郑麦369 ω-醇溶蛋白基因的克隆及生物信息学分析

以黄淮麦区主推小麦品种郑麦369为材料,利用简并引物和PCR扩增技术对其ω-醇溶蛋白基因进行克隆,获得15条ω-醇溶蛋白核苷酸序列(分别命名为ZM369-1～ZM369-15)。NCBI BLAST分析表明,克隆序列与已知序列的相似度均为82%～99%,推断其为ω-醇溶蛋白基因家族基因。通过FGENESH在线软件预测显示,ZM369-1和ZM369-15具有完整的开放阅读框,分别可编码318,407个氨基酸残基;其余13条序列均因内部提前出现1个或多个终止密码子,推测其为假基因。进一步分析显示,15个基因推导的氨基酸序列均具有ω-醇溶蛋白典型分子结构特征,其中ZM369-15属于未曾报道过的ARP类型,同时在重复区存在1个半胱氨酸残基的插入。此外,在NCBI数据库中没有找到与ZM369-1和ZM369-15相似度高的ω-醇溶蛋白氨基酸序列,推测其为新ω-醇溶蛋白基因。CD免疫肽识别分析表明,免疫肽段Gli-ωt在15条氨基酸序列中均有分布,免疫肽段Gli-ω1只分布于假基因推导得到的氨基酸序列中。系统进化树分析表明,本研究克隆得到的15个基因分别来源于A,D基因组;相同基因组来源的ω-醇溶蛋白基因大都可形成相对集中的分支,表明其具有一定的基因组特异性;相同类型ω-醇溶蛋白基因都能形成相对集中的分支,推测其类型与进化有关。     

小麦‘Fielder’ ω-醇溶蛋白基因及启动子的克隆与序列分析

为研究六倍体小麦中ω-醇溶蛋白基因簇的启动子差异,以普通小麦品种‘Fielder’为试验材料,利用同源克隆的方法,克隆ω-醇溶蛋白基因的编码区和启动子序列,并进行生物信息学相关分析。结果表明:1)共克隆得到11条不同的基因序列(MN441496～MN441506),其中6条(MN441496～MN441497和MN441503～MN441506)编码ARE/Q型ω-醇溶蛋白,5条(MN441498～MN441502)编码SRL型ω-醇溶蛋白。2)ARE/Q型ω-醇溶蛋白基因编码区长度范围在972～1 158bp,SRL型ω-醇溶蛋白基因编码区长度范围在1 303～1 419bp,这种差异主要由中间重复区的Indel类型和数量不同造成。3)ARE/Q型ω-醇溶蛋白基因启动子在-300bp含有1个典型的endosperm box,而SRL型ω-醇溶蛋白基因启动子在-300和-600bp处各含有1个endosperm box。这些ω-醇溶蛋白基因启动子上的差异,可能引起表达水平的差异。     

尾状山羊草α-醇溶蛋白基因的克隆和序列分析

本研究利用一对α-醇溶蛋白基因的特异引物,从小麦近缘植物尾状山羊草Y46中克隆获得5个α-醇溶蛋白基因,与NCBI已提交的α-醇溶蛋白序列进行多重比对分析发现,本研究获得的α-醇溶蛋白基因与已知的小麦及其近缘植物中的α-醇溶蛋白基因序列具有较高的相似性,其编码的氨基酸序列存在一定的多态性;在潜在的致敏性上,在这5个α-醇溶蛋白序列中未发现任何已知的与乳糜泻病相关的抗原表位,这在小麦及其近缘植物中较为罕见;进化分析表明,来自C染色体组中的α-醇溶蛋白与来自M和U染色体组的α-醇溶蛋白具有较近的亲缘关系。     

一个普通小麦γ-醇溶蛋白基因的分子标记

运用生物信息学方法,根据已知的黑麦75Kγ-黑麦碱DNA序列设计引物,对8份不同类型的普通小麦材料进行PCR扩增,均获得一条约400 bp的特异扩增带。对新中长和99L2的扩增带分别进行克隆测序,序列登录号为:DQ432029和DQ432030。分析表明,DQ432029和DQ432030序列完全一致,由377个碱基组成。BLAST分析发现,该序列与普通小麦γ-醇溶蛋白基因的同源性最高,相似性达92%,表明它是一个小麦γ-醇溶蛋白基因。同时,此序列与所有已知γ-醇溶蛋白基因序列存在显著差异,因而可以认为它是普通小麦γ-醇溶蛋白基因家族的一个新序列。所有不同类型的小麦材料都扩出一条同样大小的清晰、明亮带,此扩增带可以作为普通小麦该γ-醇溶蛋白新基因的特异分子标记。     

黑麦热激蛋白ScHsp90-1基因的克隆及表达分析

本研究从黑麦中克隆了一个热激蛋白Hsp90基因,暂命名为ScHsp90-1,并对其序列进行分析。结果显示,该基因cDNA序列全长2 103 bp,共计编码700个氨基酸,蛋白质分子量约80.47 k D。序列同源性分析表明,ScHsp90-1与小麦、玉米、水稻等物种的热激蛋白同源性较高;进化树分析表明ScHsp90-1与小麦的Ta Hsp90亲缘关系最近。利用实时荧光定量PCR技术对其表达特性分析表明,ScHsp90-1对高温、低温、高盐、干旱等非生物胁迫均有响应,其可能是黑麦的一个胁迫相关基因。     

野生二粒小麦α-淀粉酶抑制因子编码基因序列分析

对3份野生二粒小麦(Triticum dicoccoides)材料的抗虫24 kDaα-淀粉酶抑制因子编码基因进行分离克隆,得到72个24 kDaα-淀粉酶抑制因子基因,并进行序列分析。结果发现,α-淀粉酶抑制因子在野生二粒小麦中以多拷贝形式存在,经卡方检验初步推断野生二粒小麦中的α-淀粉酶抑制因子成熟蛋白编码基因序列变异类型在供试材料间无显著差异。序列分析表明,24 kDaα-淀粉酶抑制因子成熟蛋白编码基因序列无论在野生二粒小麦种内还是与小麦属的其他物种之间,都具有很高的一致性,说明该基因在进化过程中十分保守。     

柱穗山羊草α-醇溶蛋白基因的克隆与序列分析

根据已知的普通小麦α-醇溶蛋白基因序列设计引物,采用PCR方法克隆基因并进行序列分析。从柱穗山羊草Y127中克隆得到1个α-醇溶蛋白基因序列Gli2-Z-2,它具有α-醇溶蛋白基因的典型结构特征,编码区全长939 bp,编码313个氨基酸。氨基酸序列比较显示,Gli2-Z-2在多聚谷氨酰胺区比已报道的α-醇溶蛋白序列有较多的谷氨酰胺残基。     

牦牛TLR4基因的克隆测序及序列分析

旨在了解牦牛天然免疫受体TLR4基因特点。根据GenBank已公布的牛TLR4基因序列,分3段设计引物,测序、拼接克隆序列,并对所得序列进行生物信息学分析和预测。基因序列分析表明,克隆得到牦牛TLR4基因编码区全长2 807bp,开放阅读框2 526bp,编码氨基酸841个,N端含有27个氨基酸组成的信号肽,分子质量96.009 8ku,理论等电点为6.35。蛋白预测结果表明,TLR4编码蛋白整体表现为亲水性。同源性分析表明,10条序列当中牦牛与野牦牛、普通牛、绵羊等物种具有较高的同源性,在系统发育树中距离最近。说明TLR4基因序列具有较高的保守性。     

75K γ-黑麦碱基因的分子鉴定与转移

【目的】研究75K γ-黑麦碱基因的系统进化关系,并将秦岭黑麦75Kγ-黑麦碱基因导入普通小麦遗传背景中。【方法】利用75K γ-secalin亚基的特异引物secF/secR对5种黑麦进行扩增、克隆、测序及序列分析。以普通小麦(中国春)为母本,黑麦为父本,获得杂种。自杂种后代中,采SDS-PAGE技术分析杂交后代的75K γ-secalins蛋白亚基。用根尖制片进行体细胞染色体数目观察和原位杂交分析。【结果】序列分析结果表明,我国秦岭黑麦(AS156)与美国Wrens黑麦(CIse35)、土耳其4041黑麦(PI168199)、南非的Polko黑麦(PI412949)、智利278黑麦(PI436188)的栽培品系均具有75Kγ-黑麦碱典型的一级结构,但是在重复区中序列差异较大(包括缺失/插入和SNP)。聚类分析表明,我国的秦岭黑麦与同在北纬的土耳其和美国黑麦亲缘关系近,而与位于南纬的南非、智利的两种黑麦关系较远。以中国春为遗传背景,将位于秦岭黑麦2R染色体上的75Kγ-黑麦碱基因导入六倍体小麦,获得结实正常,农艺性状稳定的品系,编号WYQ122。通过SDS-PAGE技术和基因测序分析,已确认WYQ122中携带75Kγ-黑麦碱基因,同时原位杂交也验证黑麦染色体的存在。细胞学鉴定表明,WYQ122植株间染色体数目有41条和42条两种类型。【结论】黑麦的75Kγ-黑麦碱基因存在差异。以染色体代换系的方式将该基因转入普通小麦中。     

藏獒犬α-干扰素全基因的克隆与序列分析

根据GenBank发表的犬α-干扰素(IFN-α)基因核酸序列(AB102731),设计并合成1对引物,利用PCR技术从藏獒犬肝脏基因组DNA中扩增犬α-干扰素全基因,并进行克隆和测序.结果表明,获得了犬IFN-α全基因序列,其大小为564 bp,包含1个完整阅读框,编码187个氨基酸残基.序列比较分析发现,克隆的藏獒犬IFN-α基因序列与GenBank中5条犬IFN-α基因序列核苷酸同源性在96.8%～99.3%之间,氨基酸同源性在94.7%～98.9%之间,并无插入和缺失变异,但是存在氨基酸点变异.藏獒犬与人和其他8种动物的IFN-α基因序列分析和系统进化分析表明,IFN-α基因存在种属的差异性,亲缘关系越近,同源性越高.犬IFN-α基因的成功克隆为进一步研究藏獒犬IFN-α基因表达、生物学活性和应用奠定基础.     

偏凸山羊草fastω-醇溶蛋白基因克隆及与WDEIA相关的IgE结合抗原表位分析

克隆偏凸山羊草中的fastω-醇溶蛋白基因,并对其序列和IgE结合抗原表位进行分析,以期了解IgE结合抗原表位在D~v和M~v基因组中的分布,并为制备单克隆抗体进行IgE结合抗原表位的定量分析奠定基础。结果表明,从偏凸山羊草中克隆获得8个fastω-醇溶蛋白基因(KY368672—KY368679),其中,3个fastω-醇溶蛋白(KY368672—KY368674)由D~v基因组编码,其余5个(KY368675—KY368679)由M~v基因组编码。序列分析发现,获得的fastω-醇溶蛋白与已发表的fastω-醇溶蛋白具有相似的序列结构,KY368672为SRQ型ω-醇溶蛋白,KY368673和KY368674为TRQ型ω-醇溶蛋白,KY368675—KY368679均为SRL型ω-醇溶蛋白。另外,在M~v基因组编码的fastω-醇溶蛋白中,发现了与α-醇溶蛋白相似的多聚谷氨酰胺序列。IgE结合抗原表位分析表明,M~v基因组编码的fastω-醇溶蛋白比D~v基因组编码的fastω-醇溶蛋含有更多的IgE结合抗原表位。     

马唐炭疽菌Colletotrichum hanaui三类Gα亚基基因的克隆与序列分析

利用同源克隆的方法,首先克隆马唐炭疽菌Gα亚基基因的同源片段,再通过TAIL-PCR扩增基因片段的上下游邻接序列,经过序列拼接最终成功获得了3类Gα亚基基因cagA, cagB和cagC的全长序列。根据基因序列及CDS序列,运用相关生物学软件对基因序列及其推测蛋白进行了生物信息学分析。基因cagA全长1 380 bp,含5个内含子,编码355个氨基酸;cagB全长1 283 bp,含3个内含子,编码353个氨基酸;cagC全长1 382 bp,含4个内含子,编码354个氨基酸。蛋白同源分析表明,该菌的这3类基因推测蛋白与稻瘟病菌、小麦赤霉病菌中同类基因编码蛋白高度同源,同源率均在75%以上,最高可达99%。     

纳豆芽胞杆菌KX株纳豆激酶基因的克隆及序列分析

设计引物进行PCR反应,从纳豆芽孢杆菌基因组DNA中扩增和克隆纳豆激酶基因.序列分析表明,所克隆的纳豆激酶基因序列全长1 473 bp,其中阅读框架1 143 bp,阅读框架以GTG为起始密码子,编码包括信号肽、前导肽、成熟肽在内的381个氨基酸;表达产物为前纳豆激酶原,其中N端29个氨基酸组成信号肽,随后的77个氨基酸组成前导肽,最后的275个氨基酸组成成熟肽.     

菊芋凝集素基因组片段的PCR扩增及克隆

通过PCR扩增 ,获得了菊芋凝集素基因 (hta)的编码区基因组片段hta - g。DNA序列分析表明 ,PCR产物长 70 2bp ,包括 444bp的编码区序列 ,编码区被一个 2 5 8bp的内含子分成 2个长度分别为 2 1 0bp及 2 34bp外显子 ,内含子边界序列符合GT/AG规则。与htacD NA序列的比较分析表明 ,hta - g的编码区序列与htacDNA序列高度同源 ,同源性在 93%～98%。     

口蹄疫病毒R株基因组序列分析研究

根据GenBank上发表的口蹄疫（foot-and-mouth disease，FMD）全基因序列数据，设计了多对引物，采用RT-PCR的方法，分别对R株编码区和非编码区基因进行扩增，将各片段克隆至pMD18-T载体，进行核苷酸序列测定．按顺序拼接各基因的序列，将结果序列与GenBank上各FMDV毒株的序列进行比较和同源性分析．序列的比较和分析表明，R株编码区全长为6966个核苷酸，共编码2322个氨基酸；非编码区5’端内部核糖体结合位点（intemal ribosome entry site，IRES）长约450个核苷酸，3’非翻译区（untranslatable region，UTR）从TAA始至Poly（A）前长度为94个核苷酸，所测出Poly（A）尾长度为18个核苷酸．与GenBank世界流行毒株的序列比较，编码区核苷酸序列同源性为88％～90％，推导氨基酸序列同源性为88％～95％．     

羊草Class Ⅱ几丁质酶基因的克隆及序列分析

[目的]克隆自然生长于黑龙江省盐碱地的羊草ClassⅡ几丁质酶基因并进行序列分析,为进一步研究几丁质酶基因的生物功能和应用奠定了基础。[方法]构建羊草叶片的cDNA文库,对其进行DNA序列测定和分析,并与GenBank中收录的植物几丁质酶基因序列及编码的氨基酸序列进行同源性比较。[结果]在羊草叶片eDNA文库中克隆出1条全长eDNA片段,片段长996bp,其中,可读框768bp,编码255个氨基酸。编码产物在结构上缺乏CBD和C-端延伸区,具有ClassⅡ几丁质酶的结构特征,其氨基酸序列与黑麦和小麦ClassⅡ几丁质酶具有很高的同源性;构建的pQE—LcChi2重组载体经诱导后表达出一个约27KD的蛋白,与推测的pQE-LcChi2基因编码产物大小一致。[结论]LcHi2基因在大肠杆菌中能够表达,是一个具有表达功能的基因。     

黄连金黄紫堇碱9-O-甲基转移酶基因的克隆及序列分析

克隆黄连(Coptis chinese Franch.)金黄紫堇碱9-O-甲基转移酶(Scoulerine-9-O-methyl-transferase,SMT)基因并做序列分析.采用RT-PCR方法,以新鲜的黄连嫩叶cDNA为模板,克隆出黄连SMT基因的cDNA序列.克隆到的cDNA序列全长为1 375 bp,编码一个350个氨基酸残基组成的多肽,其核酸序列与日本黄连、唐松草的SMT基因的cDNA序列同源性分别为97%与85%.将得到的序列提交GenBank,序列号为EU980450.与日本黄连、唐松草SMT基因的氨基酸序列比对,黄连SMT具有相同功能区域,因而可以参与金黄紫堇碱的9位氧原子的甲基转移反应.黄连SMT与其它植物SMT的氨基酸酸序列的进化分析表明,它与同为毛莨科黄连属的日本黄连的同源性较近.黄连N-甲基乌药碱-3'-羟化酶基因的成功克隆为黄连植物中小檗碱的基因工程等研究打下了良好的基础.     

小麦Ta-UBXl基因的电子克隆和生物信息学分析

用电子克隆方法获得了1个小麦U - box蛋白基因Ta- UBXI,采用生物信息学方法,对该基因编码蛋白从氨基酸组成、基本理化性质、跨膜结构域、疏水性/亲水性、亚细胞定位、高级结构及功能域等方面进行了预测和分析.结果表明:小麦Ta - UBXl基因全长2059 bp,具有完整的ORF编码框,编码553个氨基酸;在N端存在1个显著的UBX保守结构域,该蛋白序列不存在跨膜区或信号肽;生物信息学分析表明,在序列组成、高级结构及活性位点等方面,与其他禾本科植物的同类U - box蛋白具有高度的相似性.     

澳冰草中一个新型α-gliadin基因的克隆与序列分析

以澳冰草(Australopyrum retrofractum)基因组DNA为模板,用小麦种子醇溶蛋白的保守引物进行PCR扩增,对扩增产物进行克隆测序。结果表明,获得的扩增片段总长度为936 bp,包含一个完整的262个氨基酸的编码区,基因库登录号为EF536330,序列比对表明该序列为α-gliadin基因家系成员。利用α-gliadin基因的编码氨基酸序列建立系统树分析表明,序列EF536330不能与源于普通小麦的A、B和D染色体组的α-gliadin基因序列聚在一起,而单独聚为一类,推测所获得的来自澳冰草W染色体组的序列EF536330为麦类α-liadin基因家系的新类型。     

普通小麦-奥地利黑麦抗条锈病衍生系NR1121的鉴定

【目的】检测从普通小麦(Triticum aestivumL.)与奥地利黑麦杂交后代选育出的、形态学稳定的抗条锈病衍生系NR1121的黑麦遗传物质。【方法】在室内条锈病抗性鉴定的基础上,采用细胞学方法、基因组原位杂交、SCAR(Sequence characterized amplified region)标记以及SSR(Simple sequence repeat)标记、A-PAGE等方法,对普通小麦-奥地利黑麦衍生系NR1121进行分子细胞遗传学鉴定。【结果】NR1121和奥地利黑麦对条中32号生理小种(CY32)免疫,陕麦611和携带Yr9基因的洛夫林10、洛夫林13、秦麦9号、丰抗8号、陕229和偃师9号均高感,表明NR1121携带的抗条锈病基因来源于奥地利黑麦。NR1121细胞学稳定,根尖细胞染色体数2n=42,花粉母细胞减数分裂期2n=21Ⅱ;以奥地利黑麦总基因组DNA为探针的原位杂交结果显示,NR1121含有2条奥地利黑麦染色体。SCAR和SSR标记(Xgwm 131-1B)检测结果表明,NR1121携带黑麦1R染色体的遗传物质。A-PAGE结果显示,NR1121在ω区的Gli-B1位点具有黑麦特征带,说明NR1121含有黑麦1R染色体短臂上的遗传物质。【结论】NR1121为农艺性状优良的小麦-黑麦1R异代换系,对CY32免疫,其抗病基因来源于奥地利黑麦,可能是一个不同于Yr9基因的新抗条锈病基因。该种质可作为条锈病抗源用于小麦抗病育种。