧光绝对定量q PCR检测结果表明,在栀子果实发育成熟的过程中,GjLCY b2基因的表达量变化与西红花总苷的合成量变化趋势一致,表明GjLCY b2基因可以作为遗传操作的靶点,进行栀子果实中西红花总苷生物合成途径的调控。     

苎麻COMT基因的克隆及序列分析

利用RT-PCR法结合cDNA末端快速扩增（RACE）法从苎麻中克隆了与木质素合成相关的COMT基因的全长cDNA序列。所获得的COMT基因全长1318bp,包含一个开放阅读框1098bp,编码365个氨基酸。序列相似性检索结果表明,苎麻COMT全长cDNA与杨树COMT基因的序列同源性达82%,其编码的氨基酸序列与杏的COMT氨基酸序列同源性最高,达93%。同时还检索到该氨基酸序列包含一个O-甲基转移酶的保守结构。     

Postharvest ultraviolet-C irradiation suppressed Psy 1 and Lcy-β expression and altered color phenotype in tomato (Solanum lycopersicum) fruit

Mature green cherry tomato fruit were harvested and treated with ultraviolet-C (UV-C) irradiation at a predetermined dose of 4.2 kJ m⁻², and stored at 18 °C for 35 days. The effects of UV-C treatment on color change, pigment contents, and the expression of major genes involved in carotenoid metabolism, including Psy 1, Pds, Lcy-β, and Lcy-ɛ, encoding phytoene synthase, phytoene desaturase, lycopene β-cyclase and lycopene ɛ-cyclase, respectively, were examined. The UV-C treated fruit developed a pink red color in contrast to the normal orange red color of control fruit. Lycopene accumulation during ripening in UV-C treated fruit was significantly inhibited but its final content was not affected. However, both accumulation and final content of β-carotene were significantly suppressed in UV-C treated fruit. The lower content of β-carotene, leading to a higher lycopene to β-carotene ratio, is probably responsible for the altered color phenotype in UV-C treated fruit. Psy 1, a major gene involved in lycopene synthesis was inhibited by UV-C irradiation. Significantly suppressed expression of Lcy-β gene was also observed in UV-C treated fruit. Thus it is possible that the lower transformation from lycopene to carotenes contributed to the relatively stable content of lycopene.     

甘蔗葡聚糖酶ScBG1基因的电子克隆及序列分析

为了揭示甘蔗β-1,3-葡聚糖酶基因的结构特点和功能特性,从而为该基因的研究和应用提供基础。本研究以水稻β-1,3-葡聚糖酶基因(U72255.1)为搜寻探针,运用电子克隆技术,获得一条甘蔗β-1,3-葡聚糖酶基因全长cDNA,命名为ScBG1,并对其进行生物信息学分析。结果表明：该基因的cDNA序列全长为1842 bp,包含一个1488 bp完整的开放读码框,编码495个氨基酸残基,属于糖基水解酶第十七家族,为疏水性蛋白,含有信号肽。将ScBG1与其他植物种的β-1,3-葡聚糖酶基因进行序列比对,发现该基因具有保守和典型的葡聚糖酶结构域,碱基序列的保守性为45%~73%。研究结果为该基因的实验克隆奠定基础,也为甘蔗β-1,3-葡聚糖酶基因的分子功能研究提供参考。     

烟草脱水素基因NtDEH1的克隆及研究

为研究脱水素在植物早期胚胎发育中的作用和机理,采用显微操作技术获得烟草卵细胞并构建其c DNA文库,从中筛选到一个脱水素基因NtDEH1。通过RACE技术获得该基因全长,基因组测序结合生物信息学分析表明该基因拥有一段长度为651 bp的完整开放阅读框和一段535 bp的内含子,编码由217个氨基酸残基组成的蛋白质,其理论等电点为5.27,属于酸性蛋白,且具有一定的亲水性。氨基酸序列比对分析发现在许多物种比如绒毛状烟草、林烟草、甜辣椒、番茄、马铃薯和丹参中都具有与NtDEH1蛋白非常类似的保守的同源序列,均具有SK2型脱水素特征。借助Genome walking技术获取NtDEH1基因约1 706 bp的5'侧翼序列,使用小叶烟草瞬时表达系统检测到其具有较强的启动子活性。该研究为进一步了解脱水素基因NtDEH1在植物生殖发育中的具体功能打下基础。     

甘蓝KAPP编码基因的克隆与序列分析

采用PCR、RT-PCR及其他分子生物学方法,以甘蓝基因组DNA、花蕾RNA和叶片RNA为模板,分别对甘蓝KAPP gDNA和KAPP cDNA进行扩增,分别获得3247bp的KAPP gDNA片段、1699bp的KAPP cDNA片段、1578bp的花蕾KAPP2 cDNA片段和1581bp的叶片KAPP2cDNA片段。对克隆的甘蓝KAPP gDNA和cDNA(结合报道的KAPPcDNA)进行比对表明,甘蓝KAPP基因包含11个内含子,均符合"GU-AG"剪接规则,并且克隆得到的KAPP cDNA序列与报道的KAPP cDNA序列有6处单个碱基的差异,但两者的氨基酸序列完全一致。然而花蕾KAPP2 cDNA、叶片KAPP2 cDNA片段与报道的KAPP cDNA序列相似性分别为85.2%和85.0%。这两个序列分别在590bp和593bp处较早出现一个无义突变引起的终止密码子。Blast分析表明,两基因编码的氨基酸序列与拟南芥KAPP氨基酸序列相似性最高,其次为甘蓝KAPP氨基酸序列。以已报道的8种植物KAPP的CDS及本实验所克隆的两个KAPP2序列构建分子进化树,获得序列与甘蓝KAPP序列聚为一支。结合比较作图及分子进化树,推测KAPP基因在甘蓝基因组上有两个拷贝,而笔者克隆到的KAPP2 cDNA序列是其中一个拷贝,是KAPP进化过程中突变失活的拟基因。     

飞机草类黄酮3’-羟化酶基因(CoF3’H)的克隆及其在烟草中的表达

利用RT-PCR和RACE技术从飞机草中克隆得到1628 bp的类黄酮3’-羟化酶c DNA的全长序列,命名为Co F3’H,Gen Bank登录号为HQ268505.1。Co F3’H基因的编码区长度为1524 bp,编码507个氨基酸。氨基酸序列含P450蛋白结构域和半胱氨酸亚铁血红素结合域保守区(F××G×R×C×G),利用DNAMAN软件比对显示,Co F3’H与其他植物的F3’H蛋白的同源性很高。通过农杆菌介导成功地将Co F3’H基因导入烟草,T2代的转Co F3’H基因烟草植株的黄酮含量显著高于野生型。说明Co F3’H在黄酮的生物合成中起重要作用,为后续研究飞机草的化感作用及综合利用提供基础。     

N基因标记基因PCR检测方法的建立及其在遗传育种中的应用

烟草的N基因是一个较为有效的抗烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus,TMV)基因,在抗病育种中发挥着重要的作用。为建立其标记基因PCR检测体系,评估已知目的基因cDNA序列作为分子标记的目的基因辅助育种的可行性,本文依据N基因cDNA序列设计4对扩增范围在150～950bp的不同片段长度引物,并对含有N基因的coker176基因组DNA进行PCR扩增。扩增结果表明,有3对可扩增出特异产物。测序结果表明,有2对引物的扩增产物含有内含子。根据所获得的DNA序列设计出2对用于分子标记辅助育种的引物,并分别对C151、NC89、coker176等11个品种的基因组DNA进行扩增,结果表明在coker176、龙江912、吉烟9号和龙江911品种中有扩增产物,除龙江911外,这一结果与已知的N基因在11个品种的分布相一致,成功建立了N基因PCR检测体系,并证明以cDNA序列设计引物扩增DNA序列的目的基因辅助育种技术完全可行。并对实验中出现的问题进行了研究。     

酿酒酵母NHX1基因克隆与烟草表达分析

提取酿酒酵母DNA，PCR法合成片段长度为1902bp的NHX1基因，构建植物高效表达载体转化烟草，经PCR扩增、GUS酶染色分子鉴定后，应用荧光定量PCR分析转化材料幼根NHX1基因的转录水平，并将各转化材料T1代烟苗移栽至中间试验隔离圃中，化验分析烟叶内在成分。获得抗卡那霉素、NHX1基因PCR扩增和GUS染色阳性的转化子42株，在转化材料幼根中可检测到外源基因NHX1转录的mRNA分子；烟叶内在成分化验结果表明T1代转化材料烟叶含钾量增加30％，总糖含量显著降低，证明NHX1基因除了与Na^＋运输有关还与K^＋的吸收和糖分运输有关。     

黑曲霉木聚糖酶结构基因和5'调控区基因克隆及其分析

以黑曲霉(Aspergillus niger)A3的基因组DNA为模板,根据已报道的xynB基因序列设计简并引物,在合适的PCR反应条件下有效地扩增出了xynB的结构基因及其5＇调控区序列片段,并克隆到pBS-T载体上,序列测定表明,该目的片段全长1 611 bp.通过序列分析:结构基因部分长744 bp,其中含有一个66 bp的内含子和18个氨基酸的信号肽序列;xynB基因的cDNA序列大小为678 bp,编码225个氨基酸,与GenBank上检索的木聚糖酶基因的核苷酸序列同源性最高达98%,氨基酸序列同源性达99%.在翻译起始点上游92 bp和118 bp处找到转录起始位点和类"TATA"box的核心启动子区特征元件以及"CAAT"box,表明所克隆的调控区序列具有真核生物启动子特点,这为构建木聚糖酶高效表达载体,用于工业育种奠定了基础.     

烟夜蛾幼虫中肠类钙粘蛋白基因cDNA片段的克隆与序列分析

类钙粘蛋白位于昆虫中肠刷状缘膜囊泡上,该蛋白作为Bt毒素的受体可以与其结合导致昆虫死亡,因此,昆虫对Bt毒素的抗性与类钙粘蛋白有密切关系。本研究以烟夜蛾五龄幼虫中肠的总RNA为模板,根据已经克隆的其他昆虫的类钙粘蛋白基因序列设计引物,利用RT-PCR技术扩增出了烟夜蛾类钙粘蛋白基因的cDNA片段,将其连接到pMD18-T载体,转化大肠杆菌后筛选阳性克隆并进行序列测定,测序得到的1 335 bp的片断编码444个氨基酸残基。序列分析表明,该氨基酸序列与棉铃虫和烟芽夜蛾类钙粘蛋白的一致性分别为95%和86%。研究结果对进一步研究昆虫对Bt毒素产生抗性的机制以及发展分子技术快速检测并监测田间昆虫抗性基因的产生奠定了基础。