鱼类致病嗜水气单胞菌外膜蛋白P5的原核表达、免疫保护及抗血浆杀菌作用研究

研究鱼类致病嗜水气单胞菌外膜蛋白P5的免疫学功能,为相关疫苗开发奠定理论基础。采用生物信息学方法分析P5的理化性质;分子克隆构建P5表达菌株并确定其最佳诱导表达条件,包涵体洗涤和SDS-PAGE电泳切胶纯化P5蛋白,并免疫小鼠制备P5抗血清;Western blotting检测抗血清特异性与效价,免疫酶联法模拟P5抗血清对嗜水气单胞菌的体外识别;P5抗血清被动免疫红鲫,攻毒以评价P5蛋白的免疫保护功能;Western blotting分析P5蛋白抵抗鱼血浆的杀菌作用。结果表明:P5蛋白在气单胞菌属间同源性较好,进化保守。成功克隆表达、纯化P5蛋白,其最佳表达条件为:诱导时菌液浓度OD_(600)=1.0,IPTG浓度0.5 mmol/L,32℃诱导8 h。Western blotting验证P5抗血清特异性较好,效价达到1∶1 600,ELISA显示P5抗血清与嗜水气单胞菌存在识别作用,表明P5蛋白具有较好的免疫原性与抗原性。被动免疫显示P5抗血清对红鲫的免疫保护率为显著性的56%,具有良好的免疫保护作用。Western blotting发现P5蛋白可通过表达下调有效抵抗鱼血浆的杀菌作用,表明其可能与细菌抗血浆杀菌有关。综上,嗜水气单胞菌外膜蛋白P5是一种保护性抗原,有望作为防治嗜水气单胞菌感染的疫苗候选成分。     

嗜水气单胞菌外膜蛋白TolB的原核表达及生物信息学分析

为筛选TolB作为嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）渔用疫苗候选抗原,从嗜水气单胞菌中克隆了外膜蛋白tolB基因并异源表达,采用生物信息学方法预测TolB的理化性质和结构特征。结果显示,tolB基因片段（去除信号肽）全长1 263 bp,编码1条含有420个氨基酸残基的多肽,分子质量45.78 ku。成功在大肠杆菌E. coli BL21(DE3)中异源表达TolB蛋白,其为稳定的亲水性外膜蛋白。TolB蛋白家族在不同菌株间具有同源性,尤其在气单胞菌间亲缘关系更近。TolB蛋白二级结构以无规则卷曲为主,具有潜在的B细胞、细胞毒性T淋巴细胞（CTL）和辅助T细胞（Th）抗原表位;相互作用网络主要为TolPal系统蛋白。综上,TolB具有成为嗜水气单胞菌亚单位疫苗有效候选抗原的特性。     

牛乳头瘤病毒2型L1基因真核表达载体的构建及真核表达

为在真核细胞中表达牛乳头瘤病毒2型(BPV2)衣壳蛋白L1基因。采用PCR方法从奶牛皮肤肿瘤病料中扩增BPV2沙湾分离株L1基因,克隆入pMD18-T载体中,测序后进行序列分析。以pcDNA 3.1(+)为真核表达载体构建重组表达质粒,转染入BHK-21细胞,通过间接荧光免疫试验检测BPV2-L1蛋白的表达。本研究成功构建pcDNA3.1(+)-BPV2-L1重组真核表达质粒,证实能表达出BPV2-L1蛋白,为BPV2DNA疫苗的研发提供了前期基础。     

鳗鲡病原菌外膜蛋白三联表达载体的构建、表达与表达产物的纯化

为研制能同时预防鳗鲡3种常见病原菌感染的三联外膜蛋白疫苗,分别选择创伤弧菌(Vibrio vulnificus)、迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)和嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)外膜蛋白的ompU、ompA和omp porinП基因,设计特异性引物后分别扩增基因中表达外膜蛋白膜外区域且抗原决定簇丰富的3个基因片段并通过融合PCR技术进行连接。根据表达载体(pGEX-2T-his)的限制性酶切位点,在连接片段的两端引入BamHⅠ和EcoRⅠ两个酶切位点,将3个外膜蛋白基因片段与质粒连接后成功构建了重组表达载体。重组表达载体成功转化大肠杆菌(E.coli BL21)后,当菌液浓度(D600nm)为0.8时加入0.25mmol/L IPTG,16℃培养过夜后得到了高效表达。表达产物用镍柱进行洗脱纯化后经梯度尿素复性获得了分子质量约85ku的高纯度蛋白。     

迟钝爱德华氏菌外膜蛋白基因工程表达产物的免疫原性

构建迟钝爱德华氏菌外膜蛋白重组表达载体后,表达纯化获得分子质量约53ku的外膜蛋白。将100尾日本鳗鲡均分为2组,分别腹腔注射牛血清白蛋白(BSA,0.5mg/mL)和迟钝爱德华氏菌外膜蛋白(Omp,0.5mg/mL)0.2mL/尾。于免疫后第7、14和28天采集鳗鲡血液、粘液、肝脏和肾脏,测定各时间点的补体活性、溶菌酶活性、全血细胞转化水平和血清抗体效价。结果发现,外膜蛋白组鳗鲡的补体活性于免疫后第7天极显著高于对照组;其抗体效价于第14天和第28天显著或极显著高于对照组。免疫后第28天以迟钝爱德华氏菌、嗜水气单胞菌和创伤弧菌(1.0×107 cfu)腹腔注射感染鳗鲡。结果发现,外膜蛋白组鳗鲡对迟钝爱德华氏菌、嗜水气单胞菌和创伤弧菌的相对免疫保护率分别为71.4%、50.0%和12.5%。表明鳗鲡注射迟钝爱德华氏菌基因工程表达外膜后显著提高了其对迟钝爱德华氏菌感染的抵抗力,对嗜水气单胞菌的感染也有明显的交叉保护效果,但对创伤弧菌的交叉保护效果较弱。     

嗜水气单胞菌外膜蛋白AH6169的生物信息学分析及其原核表达

为嗜水气单胞菌外膜蛋白AH6169亚单位疫苗的研究奠定理论基础,采用生物信息学方法分析了AH6169的理化性质、结构与功能;分子克隆构建AH6169表达菌株,正交试验筛选其最佳诱导表达条件;通过包涵体洗涤和SDS-PAGE电泳切胶纯化AH6169蛋白;小鼠免疫蛋白制备多克隆抗血清;Western blotting鉴定抗血清特异性与效价;酶联免疫法体外模拟AH6169抗血清与重要水产病原菌的相互识别作用。结果表明,AH6169属跨膜蛋白,无规则卷曲占全序列46.79%,延伸25.49%,α-螺旋22.69%;不同种类的气单胞菌AH6169蛋白保守性较高;成功构建AH6169表达菌株,最佳表达条件为诱导时菌液浓度OD_(600)=0.8,IPTG浓度0.1 mmol·L~(-1),32℃诱导8 h;纯化获得AH6169蛋白,制备的AH6169小鼠抗血清具有较好的特异性,且效价达到1∶1 600;AH6169蛋白抗血清与嗜水气单胞菌、荧光假单胞菌和溶藻弧菌存在相互识别作用。说明AH6169蛋白有较好的抗原性,AH6169可为不同种类的气单胞菌提供交叉免疫保护作用,并且其细胞表位较为丰富,可能是一种潜在的疫苗候选成分。     

新孢子虫NcGRA2基因真核表达质粒的构建及其在293细胞内的表达

[目的]为了构建新孢子虫NcGRA2基因的真核表达载体,探讨重组载体在体外细胞的表达.[方法]从含有NcGRA2基因的重组质粒pGEX-4T1-NcGRA2中,用限制性内切酶进行酶切获得带有粘性末端的NcGRA2基因片段.经琼脂糖凝胶电泳切胶回收NcGRA2基因片段,与pcDNA3.1载体连接.将构建的真核表达质粒pcDNA3.1-NcGRA2转染到293细胞中表达.[结果]经酶切分析和序列测定,证实了重组质粒的正确连接.经免疫荧光抗体试验验证pcDNA3.1-NcGRA2能在293细胞中表达NcGRA2蛋白.[结论]获得重组质粒pcDNA3.1-NcGRA2,并能在体外细胞中表达NcGRA2蛋白,为进一步研究核酸疫苗的动物免疫试验奠定了基础.     

犬MC4R突变体D90N真核表达载体的构建及表达

[目的]构建犬黑皮质素受体4（MC4R）突变体D90N真核表达载体,并在MDCK细胞中进行表达。[方法]以犬MC4R基因组DNA为模板,应用重叠PCR扩增MC4R突变体D90N目的基因,将扩增产物进行T-A克隆;酶切、测序鉴定成功后将目的基因亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1-myc-His/A。重组体pcDNA3.1-myc-His/A-cMC4R-D90N经酶切和测序鉴定;采用FuGENEHD介导转染技术将重组体导入MDCK细胞;转染后继续培养72.0h,提取细胞内总RNA,用RT-PCR鉴定目的基因的表达;提取细胞总蛋白,用WesternBlot检测蛋白表达。[结果]构建带标签的pcDNA3.1-myc-His/A-cMC4R-D90N重组真核表达载体,测序结果显示含有D90N突变位点。RT-PCR和Western Blot检测到目的基因表达。[结论]成功构建犬真核表达载体pcDNA3.1-myc-His/A-cMC4R-D90N,重组体能在MD-CK细胞中表达。     

猪瘟病毒DNA疫苗的构建及动物免疫试验

利用DNA重组技术将猪瘟病毒(CSFV)C株E2囊膜蛋白全长基因克隆到真核表达载体pcDNA4.0的CMV启动子下游,采用磷酸钙转染法将重组质粒转入293T细胞,流式细胞仪(FACS)检测293T细胞瞬时表达了E2囊膜蛋白。将构建的重组质粒肌肉注射BALB/c小鼠,用流式细胞仪和酶联免疫吸附试验(ELISA)检测证明成功诱导小鼠产生了抗E2蛋白的抗体,为下一步利用DNA疫苗免疫小鼠研制抗猪瘟病毒单克隆抗体打下基础。     

基于Meta分析的国内鱼、鳖源嗜水气单胞菌毒力基因研究

通过借鉴Meta分析法分析中国知网数据库(CNKI)中有关鱼源、鳖源嗜水气单胞菌的7种毒力基因的相关研究数据,探讨鱼源、鳖源嗜水气单胞菌毒力基因的分布特点及为研制嗜水气单胞菌多价DNA疫苗提供候选基因。分析结果表明:嗜水气单胞菌毒力基因的分布受养殖对象的种类和生长环境影响;南方和北方地区鱼源嗜水气单胞菌以毒力基因astA、altA、aerA和hlyA分布较为广泛,南方地区鳖源嗜水气单胞菌毒力基因hlyA、actA和aerA分布均较为广泛,可分别作为制备鱼源和鳖源嗜水气单胞菌多价DNA疫苗候选基因。     

嗜水气单胞菌黏附素基因克隆、序列分析及表达

利用PCR方法对江浙一带淡水鱼类暴发病病原致病性嗜水气单胞菌主要血清型O:9和O:97代表菌株TPS-30和BSK-10的黏附素基因(Al)进行扩增,并分析不同血清型和不同来源菌株Al的序列差异.结果表明:嗜水气单胞菌TPS-30株与BSK-10株相比较,Al序列在N端有个突变区,TPS-30株的Al基因突变区较BSK-10株短;通过pET28a(+)载体构建TPS-30株黏附素基因的表达载体pET28a-AHal,转化大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达,通过SDS-PAGE分析,显示与预期大小约41ku相吻合的融合蛋白带,诱导6h后目的蛋白获得了高效表达,表达量占菌体总蛋白的44.0%;通过免疫攻毒试验发现,免疫银鲫后血清效价在第5周达到峰值,重组表达的蛋白对同源菌株TPS-30和异源菌株BSK-10都具有较高的免疫保护率,分别达到94.7%和77.8%.这为基因工程亚单位疫苗的开发奠定了基础.     

犬黑皮质素受体4真核表达载体的构建及表达

[目的]构建带myc和His标签的犬黑皮质素受体4真核表达载体并在MDCK细胞中进行表达。[方法]以犬MC4R基因组DNA为模板PCR扩增目的基因编码区,将扩增产物进行T-A克隆;酶切、测序鉴定成功后将目的基因亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1-myc-His/A。重组体pcDNA3.1-myc-His/A-cMC4R经酶切和测序鉴定;采用FuGENE HD介导转染技术将重组体导入MDCK细胞;转染后继续培养72 h,提取细胞内总RNA,RT-PCR鉴定目的基因的表达;提取细胞总蛋白,Western Blot检测蛋白表达。[结果]构建带标签的pcDNA3.1-myc-His/A-cMC4R重组真核表达载体,测序结果与GenBank公布的序列相似性为99%。RT-PCR和Western Blot检测到目的基因表达。[结论]成功构建犬真核表达载体pcDNA3.1-myc-His/A-MC4R,重组体能在MDCK细胞中表达。     

共表达γ干扰素的乙型脑炎病毒与猪细小病毒核酸疫苗的构建及其免疫原性研究

为了构建和筛选良好的猪乙型脑炎和猪细小病毒的核酸疫苗,并提高核酸疫苗的免疫效果,用重叠PCR法把PPV VP2和JEV E10连接,再将扩增的IFN-γ连入构建载体pcDNA.VEI使其共同表达.用脂质体将pcDNA.VEI介导入Vero细胞,通过间接免疫荧光法检测目的基因的体外表达.用pcDNA.VEI和不表达IFN-Κ的pcDNAZ.VE分别免疫Balb/c小鼠,同时设立PBS、猪细小病毒灭活疫苗、乙型脑炎弱毒疫苗和pcDNA3.1空白质粒免疫对照组.共免疫两次,间隔2周检测免疫指标.结果表明,通过鉴定核酸疫苗的构建达到了预期目标,并可在荧光显微镜下观察到了其转染的Vero细胞.该核酸疫苗能够诱导脾淋巴细胞增殖.ELISA结果显示,与pcDNA.VE和阴性对照组进行比较,pcDNA.VEI所诱导产生的两种抗体都较高.pcDNA.VEI组能较稳定的诱导产生T细胞亚群,并检测到CD4+/CD8+比例于首免2周后都高于pcDNA.VE.因此表明该核酸疫苗能产生特异诱导体液免疫和细胞免疫且是安全的,证明了IFNγ基因具有免疫增强效果,为乙脑和猪细小病毒核酸疫苗研究提供了实验依据.     

木聚糖酶基因(XynB)肠道特异表达载体的构建及鉴定

将黑曲霉属XynB基因和猪RELMβ基因核心启动子区克隆到pcDNA3.1(-)中,构建携带绿色荧光和Myc双标记的肠道特异表达载体pcDNA3.1-RELMβ-XynB-Myc-GFP。利用脂质体介导将载体转染人结肠癌细胞(HT29)和人肝癌细胞(Bel7402),荧光显微镜检测发现,该载体可在HT29细胞特异表达绿色荧光蛋白;对转染该表达载体的HT29细胞进行RT-PCR检测和WB分析,结果表明,XynB基因在HT29细胞中正常转录,并且在细胞内检测到目的蛋白表达。     

猪瘟病毒Npro基因的克隆表达

 为了得到一个表达Npro蛋白的真核表达载体,从而为下一步研究不同时间段细胞主要组织相容性复合体（MHC）表达的变化情况,从分子水平上说明Npro与MHC之间的关系,本研究应用反转录聚合酶链式反应（RT PCR）技术对猪瘟病毒石门毒株Npro基因进行了克隆和测序,结果得到了长度为592bp的目的片段。用BamHⅠ和XhoⅠ限制性内切酶分别对重组克隆质粒和转移载体pcDNA30进行双酶切,回收目的基因DNA片段,将目的基因Npro亚克隆至真核转移载体pcDNA30中,经双酶切和序列测定鉴定插入基因和连接方向正确,得到含完整Npro基因的重组载体质粒P Npro。构建成功的真核表达载体以脂质体介导的转染方法将此重组载体质粒转染PK 15细胞,转染24和48h后检测表达情况。经Western blot方法检测表明,此Npro蛋白在PK 15细胞中正确表达。     

嗜水气单胞菌菌蜕系统的构建及其免疫效果研究

【目的】探讨鱼源嗜水气单胞菌菌蜕系统的可行性和应用性。【方法】以PhiX174基因组DNA为模板,对LysisE基因进行PCR扩增,并将纯化的PCR产物与原核表达载体pBV220双酶切后连接,构建溶菌质粒pBV220-LysisE。将pBV220-LysisE转入嗜水气单胞菌LN0925株中,构建LN0925(pBV220-LysisE)菌蜕疫苗(AHGs),进而通过溶菌动力学过程检测、电镜下细菌形态观察和动物免疫保护试验等评价所制备的菌蜕疫苗。【结果】PCR扩增成功获得长度为276bp的噬菌体LysisE基因;成功构建pBV220-LysisE重组质粒及AHGs。在42℃诱导60min后,LN0925(pBV220-LysisE)菌株开始出现溶菌现象,至3h后溶菌基本结束;溶菌至210min时,其裂解效率达到99.99%。菌液浓度对菌蜕裂解效率的影响试验表明,不同浓度质粒pBV220-LysisE均可以高效诱导嗜水气单胞菌LN0925株裂解。电镜观察发现,AHGs形成明显的溶菌孔道,整体细胞形态完好,且内容物流失。动物免疫保护试验结果表明,AHGs疫苗能明显提高鲤鱼的血清抗体水平,在免疫后5-6周血清抗体凝集效价达到1∶256,从第7周开始呈下降趋势;AHGs和甲醛灭活疫苗(FKC)的相对保护率分别为77.78%和55.56%。【结论】AHGs能够有效激活鱼体的免疫系统并产生免疫保护,且较FKC具有更好的免疫保护效果。     

犬瘟热病毒基因疫苗表达载体构建及在真核细胞中的表达

利用pCI载体构建了犬瘟热病毒基因疫苗表达载体质粒pCIF和pCIN,通过脂质体介导法将这两种真核表达质粒分别转染MDCK细胞,用RT-PCR法进行转录水平的检测,并用间接ELISA法检测目的蛋白是否表达。结果表明,真核表达质粒pCIF和pCIN已被成功构建,这两种重组质粒转染MDCK细胞72h后就可检测到目的基因的转录和两种目的蛋白的表达,表达的蛋白均能与抗CDV抗体发生特异性的抗原抗体反应。这为研究预防犬瘟热的基因疫苗奠定了良好的基础。     

北京油鸡肠道肽转运蛋白PEPT1表达载体的构建及在293-T细胞的表达

本试验通过分子生物学手段建立了北京油鸡PEPT1细胞模型。根据GenBank的原鸡PEPT1保守区序列设计引物,从北京油鸡肠道粘膜组织中扩增出PEPT1基因,将其与pGEM-T载体连接并测定核苷酸序列,成功获得到测序正确的2145bp的基因,并将北京油鸡肠肽转运载体PEPT1基因克隆到真核表达载体pcDNA3.0,构建了真核表达载体pcDNA3-PEPT1。采用脂质体介导将表达质粒pcDNA3-PEPT1转染293-T细胞,同时转染pcDNA3.0-EGFP荧光蛋白进行转染体系荧光监测,流式细胞术检测转录后16、20、24h的荧光强度。分别在16、20、24、44h收集等量转染细胞,抽提转染细胞总RNA,DNAseⅠ处理残留的DNA污染,反转录合成cDNA,以构建不同稀释度的pGEM-T-PEPT1质粒为模板,建立SYBERGREEN实时荧光定量标准曲线,检测PEPT1在293-T细胞中的转录水平。结果表明,在质粒转染入293-T细胞后,在16、20、24、44h均有稳定的转录水平。从而建立了在293-T细胞表达北京油鸡PEPT1的外源模型,同时为研究该转运蛋白性质,进一步调控动物肠道肽的吸收奠定了基础。     

3-1E/mChIL-15融合基因构建及在真核细胞中的表达

将鸡堆形艾美尔球虫(E.acervulina)子孢子和裂殖子表面抗原3-1E基因片段与鸡白细胞介素15成熟蛋白基因片段(mChIL15)通过四个柔性氨基酸SPGS连接,构建并鉴定真核表达质粒pcDNA3.1/3-1E-linker-mChIL-15。表达质粒纯化后应用磷酸钙法体外转染293T细胞,通过间接免疫荧光和免疫组织化学方法对重组质粒的体外瞬时表达进行检测。结果表明,成功构建了融合基因3-1E-linker-mChIL-15,转染后30h可检测到融合基因编码的融合蛋白在293T细胞中的瞬时表达。研究为鸡艾美尔球虫基因工程疫苗进一步研制及应用奠定了基础。     

GPC3过表达载体的构建和表达检测

目的构建并检测磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（glypican-3,GPC3）真核表达重组质粒。方法提取肾组织RNA进行逆转录,扩增GPC3基因的编码区,将其克隆到真核表达载体pcDNA3.1中,酶切鉴定并测序;将克隆成功的质粒转染至Huh7细胞,用荧光定量PCR和Western blot检测GPC3的表达水平。结果成功扩增GPC3编码区,并克隆至载体pcDNA3.1中;GPC3过表达载体转染至Huh7细胞后,荧光定量PCR和Western Blotting检测结果显示GPC3mRNA和蛋白表达水平均明显增加。结论成功构建GPC3过表达载体可用于后续研究。