AIM2炎症复合体活化体系的体外构建及初步应用

AIM2炎症复合体参与自身免疫性疾病和机体抵御病原体的过程,研究其激活机制具有重要的意义。为构建AIM2炎症复合体的体外活化体系,本研究通过PCR方法从人单核细胞(THP-1细胞)中扩增AIM2、ASC、pro-Caspase-1、 pro-IL-1β基因片段后,构建重组质粒p3×Flag-AIM2、 p3×Flag-ASC、 p3×Flag-pro-Caspase-1和p3×Flag-pro-IL-1β,分别转染HEK293T细胞后采用western blot鉴定各蛋白的表达。结果显示,分别约在41.9 ku、34.1 ku、 48.5 ku、 24.6 ku处出现特异性条带,表明融合Flag标签的AIM2、 ASC、 Caspase-1和IL-1β蛋白在HEK293T细胞中获得了表达。除此之外,还可以在HEK293T细胞中检测到39 ku的内源性AIM2蛋白特异性条带,表明HEK293T细胞自身也表达内源性AIM2蛋白。将不同浓度比例的上述重组质粒转染或共转染HEK293T细胞,24 h后各组再转染poly(dA:dT),采用间接ELISA检测各组细胞中IL-1β的分泌水平。结果显...     

表达猪白细胞介素2重组腺病毒的构建

为构建表达猪白细胞介素2(IL-2)的复制缺陷型重组腺病毒,本研究提取经刀豆球蛋白A(con A)刺激体外培养的长白猪外周血淋巴细胞总RNA,利用RT-PCR扩增猪IL-2基因,并克隆于质粒pIRES2-EGFP中,将含有IL-2及EGFP的基因片段亚克隆到腺病毒的穿梭质粒pDC315中,构建重组腺病毒穿梭质粒pDC315-IL-2-EGFP.利用脂质体转染方法将pDC315-IL-2-EGFP和腺病毒骨架质粒pBHGloxΔEl,E3Cre共转染HEK293细胞.根据腺病毒感染后形成的典型细胞病变及EGFP的荧光信号筛选重组腺病毒rAd-IL-2-EGFP.经western blot鉴定,结果表明获得了一株能够表达猪IL-2蛋白的重组腺病毒rAd-IL-2-EGFP.本研究为进一步研究猪IL-2在疫苗免疫中的增强作用及研制新型免疫增强剂奠定了基础.     

非经典细胞焦亡体外模型的构建

旨在深入研究非经典细胞焦亡的激活机制,本研究在体外构建非经典细胞焦亡模型,利用PCR方法扩增人源目的基因Caspase-4、hGSDMD-FL和hGSDMD-p30,使用无缝克隆的方法连接到相应的载体中,构建重组真核表达质粒pCMV-MYC-Caspase-4、p3XFLAG-hGSDMD-FL和pcDNA3.1-hGSDMD-p30-MYC,利用VigoFect试剂转染到HEK293T细胞后,采用Western blot方法验证各蛋白的表达情况;通过质粒共转染的方法构建非经典的细胞焦亡模型,分别检测细胞上清中LDH的释放、GSDMD有无被切割为有活性的N端p30片段和荧光观察PI染色情况来确定非经典细胞焦亡模型是否构建成功。结果显示：pCMV-MYC-Caspase-4、p3XFLAG-hGSDMD-FL重组质粒均成功构建,各蛋白于HEK293T细胞内均成功表达,质粒共转染后LDH分泌显著升高,Caspase-4将GSDMD全长片段切割为有活性N端GSDMD-p30片段,荧光显微镜观察到明显的PI染色,表明非经典细胞焦亡模型体外构建成功。非经典细胞焦亡模型在体外的成功构建,为进一步研究其激活机制奠定了基础。     

SIGIRR对奶牛乳腺上皮细胞TLR4致炎信号通路的负调控作用

旨在探究SIGIRR对奶牛乳腺上皮细胞(BMECs)TLR4信号通路的负调控作用。构建SIGIRR-pEGFP真核表达载体,脂质体法转染HEK293T及BMECs,荧光显微镜观察及Western blot验证融合蛋白SIGIRR-pEGFP的表达;LPS刺激转染后BMECs,检测TLR4及其信号通路分子IRAK1、IRAK4和TRAF6的变化,以及下游炎性因子IL-6、IL-8、IL-1β和TNF-α的表达量。结果显示,成功构建SIGIRR-pEGFP真核表达载体,荧光检测重组质粒转染到HEK293T和BMECs中;Western blot鉴定融合蛋白SIGIRR-pEGFP表达正确;重组质粒转染BMECs后,SIGIRR表达量较转染空载质粒组及空白未转染组显著升高(P0.01);炎性因子IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α、TLR4及下游信号分子IRAK1、IRAK4、TRAF6表达量显著降低(P0.01),转染空载质粒组与空白未转染组相比仅IRAK1表达量有差异(P0.05)。结果表明,本试验通过研究牛SIGIRR在BMECs中的作用,证实SIGIRR基因具有炎性负调控LPS-TLR4信号通路的作用,具有潜力成为临床治疗奶牛乳腺炎的新靶标。     

水牛髓样分化因子88融合蛋白真核表达载体的构建及其在HEK293细胞中的表达

将水牛髓样分化因子88(myeloid differentiation factor 88,MyD88)cDNA全长定向克隆至pEGFP-C1真核表达载体,通过酶切和测序鉴定正确后,经脂质体介导将重组质粒转染至HEK293细胞,应用荧光显微镜、流氏细胞术和Western blotting检测MyD88蛋白的表达。结果表明,酶切及测序结果证实重组质粒含有MyD88全长CDS序列,融合蛋白读码正确;荧光显微镜、流式细胞术和Western blotting检测证实,水牛EGFP-MyD88融合蛋白真核表达载体能够在HEK293细胞表达。本研究成功构建了pEGFP-C1-MyD88真核表达载体,并使其在HEK293细胞中获得表达,为进一步研究该基因的生物学功能奠定基础。     

奶牛溶菌酶基因(Lyz)乳腺特异性表达质粒构建与鉴定

研究旨在构建具有高效抗菌、活性持久的奶牛乳腺特异性表达质粒,探索研制新型抗菌制剂,为利用基因工程技术防治奶牛乳房炎提供重要材料。根据GenBank中奶牛溶菌酶基因(lysozyme,Lyz)mRNA序列(GenBank号:NM_180999.1)设计引物,从奶牛乳腺上皮细胞中RT-PCR扩增Lyz基因编码序列,将其克隆到携带增强型绿色荧光蛋白通用型表达载体pEGFP-N1中测序。重组质粒pEGFP-N1-Lyz经Ase I+Hind III双酶切除CMV启动子,将奶牛乳腺特异性表达β-乳球蛋白基因(BLG)启动子同源重组替换到Ase I和Hind III酶切位点,构建奶牛溶菌酶基因(Lyz)乳腺特异性表达质粒pBLG-EGFP-N1-Lyz,采用脂质体法转染奶牛乳腺上皮细胞(BMEC)、人肾脏上皮细胞(HEK293T),荧光显微镜检测转染细胞中绿色荧光蛋白的表达情况。结果表明,重组表达质粒pBLG-EGFP-N1-Lyz测序结果与目的片段长度相符,转染至BMEC细胞和HEK293T细胞,在奶牛乳腺上皮细胞观察到绿色荧光, HEK293T细胞未观察到绿色荧光,奶牛Lyz基因乳腺特异性表达质粒构建成功。     

新疆多浪羊pcDNA3.1-IL-1β表达载体的构建及鉴定

为了构建新疆多浪羊真核表达载体pc DNA3.1-IL-1β,试验采用重组质粒p MD-18TIL-1βPCR和质粒pc DNA3.1双酶切的方法,获得目的基因白细胞介素-1β(IL-1β)和载体片段pc DNA3.1(+),通过连接、转化宿主菌大肠杆菌DH5α感受态细胞,挑取阳性克隆,再通过菌液PCR和双酶切来验证阳性克隆,并测序。结果表明:试验已成功构建真核表达载体pc DNA3.1-IL-1β,完成了pc DNA3.1-IL-1β的菌液PCR和酶切鉴定。通过对IL-1β功能的了解,以及熟悉质粒提取和质粒连接的方法,完成重组质粒pc DNA3.1-IL-1β的构建。     

马Viperin的抗EIAV功能初步研究及其重组腺病毒的构建

Viperin是一种细胞内抗病毒蛋白,可以被I型干扰素、多聚I:C、脂多糖及多种病毒诱导表达,在细胞内主要定位在内质网和脂滴,具有广谱的抗病毒功能。为研究马Viperin(eViperin)在抗病毒感染中的作用,本研究应用RT-PCR从马巨噬细胞中扩增eViperin基因,并将其克隆于真核表达载体pDC315中构建重组质粒pDC-eViperin-Flag,将重组质粒转染293T细胞,western blot检测结果表明eViperin在293T细胞中正确表达。将该重组表达质粒与表达马传染性贫血病毒(EIAV)Gag前体蛋白(Gag precursor,Pr55gag)的表达质粒共转染293T细胞,转染48 h后western blot检测,结果显示实验组细胞培养上清中的Pr55gag含量显著低于空白对照组,表明eViperin具有抑制EIAV释放的作用。此外,将该重组表达质粒与腺病毒骨架质粒pBHGlox△E1,E3Cre共转染HEK293细胞,进一步构建拯救出表达eViperin的重组腺病毒,为研究eViperin的抗病毒功能研究奠定了基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒非结构蛋白1α(nsp1α)的N端锌指结构是其抑制NLRP3炎症小体活性所必需

猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是严重危害养猪业的病毒性传染病之一,其致病原猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)抑制宿主的天然免疫和特异性免疫反应,引起机体免疫抑制,造成持续性感染,从而给该病的防控带来困难。NLRP3炎症小体作为先天性免疫的重要组分在机体抗病毒中发挥重要作用。前期研究发现PRRSV能够激活NLRP3炎症小体,但PRRSV是否存在拮抗NLRP3炎症小体的组分还未见报道。本研究首先在缺失内源性炎症小体的HEK293T细胞中,共转染NLRP3、ASC、procaspase-1和pro-IL-1β四个真核表达质粒,建立NLRP3炎症小体的体外研究模型。然后,在该炎症小体模型细胞和猪肺泡巨噬细胞中,转染PRRSV nsp1α的真核表达质粒,结果表明nsp1α能够明显拮抗炎症小体的活化,而进一步的突变试验表明缺失N端锌指(ZF)结构或者突变ZF结构的nsp1α均不能抑制NLRP3炎症小体活化。本研究不仅首次发现了拮抗NLRP3炎症小体活化的PRRSV蛋白——nsp1α,而且发现nsp1α的N端锌指结构是其抑制NLRP3炎症小体活性所必需。本研究进一步发现了PRRSV拮抗天然免疫的新机制,并为PRRSV的防控提供了潜在的分子靶点和理论指导。     

比格犬ERβ_(1293)稳定细胞系的建立

为了建立ERβ1293的稳定表达细胞系,为ERβ1293的功能研究奠定基础。以重组质粒pEGFG-N1-ERβ1293为模板,扩增出全长ERβ1293,经胶回收纯化后连接到pMD18-T Vector,经测序鉴定后双酶切连接至Lenti-OE-Flag载体,重组质粒经PCR、双酶切、测序鉴定;使用HEK-293T包装细胞系,包装产生慢病毒。将所得病毒悬液感染HEK293细胞,利用Puromycin加以筛选,获得稳定表达细胞系,并采用Western blot方法验证基因表达情况。结果获得了Lenti-OE-Flag-ERβ1293重组质粒,并成功包装成慢病毒。利用病毒感染HEK293细胞后获得了稳定表达细胞系,Western blot方法证实,稳定表达细胞系可以成功表达ERβ1293蛋白,为研究ERβ1293的功能奠定了基础。     

热应激诱发的氧化应激对羊的影响及其作用机制

热应激会破坏机体氧化系统和抗氧化系统之间的平衡,诱发机体的氧化应激。而机体抗氧化系统与免疫系统息息相关,其中核转录因子E2相关因子2(Nrf2)信号通路是联系二者的重要途径。本文阐述了热应激如何诱导羊发生氧化应激,以及热应激诱导的氧化应激对羊肠道组织、机体免疫细胞及相关细胞因子表达分泌的影响和Nrf2信号通路的调控机制,以期系统理解热应激诱导的氧化应激对羊的影响。     

黑水虻幼虫替代饲料直接投喂对锦鲤生长消化、肝胰脏抗氧化酶和血清非特异性免疫指标的影响

以锦鲤为试验对象,将黑水虻幼虫活虫和黑水虻幼虫干虫分别替代饲料对锦鲤进行投喂,投喂30 d后测定血清和组织中抗氧化酶活性和非特异性免疫指标。结果表明,干虫组的特定生长率、增重率显著低于对照组和活虫组(P<0.05),而体均重与肥满度各组间差异不显著(P>0.05)。血清中ALT活力活虫组显著高于干虫组(P<0.05),AKP活力对照组显著低于活虫组和干虫组(P<0.05),AST活力、ACP活力和溶菌酶活力各组间差异不显著(P>0.05)。肝胰脏T-SOD活力和T-AOC对照组显著低于活虫组和干虫组(P<0.05),CAT活力和GSH-Px活力各组间差异不显著(P>0.05)。前肠淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶活力各组间差异不显著(P>0.05)。可见,将黑水虻作为一种环保、价格低廉的饲料投喂锦鲤,对其生长、抗氧化能力和非特异性免疫有促进作用,作为新型饲料具有可行性。     

TRIM21蛋白结构及其应答病原感染的研究进展

TRIM(Tripartite motif)蛋白家族是一系列细胞内具有广泛生物学活性的蛋白,约有80多种。其中TRIM21蛋白在各种类型细胞,特别是某些免疫细胞如T细胞、巨噬细胞和树突状细胞中广泛表达[1]。TRIM21最先作为自身抗原被发现,又称为Ro52/SS-A,常引起干燥综合征、系统性红斑狼疮和系统性硬化症等自身免疫病[2]。随着对TRIM21蛋白结构和功能的深入研究发现TRIM21蛋白具有E3泛素连接酶活性,并在固有免疫和适应性免疫的调控中发挥重要作用。TRIM21蛋白是目前在哺乳动物体内发现的唯一一个细胞浆内IgG受体[3],其介导的抗体依赖的细胞内中和反应(Antibody-dependent intracellular neutralization,ADIN)拓宽了人们对中和反应的认识。此外,TRIM21蛋白还在固有免疫中调控多种细胞因子的分泌。     

不同蛋白营养水平精补料对黄渠桥羊羔肉氨基酸含量的影响

试验研究了不同蛋白营养水平精补颗粒料对羔羊生长育肥性能的影响,试验选择出生15 d、体质量在10 kg左右的哺乳羔羊,采用随机分组试验设计,羔羊与母羊钻栏补饲的方法,通过饲喂不同营养水平的精补颗粒料,检测羔羊目标体质量达23 kg左右时,屠宰测定其羊肉氨基酸含量的变化。结果表明:羔羊早期补饲有利于羔羊增重,在羔羊生长到38日龄后,其体质量以试验Ⅰ组增长最快;饲喂不同蛋白水平精补颗粒料羔羊肉背最长肌中蛋白质含量、必需氨基酸含量及其占总氨基酸比例均是Ⅰ组均高于Ⅱ组、Ⅲ组和Ⅳ组,但组间差异不显著(P>0.05);同一饲养环境下,不同蛋白水平精补颗粒料饲喂羔羊其背最长肌肉中氨基酸风味各有不同,但差异不明显(P>0.05)。结果提示,以补饲颗粒精料粗蛋白18.5%和代谢能11.34 MJ/kg水平组合羔羊日增质量及其背最长肌中蛋白质含量、必需氨基酸含量等优势比较明显。     

桑枝屑不同添加量对桑黄的生物转化率和质量的影响

桑枝的纤维素、粗蛋白、矿物质等含量丰富,可以用作培养基生产桑黄。本研究根据培养基中桑枝屑不同添加量分别设A、B、C、D四个配方组及不含桑枝屑的对照组来培养桑黄。试验结果表明,A配方组、B配方组的桑黄子实体平均产量、子实体最高产量、平均生物学转化率均高于对照配方组,而C配方组、D配方组的桑黄子实体平均产量、子实体最高产量、平均生物学转化率均低于对照配方组。桑枝屑添加量为80%时,其生物学转化率和产量最高,因此可以得出最佳配方组为A配方组,桑枝屑代料栽培的桑黄的多糖含量均高于对照配方组,桑枝屑的添加量控制在80%内为宜。     

Seroprevalence and Risk Factors Associated With Corynebacterium pseudotuberculosis Detectable Antibodies in Equids in Alabama

A cross-sectional serological survey was carried out to screen the equine population of the nonendemic state of Alabama for the presence of detectable antibody titers against Corynebacterium pseudotuberculosis. A second objective was to determine the association of detectable titers with risk factors such as exposure to ruminants or previous travel to endemic states. A total of 342 equine serum samples from 40 Alabama counties were analyzed using the synergistic hemolysis inhibition test (SHI). The prevalence of detectable antibody titers (≥1:8) was 52.5% (95% confidence interval [CI], 47%–57.9%). Titers ≥1:128 were detected in 2.63% (95% CI, 1.2%–4.9%), and titers ≥1:512 were detected in 0.3% (95% CI, 0%–1.6%) of the sampled population. In the final generalized linear model, age (P < .001), breed (P = .023), and contact with cattle (P = .05) were associated with increasing SHI titers. Contact with goats was associated in the initial but not in the final analysis (P = .19). Previous travel was not associated with increasing SHI titer (P = .97). The results demonstrated a high prevalence of low detectable titers and low prevalence of titers ≥ 1:128 in a nonendemic population. Further evaluation of SHI cutoff titers and accuracy is warranted to reduce the risk of a false positive diagnosis.     

家禽热应激肠道黏膜屏障损伤及营养性修复研究进展

家禽肠道既是消化和吸收营养物质的重要器官,又是保持机体内环境稳定的先天性屏障,正常肠道内的黏膜屏障对于维持家禽的健康至关重要。在热应激过程中,家禽的肠黏膜是热应激机体损伤的敏感部位,容易造成肠黏膜损伤,破坏其屏障功能,阻碍肠道正常代谢功能,降低家禽的生产性能。文章主要就热应激对肠道黏膜屏障的损伤及营养性修复作用进行综述,旨在为缓解家禽肠道黏膜损伤的营养性物质的开发与应用提供参考依据。     

仔猪肠道菌群的建立与影响因素

肠道菌群生态平衡是猪营养、生理和免疫功能的基础。然而,在猪的生长发育过程中,菌群在肠道内定植和分布受到各种因素的影响,包括分娩环境、日粮成分、抗生素或其他替抗物的使用等。本文主要从仔猪肠道菌群的形成规律、影响因素和营养调控措施等方面论述了仔猪肠道菌群与仔猪肠道健康或疾病的关系,旨在为绿色健康养殖方面研究提供帮助。     

19个桑树品种(品系)饲养家蚕的产茧及产卵性能调查

为研究不同桑树品系的特性,于2017年春、秋两季对广西蚕业技术推广总站看桑选种园的19个桑树品系开展了养蚕鉴定实验。家蚕杂交种春季养蚕成绩和产卵性能表现均比较好的品种(品系)是桂桑优62,在秋季是勐简4号。没有发现全年鉴定结果均较好的桑树品种(品系)。     

植物源黄酮类化合物对动物免疫和抗氧化功能影响的研究进展

黄酮类化合物作为植物组成成分广泛存在于自然界中,根据连接基团的不同又被分为几个子类。它们具有免疫调节、抗氧化和抗菌等功能,而且均已在人体和动物模型中得到证实。同时,它们也具有改善家畜肠道黏膜形态、调节肠道菌群以及缓解热应激等功效。本文主要阐述了植物源黄酮类化合物对动物机体的抗氧化和免疫调节等作用及其机制,为进一步研究黄酮类化合物对动物生理功能的作用机理提供参考。