猪IL-18基因原核表达载体的构建及表达

以含新兴猪IL-18基因的真核质粒pcDNA3.1-pIL18为模板,扩增出新兴猪IL-18基因,将其定向克隆至原核表达载体pET32c和pET41c的SacⅠ和KpnⅠ位点,构建了原核表达载体pET32c-pIL18和pET41c-pIL18。经酶切和PCR鉴定,表明所构建的重组质粒为特异性新兴猪IL-18基因原核表达质粒。将该重组质粒转化大肠埃希菌BL21(DE3)细胞,筛选的阳性菌落经SDS-PAGE分析及Western-blotting分析,表明成功构建了表达重组猪IL-18的大肠埃希菌基因工程菌株。蛋白的可溶性分析表明,重组蛋白呈不可溶表达,在菌体内以不溶性的包涵体形式存在。     

犬圆环病毒Rep蛋白的原核表达

犬圆环病毒(CanineCV)是一种新发现的圆环病毒。制备针对CaineCV Rep的抗体,为建立CaineCV ELISA检测方法及研究Rep蛋白的功能奠定基础。以CaineCV基因组作为模板,扩增出Rep基因序列。PCR产物克隆至pET-28a原核表达载体上,获得了重组质粒pET(28a)-Rep。将重组质粒转入大肠埃希菌BL21感受态细胞后进行诱导表达,SDS-PAGE分析表明重组Rep蛋白在大肠埃希菌BL21中获得表达。Western blot分析表明,重组蛋白能与Anti-His标签抗体发生特异性反应。该研究构建了pET(28a)-Rep重组原核表达质粒,并在大肠埃希菌中获得表达,为进一步制备Rep的抗体奠定了基础。     

PRRS病毒M蛋白在大肠埃希氏菌中的高效表达

将猪繁殖呼吸综合征病毒（PRRSV）ORF6基因从pGEM-T-ORF6重组质粒中亚克隆到pET-5a原核表达载体上，成功构建重组表达质粒pET5-ORF6。将共转化大肠埃希氏菌BL21（DE3）感受态细胞，重组菌经IPTG诱导表达，其细胞裂解物经SDS－PAGE可检测到分子质量约为19ku的目的蛋白带，经薄层扫描分析，目的蛋白占菌体总蛋白的26．8％，采用重组菌裂解物作为包被抗原进行ELISA检测，结果表明表达的蛋白显示特异性。     

猪生殖与呼吸综合征病毒非结构蛋白nsp4基因的表达及其产物的纯化

根据GenBank中已登录的猪生殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）全基因组序列，设计合成了1对特异性引物，对PRRSV非结构蛋白nsp4基因进行了RT-PCR扩增，将回收的目的基因片段克隆到大肠埃希氏菌表达载体pET28a中，构建了重组质粒pET-nsp4，测序结果证实了重组质粒pET-nsp4的可靠性。将pET-nsp4转化至大肠埃希氏菌表达菌株BL21（DE3），用IPTG诱导表达，SDS-PAGE结果表明，重组菌可表达分子质量约23ku的蛋白。经镍离子亲和层析柱（Ni-NTA）纯化，获得了高纯度的重组蛋白，Western-blot分析结果表明，nsp4重组蛋白在大肠埃希氏菌系统中获得了正确表达。     

J亚群禽白血病病毒gp85基因的克隆与表达

构建J亚群禽白血病病毒gp85基因的原核表达载体,并在大肠埃希菌中获得表达。根据原核表达载体pET30的酶切图谱设计引物,以重组质粒pBS-T-env为模板,扩增gp85基因。将此段基因克隆到表达载体pET30上,转化大肠埃希菌BL21,用IPTG诱导表达,经SDS-PAGE分析,表达出约为70ku的融合蛋白。获得了gp85基因的表达产物,为研制ALV-J的特异性抗血清及国内ALV-J病毒分子诊断试剂盒奠定了基础。     

大肠埃希菌O157:H7 eaeA基因的克隆及其表达质粒的构建

采用自行设计的引物,应用PCR方法直接从广东分离株大肠埃希菌0157：H7021210的染色体DNA中扩增出既8A基因的完整阅读框,得到了一条大小约为2800bp的基因片段。T—A克隆后将其亚克隆至原核表达载体pET-28a（＋）,经PCR鉴定、酶切鉴定及核苷酸序列测定,证实成功构建原核重组表达质粒pET—eaeA。大肠埃希菌O157：H7eaeA基因的克隆及原核表达质粒的成功构建,为下一步进行诱导表达、活性鉴定及既8A基因表达蛋白诊断抗原的研制奠定了基础。     

致倦库蚊天蚕素CecB2基因的原核表达及蛋白纯化

构建致倦库蚊(贵阳株)天蚕素B2(CecB2)基因原核表达载体,并原核表达获得重组蛋白。定向克隆CecB2成熟肽序列至原核表达载体pET32a(+)上,将成功构建的pET32a-CecB2重组表达质粒转化大肠埃希菌Rosetta中经IPTG诱导表达,对IPTG诱导浓度和诱导时间优化后表达所得目的蛋白采用镍离子亲和层析纯化,SDS-PAGE和Western blot检测鉴定表达蛋白。结果表明,成功构建原核表达载体pET32a-CecB2,IPTG浓度和时间优化结果为IPTG浓度为0.05mmol/L,诱导时间为3h。SDS-PAGE检测获得大小约25ku的可溶性纯化蛋白,Western blot鉴定纯化蛋白可与鼠抗His-tag单克隆抗体发生抗原抗体结合反应。说明所构建原核表达载体pET32a-CecB2能在大肠埃希菌中可溶表达,为进一步研究其生物学功能奠定了基础。     

土耳其斯坦东毕吸虫原肌球蛋白基因的原核表达

将pGEM—TM质粒上的土耳其斯坦东毕吸虫原肌球蛋白（TM）基因片段亚克隆至原核表达载体pET28a（＋），重组的pET28-TM在大肠埃希氏菌BL21（DE3）中经1mmol／LIPTG诱导表达出-37．5ku的融合蛋白。该蛋白经Ni—NTA亲和层析柱纯化，SDS—PAGE检测，出现与目的蛋白大小一致的单一条带。Western-blotting检测结果表明，纯化的蛋白可被自然感染东毕吸虫的山羊血清识别，这为进一步研究东毕吸虫基因工程疫苗奠定了基础。     

猪生殖与呼吸综合征病毒M基因和N基因的表达

将猪生殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的M基因和N基因从重组质粒pMD18-T—M—N中亚克隆至pBV220原核表达栽体上，成功构建了重组表达质粒pBVM—N。将pBVM—N转化大肠埃希氏菌DH5α感受态细胞．重组菌经温度敏感诱导表达，其细菌裂解物经SDS—PAGE可检测到分子质量约为19ku的目的蛋白，与M基因表达产物一致；经蛋白质分析软件Bandscan分析，其表达量可达19．1％；Western-blotting分析表明，该重组蛋白可被兔抗PRRSV血清所识别，与预期的M基因表达产物相一致，而N基因未获表达。     

猪圆环病毒2型ORF2基因的原核表达及反应原性分析

研究猪圆环病毒2型(PCV2)Cap蛋白的抗原性,为开发PCV2的检测方法奠定基础。以PCV2CAU0673毒株的DNA为模板,扩增获得702bp的目的片段,扩增产物克隆入pET30a(+)原核表达载体,构建pET30a-PCV2-ORF2重组质粒,转入大肠埃希菌BL21(DE3);在37℃以1mmol/L IPTG诱导表达6h;采用Ni-NTA树脂亲和层析纯化重组蛋白,并用不同浓度的尿素对纯化蛋白进行复性。SDSPAGE分析表明,该ORF2编码基因在大肠埃希菌中得到表达,蛋白大小约为34ku;Western blot检测结果表明,该重组Cap蛋白与PCV2阳性血清发生特异性反应,与NA-PRRSV和PPV1血清不发生交叉反应。成功构建了PCV2-ORF2原核表达载体,实现了在大肠埃希菌中的表达,纯化后的复性蛋白具有较好的反应原性,为猪圆环病毒2型检测方法建立或试剂盒的开发奠定了基础。     

胸膜肺炎放线杆菌毒素ⅠBD基因特异性片段的克隆及表达

以胸膜肺炎放线杆菌（APP）血清1型标准菌株基因组为模板，用PCR扩增ApxⅠ BD基因的特异性片段；对PCR产物纯化回收后与载体pMD18-T进行连接、转化，经酶切和序列分析鉴定后亚克隆到原核表达载体pET28a中，构建重组表达质粒pETIBD；转入大肠埃希氏菌BL21中，以IPTG诱导表达，进行SDS-PAGE电泳。结果，从APP中克隆的ApxⅠ BDDNA序列与已发表序列的同源性为100％，长1447bp，编码482个氨基酸，所表达的融合蛋白相对分子质量约54ku，与预期的大小相符。结果表明，含有ApxⅠBD基因特异性片段的重组表达载体pETⅠBD已成功构建。     

南阳牛BoLA-DRA基因的克隆及其在大肠埃希菌中的表达

为克隆南阳牛BoLA-DRA基因,构建原核表达载体并研究该基因在大肠埃希菌中的表达。从南阳牛脾脏组织中提取总RNA,利用RT-PCR方法扩增得到BoLA-DRA基因,将其克隆至pGEM-Teasy克隆载体上,转化感受态细胞DH5α,经测序鉴定后,进一步亚克隆至原核表达载体pGEX-4T-1中,构建出重组表达质粒,经IPTG诱导表达。结果表明,本试验成功克隆了大小为917 bp的BoLA-DRA基因,重组质粒pGEX-4T-DRA在大肠埃希菌中以包涵体形式表达,表达产物经SDS-PAGE和Western blot鉴定大小为54.4 ku,与预期结果一致。为进一步研究该蛋白的功能及制备抗体奠定了基础。     

猪传染性胃肠炎病毒TH-98株M蛋白基因的克隆及原核表达

构建了TGEV TH-98株M基因序列的原核表达载体，利用RT-PCR方法从TGEV TH98株中扩增出M蛋白基因，并亚克隆至原核表达载体pGEX-6P-1上，转化大肠埃希氏菌BL21（DE3）pLysS，用IPTG诱导重组菌株表达了融合蛋白。结果表明，从TGETH-98株克隆到了M基因cDNA，该基因全长789bp，与T014株、Purdue株、TFI株和96-1933株的M基因同源性分别为92．37％、98．35％、99．87％和96．96％。SDS-PAGE电泳结果显示，重组表达质粒获得了约57ku的目的带，其中M蛋白的分子质量约为31ku，与预期的结果一致；Western-blotting分析表明，融合表达产物可与TGEV全病毒制备的阳性血清发生反应。证实，TGEV的M基因高度保守，构建的M基因原核表达载体pGEX-6P-TM能在大肠埃希氏菌中获得高效表达。     

布鲁菌外膜蛋白Omp31原核表达及抗原性分析

克隆羊布鲁菌的外膜蛋白Omp31基因,在大肠埃希菌中表达、纯化,并对Omp31蛋白的抗原性进行分析。以羊布鲁菌的染色体DNA为模板,扩增Omp31基因,双酶切后克隆至pET32a上,在大肠埃希菌ER2566(DE3)中诱导表达,组氨酸结合树脂柱纯化,Western blot鉴定Omp31蛋白的抗原性。将Omp31克隆至载体pET32a,提取的重组质粒经PCR鉴定、双酶切鉴定和测序分析确定目的基因成功插入到了克隆载体中。将重组质粒转化于大肠埃希菌ER2566(DE3)中表达获得HIS融合蛋白,SDS-PAGE分析证明,表达产物为43 ku的融合蛋白。Western blot结果表明,表达的蛋白具有与布鲁菌外膜蛋白相同的抗原性。     

大肠埃希菌O157∶H7 eae A基因的克隆及其表达质粒的构建

采用自行设计的引物,应用PCR方法直接从广东分离株大肠埃希菌O157∶H7021210的染色体DNA中扩增出eaeA基因的完整阅读框,得到了一条大小约为2 800 bp的基因片段。T-A克隆后将其亚克隆至原核表达载体pET-28a( ),经PCR鉴定、酶切鉴定及核苷酸序列测定,证实成功构建原核重组表达质粒pET-eaeA。大肠埃希菌O157∶H7 eaeA基因的克隆及原核表达质粒的成功构建,为下一步进行诱导表达、活性鉴定及eaeA基因表达蛋白诊断抗原的研制奠定了基础。     

猪血管内皮细胞中分子伴侣Jiv9O基因的克隆与原核表达

克隆到猪Jiv90基因,构建原核表达载体并在大肠埃希菌中表达.从猪血管内皮细胞中克隆到Jiv90基因,将其克隆到pET-32a载体上,构建出重组表达载体,经IPTG诱导表达.结果表明,本试验成功克隆了大小为693 bp的基因,重组质载体pET-32a-Jiv90所表达的蛋白在大肠埃希菌中以包涵体的形式存在,表达产物经S...     

犬β-防御素cBD103的原核表达和纯化

将犬β-防御素103(canineβ-defensin 103,cBD103)基因亚克隆至原核表达载体pET-32a(+),构建重组表达质粒pET-cBD103,转化大肠埃希菌BL21感受态细胞,IPTG诱导表达后,利用Ni-NTA亲和层析纯化该蛋白,并用肠激酶酶切融合蛋白,SDS-PAGE鉴定表达产物和纯化产物。结果表明,质粒pET-cBD103经PCR及双酶切鉴定证明构建正确,大肠埃希菌中成功表达出目的蛋白,蛋白大小约为24ku,以可溶性表达为主。经过纯化和酶切,得到大小8ku的cBD103,与预期大小一致。该研究在大肠埃希菌中表达了目的蛋白,为下一步大规模制备cBD103奠定了基础。     

牛分支杆菌HBHA基因的克隆及原核表达

应用PCR技术扩增牛分支杆菌肝素结合血凝素(HBHA)基因并原核表达牛分支杆菌HBHA基因,利用在线分析软件对该基因序列及编码蛋白序列进行生物信息学分析。构建原核表达载体pET28a(+)-HBHA,并转化至大肠埃希菌BL21(DE3),经0.6mmol/L IPTG诱导目的蛋白表达,采用镍离子亲和层析纯化目的蛋白,SDS-PAGE及Western blot检测表达结果。结果表明,牛分支杆菌HBHA基因完整的ORF全长600bp,编码199个氨基酸。HBHA蛋白为碱性、亲水性蛋白质,含有12个潜在的磷酸化位点,存在抗原表位,亚细胞定位主要存在于细胞核及线粒体中,蛋白空间结构以α-螺旋、无规则卷曲、β-折叠为主。成功构建了原核表达载体pET28a(+)-HBHA并在大肠埃希菌中得到了高效表达,分子质量大小为28ku,主要以可溶性形式存在。说明牛分支杆菌HBHA蛋白是一种抗原指数较高的亲水性蛋白,在原核系统能高效的表达,为进一步研究提供了理论基础。     

羊传染性脓疱病毒CEV112基因的克隆与原核表达

为了克隆羊传染性脓疱病毒CEV112基因并对其进行原核表达,根据GenBank中CEV112基因序列信息设计1对引物,以CEV基因组为模板,采用PCR扩增出1条大小为867bp的CEV112基因,将其连接到pMD20-T载体上,构建pMD20-T-CEV112重组质粒,转化到大肠埃希菌(E.coli)DH5α感受态细胞中,提取质粒进行酶切鉴定。鉴定正确后构建重组质粒pET28a-CEV112,转化到E.coli BL21(DE3)感受态细胞中。经IPTG诱导表达,表达产物用SDS-PAGE和Western blot进行分析。结果表明,成功构建了pET-28a-CEV112原核表达载体,并在E.coli BL21(DE3)中表达了CEV112基因,表达的融合蛋白大小约36ku,且主要以包涵体形式存在,为后续开展CEV112基因的功能研究奠定了基础。     

亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒VP1基因的克隆及表达

从亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒中提取总RNA，采用反转录聚合酶链反应获得了长度约为700bp的核苷酸片段，大小与预期长度相符。扩增产物经克隆测序，证明其为VP1基因。将该基因亚克隆到原核表达载体pGEX-4T-1，成功构建了重组表达质粒pGEX-VP1；利用1PTG诱导，表达出了53ku的目的蛋白条带。Western-blotting分析表明，表达产物能与亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒抗血清特异性结合。亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒结构蛋白VP1在大肠埃希氏菌中表达成功。