亮氨酸对猪胎盘滋养层细胞增殖及氨基酸转运的影响

为研究亮氨酸(Leu)对猪胎盘滋养层细胞(pTr)增殖、凋亡以及氨基酸转运载体表达的影响及其机制,本试验用不同浓度Leu(0、1、10 mmol/L)分别处理pTr细胞24 h和48 h后,使用荧光定量PCR技术检测pTr细胞增殖和凋亡相关基因、氨基酸转运载体以及mTOR信号通路关键蛋白等的mRNA表达水平。结果表明:Leu处理pTr细胞24 h后,1 mmol/L试验组的SNAT1(P<0.01)、4E-BP1 (P<0.05)和eIF4G(P<0.05)的mRNA相对表达量低于对照组;Leu处理pTr细胞48 h后,1 mmol/L试验组LAT1(P<0.05)、4E-BP1(P<0.01)的mRNA相对表达量低于对照组,10 mmol/L试验组CDK4(P<0.05)、4E-BP1 (P <0.01)、SNAT1 (P <0.01)、SNAT2 (P <0.01)、LAT1 (P <0.01)以及rBAT (P <0.05)的mRNA相对表达量也低于对照组;Leu处理pTr细胞24 h和48 h后,10 mmol/L组mTORC1的mRNA相对表达量较对照组和1 mmol/L组均极显著提高(P<0.01)。可见,10 mmol/L Leu会抑制pTr细胞的增殖活力,并可能通过mTOR信号通路的介导,降低了pTr细胞氨基酸转运载体的表达。     

外源褪黑素对鹿茸软骨细胞生长发育的影响

试验旨在探讨褪黑素对体外培养的鹿茸软骨细胞增殖、周期及凋亡的影响。利用甲苯胺蓝、茜素红S、阿利新蓝染色鉴定软骨细胞,采用外源添加褪黑素的方法,用不同浓度(0、400、800、1 200、1 600和2 000 pg/mL)、不同时间(24、48和72 h)处理鹿茸软骨细胞,CCK-8法检测细胞增殖。选取800 pg/mL褪黑素处理软骨细胞24 h,利用流式细胞仪检测细胞周期的分布及细胞凋亡情况,采用ELISA试剂盒检测细胞培养液中睾酮含量。结果显示,经不同浓度的褪黑素处理鹿茸软骨细胞不同时间后,800 pg/mL褪黑素处理鹿茸软骨细胞24 h细胞活力极显著增加(P0.01)。软骨细胞经褪黑素处理后,与对照组相比,褪黑素处理组细胞G1期比例显著降低(P0.05);G2期比例极显著增加(P0.01),细胞被阻滞在G2期;褪黑素处理组细胞早期凋亡率无显著变化(P0.05),晚期凋亡率显著下降(P0.05);ELISA检测睾酮分泌水平均显著上升(P0.05)。综上,外源添加800 pg/mL褪黑素可以促进鹿茸软骨细胞的增殖,抑制软骨细胞的晚期凋亡,促进睾酮的分泌;以上结果可为阐明褪黑素参与鹿茸生长发育机制提供参考。     

磷对成骨细胞活性[ Ca2+]i及细胞周期的影响

在体外培养4 dSD大鼠成骨细胞(OB)的基础上,添加不同浓度磷(0、1、2、4 mmol/L)作用48 h后,观察细胞超微结构,测定钙离子浓度([Ca2+]i);作用36 h后,检测OB细胞周期.磷作用48h后,4 mmol/L磷组OB内线粒体减少,总蛋白含量随磷浓度的增加而减少,4 mmol/L磷组显著低于对照组、1 mmol/L磷组和2 mmol/L磷组(P＜0.05);OB内[Ca2+];浓度在磷各组均增加(P＜0.01),2 mmol/L磷高于1 mmol/L磷(P＜0.05),4 mmol/L磷高于1 mmol/L磷(P＜0.01);磷对细胞周期变化不明显,仅1 mmol/L磷抑制细胞滞留在S期(P＜0.05).表明,添加磷作用48 h后,均促进OB内[Ca2+]i沉积,促进OB的体外矿化,4 mmol/L磷抑制OB的代谢活性,促进OB提前成熟,利于新骨的形成.     

Kisspeptin在牛卵巢颗粒细胞的表达及功能研究

为明确kisspeptin在牛卵巢颗粒细胞的表达和功能,本试验首先利用免疫荧光技术研究了kisspeptin在牛卵巢颗粒细胞的表达,随后利用MTT和ELISA技术研究了不同浓度的kisspeptin-10(Kp10)对牛卵巢颗粒细胞增殖和孕酮分泌的影响。结果表明,kisspeptin在牛卵巢颗粒细胞有表达,10、100、1 000nmol/L的Kp10处理24h,均可以极显著提高牛卵巢颗粒细胞活力(P0.01);100nmol/L的Kp10处理24、72h,可极显著提高牛卵巢颗粒细胞的活力(P0.01),但处理48h未能显著提高细胞活力(P0.05)。100nmol/L的Kp10处理24h,可显著提高牛卵巢颗粒细胞孕酮的分泌水平(P0.05),而10、1 000nmol/L的Kp10对孕酮分泌无显著影响(P0.05)。研究结果提示kisspeptin可促进牛卵巢颗粒细胞增殖和孕酮分泌。     

褪黑素对湖羊精液低温保存效果的影响

为研究褪黑素对湖羊精液4℃保存效果的影响,在前期筛选的湖羊精液稀释液中添加不同浓度(0.00、0.02、0.04、0.06、0.08 g/L)的褪黑素进行4℃冷藏试验,检测湖羊精子活力和顶体完整率,以及精液中过氧化氢酶(CAT)活力和丙二醛(MDA)含量。结果:与对照组相比,添加0.02 g/L褪黑素组在保存0、24、48、72、96 h的精液中MDA含量极显著降低(P0.01);0、24、48、72 h精液中CAT酶活力极显著提高(P0.01);48 h精子活力和顶体完整率极显著提高(P0.01)。综合比较表明,在湖羊精液稀释液中添加0.02 g/L褪黑素,在48 h内能够显著提高湖羊精液4℃稀释保存的品质。     

SAH对猪成纤维细胞体外增殖及甲基化水平的影响

本文旨在研究DNA甲基转移酶抑制剂S-腺苷高半胱氨酸（SAH）对猪成纤维细胞体外增殖活力、周期、凋亡和DNA甲基化水平的影响，为SAH在猪体细胞核移植上的应用提供理论基础。使用不同浓度的SAH(0、0.01、0.1、0.5、1mmol/L)处理猪成纤维细胞，通过CCK-8法检测细胞活力，流式细胞术检测细胞周期与凋亡，ELISA检测DNA甲基化水平，qRT-PCR检测相关基因表达情况。结果表明：与其余各组相比，0.1mmol/LSAH处理猪成纤维细胞24h对细胞活力和凋亡无明显影响，但可将细胞周期阻滞在G0/G1期（P<0.05）；与对照组相比，0.1 mmol/L SAH处理24 h可显著降低细胞中DNA甲基化水平及DNA甲基转移酶相关基因DNMT1、DNMT3A、DNMT3B的表达，同时，显著提高细胞周期调控基因P21、P27的表达，但对凋亡相关基因Bax、Bcl-2的表达无明显影响。总的来说，0.1 mmol/L SAH处理24 h效果优于其他组，对细胞损伤较小，可通过影响DNA甲基转移酶相关基因表达来参与调控DNA甲基化水平。     

白藜芦醇通过沉默调节蛋白1-解偶联蛋白2信号通路降低小鼠睾丸间质细胞TM3的氧化损伤

本试验旨在研究白藜芦醇(RES)对氧化损伤小鼠睾丸间质细胞TM3的保护作用,并探索其可能的作用机制。首先,用不同浓度(0、150、200、250、300μmol/L)的过氧化氢(H2O2)处理小鼠睾丸间质细胞TM3 8 h,确定建立氧化损伤细胞模型的适宜H2O2浓度;然后,用不同浓度(0、2.5、5.0和10.0μmol/L)的RES分别处理正常细胞24 h,确定RES安全浓度;最后,用安全浓度的RES处理氧化损伤细胞24 h。在整个培养过程中采用i CELLigence实时无标记细胞功能分析仪监测细胞的增殖情况;待安全浓度的RES处理氧化损伤细胞结束后采用2',7'-二氯荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)探针法检测细胞中活性氧(ROS)的含量,实时荧光定量PCR(RT-q PCR)和蛋白质印迹(Western blotting)法分别检测沉默调节蛋白1(SIRT1)/解偶联蛋白2(UCP2)信号通路中关键因子SIRT1和UCP2 mRNA和蛋白质的相对表达量。结果表明:1)用浓度为150μmol/L及以上的H2O2处理细胞8 h后,极显著降低细胞存活率(P0.01),因此确定150μmol/L为建立氧化损伤细胞模型的适宜H2O2浓度。2)用10.0μmol/L及以下浓度的RES处理正常细胞24 h后,细胞存活率均无显著变化(P0.05);用2.5、5.0和10.0μmol/L的RES处理氧化损伤细胞24 h后,细胞存活率均显著提高(P0.05),且各浓度RES组间无显著差异(P0.05)。因此,选用5.0μmol/L为RES的安全浓度。3)用5.0μmol/L的RES处理氧化损伤细胞24 h后,细胞中ROS的含量极显著降低(P0.01);细胞中SIRT1 mRNA和蛋白质的相对表达量极显著增加(P0.01),而UCP2 mRNA和蛋白质的相对表达量则显著或极显著降低(P0.01或P0.05)。由此可见,适宜浓度的RES可激活SIRT1同时抑制UCP2的表达,UCP2通过负反馈调节方式减少细胞内ROS的生成,从而在一定程度上抑制TM 3细胞的氧化损伤。     

VPA对牛胎儿成纤维细胞体外培养的影响

为了研究组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDACIs)丙戊酸(VPA)处理对牛胎儿成纤维细胞体外培养的影响,试验采用培养到第3代的牛胎儿成纤维细胞经VPA处理后,进行细胞生长曲线绘制及形态、活力、细胞周期的检测,并通过Real-time PCR检测Oct4和Cdx2的表达情况,经梯度浓度的VPA处理牛胎儿成纤维细胞,于24 h后观察细胞形态。结果表明:当VPA浓度高于0.5 mmol/L时,细胞开始出现异常形态,死细胞数目增多。0.5 mmol/L VPA处理牛成纤维细胞24 h可以显著抑制细胞活力,可将60%以上细胞的周期阻滞在G0/G1期;但处理48 h将导致细胞染色体整倍率显著下降。与对照组相比,VPA处理后,Oct4的表达量显著升高,而Cdx2基因的表达量则显著降低。说明用HDACIs VPA处理过的牛成纤维细胞作为体细胞核移植的供体细胞,可能更有利于克隆胚胎重编程及发育。     

干扰MSTN对绵羊成肌细胞增殖分化及相关基因表达的影响

旨在探讨MSTN基因对绵羊成肌细胞增殖和分化的作用及相关机制,进一步揭示MSTN在绵羊成肌细胞中的生物学功能。本研究利用重组腺病毒介导shRNA干扰绵羊成肌细胞内源性MSTN基因表达,通过CCK-8法检测成肌细胞增殖能力,流式细胞仪检测细胞周期变化,qRT-PCR检测p21基因表达。成肌细胞诱导分化后利用免疫细胞化学技术检测肌管的形成情况,统计细胞融合率,qRT-PCR检测诱导48、72、96h后MyoD、MyoG、Myf5、Myf6和HACD1基因的表达量变化。结果发现,干扰MSTN后成肌细胞的增殖受到抑制,细胞周期停滞在G0/G1期,并且p21的表达呈上升趋势。在对成肌细胞分化作用的研究中,发现干扰组与阴性对照组相比,诱导48h4个生肌调节因子的表达量均呈下降趋势,MyoG基因表达显著下调(P0.05);诱导72h干扰组成肌细胞融合率极显著高于阴性对照组(P0.01),Myf5和Myf6基因表达量极显著降低(P0.01),MyoD基因表达量升高不显著(P0.05),MyoG基因表达量极显著增加(P0.01),诱导96h,Myf5基因表达量显著降低(P0.05),MyoD基因表达量降低不显著(P0.05),MyoG基因表达量极显著降低(P0.01),Myf6基因表达量升高不显著(P0.05)。另外诱导72h,HACD1基因的表达量在干扰组中显著高于阴性对照组(P0.05),诱导48和96h无显著变化。研究表明,干扰MSTN表达对成肌细胞的增殖有抑制作用,对分化有促进作用,HACD1基因与成肌细胞融合相关。     

1α,25-二羟维生素D_3对大鼠成骨细胞增殖分化及周期的影响

在SD大鼠成骨细胞(Osteoblast,OB)体外培养体系中添加不同浓度1α,25-二羟维生素D_3(0、10~(-9)、10~(-8)、10~(-7) mol/L),作用24、48、72 h,测定OB增殖率、碱性磷酸酶(ALP)活性,作用48 h流式细胞仪测定OB周期.结果显示,10~(-9)mol/L 1α,25-二羟维生素D_3作用24、48、72 h均促进OB增殖(P<0.05或P<0.01),抑制ALP活性(P<0.01);10~(-8)、10~(-7)mol/L作用24、48 h,OB增殖率与对照组差异不显著(P>0.05),但24 h时ALP活性均明显升高(P<0.05或P<0.01),48 h则抑制了ALP活性并使OB滞留在G_2/M期(P<0.05或P<0.01);72 h时10~(-7) mol/L组OB增殖率极显著低于其余各组(P<0.01),并使ALP活性升高(P<0.01).表明低浓度1α,25-二羟维生素D_3能促进OB增殖,抑制其分化;高浓度1α,25-二羟维生素D_3能抑制OB增殖,促进其分化,并使细胞滞留在G_2/M期.     

脱氧雪腐镰刀菌烯醇和玉米赤霉烯酮对癌细胞的促增殖和促迁移作用

本试验旨在研究脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)和玉米赤霉烯酮(ZEN)对人结直肠腺癌细胞(HCT116细胞)、人肺癌细胞(A549细胞)、人肝癌细胞(Hep G2细胞)的促增殖和促迁移作用。设空白对照组,并以赭曲霉毒素A(OTA)作为阳性对照,采用噻唑蓝(MTT)比色法和细胞划痕愈合试验分别检测细胞活力和细胞迁移能力。结果表明:与空白对照组相比,0.080、0.400μmol/L OTA能显著或极显著增强HCT116、A549和Hep G2细胞活力(P0.05或P0.01),50.000μmol/L OTA则能极显著降低HCT116、A549和Hep G2细胞活力(P0.01);DON在低浓度(0.016、0.080μmol/L)时对HCT116和A549细胞活力无显著影响(P0.05),但能极显著增强Hep G2细胞活力(P0.01),而在DON中高浓度(2.000、10.000、50.000μmol/L)时则能极显著降低HCT116、A549和Hep G2细胞活力(P0.01);ZEN浓度在0.016~50.000μmol/L时能显著或极显著增强Hep G2细胞活力(P0.05或P0.01),ZEN在高浓度(50.000μmol/L)时能极显著降低HCT116和A549细胞活力(P0.01)。细胞划痕愈合试验结果表明,与空白对照组相比,1、10 nmol/L OTA、DON和ZEN作用24、48 h能极显著促进Hep G2细胞迁移(P0.01)。由此可见,在0.016~50.000μmol/L浓度内,DON和ZEN对Hep G2细胞有显著的促进增殖和迁移的作用,表明DON和ZEN在Hep G2细胞系上具有潜在的致癌性。     

钼对TM3小鼠睾丸间质细胞周期和凋亡的影响

以体外培养的小鼠睾丸间质细胞系TM3 为材料,加入不同质量浓度的钼酸钠溶液（0,10,20,40,80,160mg/L）染毒培养,分别在干预4,8,12,24,48h采用MTT法检测细胞的增殖。干预48h后,采用流式细胞术检测细胞周期和凋亡,单细胞凝胶电泳检测DNA损伤的变化。结果表明：与对照组相比,不同剂量钼酸钠作用24h后,睾丸间质细胞的增殖活性均受到抑制;不同质量浓度的钼酸钠作用48h后,细胞周期阻滞于G0/G1期,20mg/L及其以上剂量组G0/G1期细胞百分率与对照组相比显著升高（P〈0.05或P〈0.01）;与对照组相比,各剂量组TM3 小鼠睾丸间质细胞凋亡率显著升高,差异极显著（P〈0.01）;细胞尾部DNA含量及细胞尾长随着钼剂量的增加呈不同程度的增加,且存在着剂量—效应关系。结论说明钼能够引起睾丸间质细胞周期的紊乱,并诱导睾丸间质细胞发生DNA损伤和凋亡。     

亮氨酸对奶牛乳腺上皮细胞内乳脂合成相关基因和蛋白表达的影响

本试验旨在研究亮氨酸(Leu)对泌乳奶牛乳腺上皮细胞(BMECs)内乳脂合成相关基因和蛋白表达的影响,以探讨Leu对乳脂合成的影响机理。将第3代BMECs随机分为6个处理,每个处理6个重复。6个处理培养液中Leu浓度分别为0.45、0.90、1.80、2.70、3.60和7.20 mmol/L,37℃、5%CO2培养48 h后测定BMECs内甘油三酯(TG)的含量及乳脂合成相关基因和过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)与固醇调节元件结合蛋白(SREBP1)蛋白的相对表达量。结果显示:Leu浓度对BMECs内TG含量无显著影响(P0.05)。适宜浓度的Leu显著促进脂肪酸合成酶(FASN)和乙酰辅酶A羧化酶A(ACACA)基因的表达(P0.05),FASN基因的相对表达量以1.80~2.70 mmol/L Leu处理、ACACA基因的相对表达量以1.80~7.20 mmol/L Leu处理较高。Leu浓度显著影响BMECs内SREBP1基因及蛋白表达(P0.05),以1.80 mmol/L Leu的促进效果最好。虽然Leu显著抑制BMECs内脂肪酸结合蛋白3(FABP3)、脂蛋白脂酶(LPL)、乙酰甘油磷酸脂酰转移酶6(AGPAT6)、线粒体甘油-3-磷酸酰基转移酶(GPAM)和嗜乳脂蛋白亚家族1成员1(BTN1A1)基因的表达(P0.05),但只有高浓度(3.60~7.20 mmol/L)的Leu抑制作用较大。综合来看,Leu浓度影响BMECs乳脂合成相关基因及PPARγ和SREBP1蛋白的表达。Leu浓度为1.80~2.70 mmol/L时,对脂肪酸从头合成相关基因及调控因子SREBP1蛋白表达的促进效果较好,对TG合成及脂滴形成相关基因表达的抑制作用较小。     

罗格列酮对非酯化脂肪酸体外诱导的犊牛原代肝细胞线粒体功能紊乱的影响

本试验旨在探讨非酯化脂肪酸(Nonestesterified fatty acid,NEFAs)对体外原代培养犊牛肝细胞线粒体功能以及罗格列酮对NEFAs诱导的线粒体功能紊乱的影响。体外添加NEFAs(1.8mmol/L)处理犊牛原代肝细胞不同时间,运用Western blot和实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法检测线粒体呼吸链复合体IV(COX IV)蛋白水平及mRNA水平的影响。另外选取细胞,罗格列酮(10nmol/L)预处理细胞24h后添加NEFAs(1.8mmol/L)处理9h。运用Western blot和qRT-PCR方法检测PGC-1α、Mfn-2的蛋白表达水平及COX IV mRNA表达水平。结果显示,随着NEFAs作用时间的增加,与0h组相比,NEFAs处理5h以上时COX IV蛋白表达水平极显著降低(P0.01),处理7~12h时COX IV mRNA表达水平呈显著降低(P0.05)。添加罗格列酮后,罗格列酮可极显著增加COX IV mRNA水平,PGC-1α、Mfn-2蛋白表达水平(P0.01)。结果表明,NEFAs可诱导犊牛原代肝细胞发生线粒体功能紊乱,罗格列酮可缓解由NEFAs诱导的犊牛原代肝细胞线粒体功能紊乱。     

云南无量山乌骨鸡肉品质物理特性的研究

为了解云南无量山乌骨鸡肉品质,试验对5,6月龄乌骨鸡各60只(公、母各半)肉品质客观指标(肉色、失水率、嫩度、p H值、蒸煮损失、剪切力)进行测定。结果表明:5月龄时,公、母鸡腿肌p H45 min值、p H24 h值极显著(P0.01)高于胸肌,母鸡腿肌亮度(L)值显著(P0.05)低于胸肌,母鸡胸肌失水率极显著(P0.01)高于腿肌;6月龄时,公鸡胸肌p H45 min值、p H24 h值、黄度(b)值与腿肌相比差异极显著(P0.01),腿肌失水率显著(P0.05)高于胸肌,母鸡胸肌p H24 h值、失水率、蒸煮损失率与腿肌相比差异极显著(P0.01),腿肌p H45 min值显著(P0.05)高于胸肌。5月龄时,公鸡胸肌剪切力显著(P0.05)高于母鸡,母鸡胸肌失水率极显著(P0.01)高于公鸡,公鸡腿肌p H24 h值极显著(P0.01)高于母鸡;6月龄时,公鸡胸肌红度(a)值极显著(P0.01)高于母鸡,公鸡腿肌a值和b值均极显著(P0.01)高于母鸡腿肌。5月龄母鸡胸肌p H24 h值、b值、失水率显著(P0.05)低于6月龄,5月龄母鸡腿肌p H24 h值显著(P0.05)高于6月龄。5月龄无量山乌骨鸡p H45 min值与p H24 h值呈极显著正相关,与失水率呈极显著负相关,与L值和b值均呈显著负相关。p H24 h值与L值和b值均呈显著负相关,与失水率呈极显著负相关,其余指标间无显著相关性。6月龄无量山乌骨鸡,p H45 min值与p H24 h值呈极显著正相关,与剪切力呈显著正相关,与失水率呈极显著负相关。p H24 h值与b值呈极显著负相关,与失水率呈显著负相关,与蒸煮损失呈显著正相关。L值与失水率呈极显著正相关。a值与b值呈显著负相关。剪切力与失水率呈极显著负相关,其余指标间无显著相关性。     

伪狂犬病毒感染对BHK-21悬浮细胞内质网应激和未折叠蛋白反应的影响

【目的】探讨伪狂犬病毒(PRV)感染对BHK-21悬浮细胞内质网应激及未折叠蛋白反应(UPR)的影响。【方法】将悬浮的乳仓鼠肾细胞(BHK-21)以感染复数(MOI)0.01接种PRV,分别在接毒后12、24、36、48和56 h取样,用CCK-8法检测细胞存活率,按Reed-Muench法检测病毒滴度,筛选病毒接种处理的合适时间;以不接毒细胞作对照组,分别在感染后12、24、36和48 h取样,用实时荧光定量PCR法检测内质网应激标志分子葡萄糖调节蛋白78(GRP78)及UPR的3种感受蛋白(PERK、IRE1、ATF6)相关通路中基因的表达变化,Western blotting法检测相关蛋白的表达变化。在接种PRV同时分别加入0、0.001、0.005、0.01和0.02 μmol/L内质网应激诱导剂毒胡萝卜素(Tg)和0、20、40、80和160 μmol/L内质网应激抑制剂牛磺熊去氧胆酸(TUDCA),48 h收集细胞测定病毒滴度和细胞存活率。【结果】PRV感染56 h细胞存活率低于70%,感染48 h时病毒滴度达到最高(8.1 lg TCID₅₀/mL),因此后续试验分别在接毒后12、24、36和48 h取样。与对照组相比,PRV感染36和48 h GRP78转录水平均极显著升高(P＜0.01);PERK通路中,转录激活因子4(ATF4)转录水平在PRV感染36、48 h均极显著升高(P＜0.01),生长抑制DNA损伤基因34(GADD34)转录水平在PRV感染36 h显著升高(P＜0.05)、48 h极显著升高(P＜0.01),磷酸化真核翻译起始因子(P-eIF2α)蛋白水平在PRV感染36、48 h均极显著升高(P＜0.01);IRE1通路中,PRV感染组细胞36 h后多以剪切形式sXBP1存在,同时下游p58^IPKmRNA水平在36 h显著增加(P＜0.05),p58^IPK和EDEM mRNA水平在48 h均极显著增加(P＜0.01);ATF6通路中,PRV感染不同时间ERp57、PDI、Calnexin和Calreticulin的表达均无显著变化(P＞0.05)。与0 μmol/L组相比,0.01和0.02 μmol/L Tg极显著降低细胞存活率(P＜0.01),0.005和0.01 μmol/L Tg均极显著增加了PRV病毒滴度(P＜0.01)。【结论】PRV感染可以诱导BHK-21悬浮细胞内质网应激,激活UPR的PERK和IRE1信号通路,说明PRV利用内质网应激增强其复制。     

宰后猪肌肉糖酵解与肉质性状的相关性分析

为了研究宰后猪肌肉糖酵解对肉质性状的影响,试验选择48头北京黑猪对其肉质性状[宰后24 h的pH值、肉色L~*值、72 h滴水损失(DL值)]以及糖酵解指标[宰后6 h及24 h的丙酮酸激酶(PK)、乳酸脱氢酶(LDH)活性和丙酮酸(PA)、乳酸(LA)含量]进行测定,并对肉质性状及糖酵解指标进行Pearson相关分析。结果表明:宰后24 h pH值为5.94,24 h L~*值为50.61,72 h DL值为1.41;24 h pH值与24 h L~*值、72 h DL值均呈极显著负相关(P0.01),24 h L~*值与72 h DL值呈极显著正相关(P0.01)。宰后24 h的PK、LDH活性极显著低于宰后6 h(P0.01);宰后6 h LDH活性与宰后6 h、24 h LA含量均呈显著正相关(P0.05);宰后6 h LA含量以及LDH活性与72 h DL值呈显著或极显著正相关(P0.05或P0.01),与24 h pH值呈极显著负相关(P0.01),分别与24 h L~*值呈极显著或显著正相关(P0.01或P0.05)。说明LDH活性对于宰后肌肉糖酵解具有更为重要的调控作用,其活性与LA的含量及肉质性状密切相关,LDH活性与LA含量可作为肉质性状评价的指标。     

氨基咪唑-4-甲酰胺核苷酸对破骨细胞自噬和分化的影响

为了探究氨基咪唑-4-甲酰胺核苷酸(AICAR)对破骨细胞自噬及分化能力的影响,以BALB/c小鼠骨髓巨噬细胞诱导分化形成的破骨细胞为研究对象,添加0.5 mmol·mL~(-1)AICAR(AMPK激活剂)处理4 h后,抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色鉴定破骨细胞;CCK-8法检测破骨细胞存活率;高内涵系统分析TRAP~+细胞比率、面积、荧光强度及圆度;蛋白免疫印迹(Western blot)和荧光定量聚合酶链式反应方法(qRT-PCR)检测AMPK、NFATc1、c-Fos、CTSK、TRAP、(LC3-Ⅱ)、ATG5、Beclin1、p62的mRNA和蛋白水平;激光共聚焦显微镜观察EGFP-pmCherry-LC3荧光聚点。结果显示,通过30 ng·mL~(-1)M-CSF和60 ng·mL~(-1)RANKL诱导分化4 d的细胞TRAP染色后大部分呈阳性且细胞核数目≥3。AICAR处理后,与对照组相比,细胞存活率无显著差异(P0.05),但细胞面积、TRAP~+(细胞核数目≥3)细胞率、TRAP荧光强度显著下降(P0.05)。AICAR组破骨细胞c-Fos、TRAP(P0.01)、p62(P0.05)的mRNA水平显著下降,LC3、ATG5的mRNA水平显著升高(P0.05)。AICAR处理致AMPKα蛋白磷酸化水平极显著升高(P0.01),NFATc1、c-Fos、CTSK、p62(P0.01)和TRAP(P0.05)蛋白表达量显著下调,LC3-Ⅱ、ATG5和Beclin1蛋白表达水平极显著上调(P0.01)。转染LC3质粒结果显示AICAR处理后LC3黄色及红色荧光聚点数目增多,绿色荧光聚点数目减少。结果表明0.5 mmol·mL~(-1)AICAR作用4 h可激活破骨细胞AMPKα,增强破骨细胞的自噬水平,但抑制了破骨细胞的分化。     

植物乳杆菌抑制产肠毒素型大肠杆菌诱发猪肠上皮细胞炎症反应的分子机制

本试验旨在研究植物乳杆菌抑制产肠毒素型大肠杆菌(ETEC)诱发猪肠上皮细胞炎症反应的分子机制。试验利用植物乳杆菌预处理猪肠上皮细胞IPEC-J2 3 h,ETEC刺激细胞1、3、6、12和24 h,收集细胞及其培养上清,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测上清液中白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-8(IL-8)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的含量,采用实时荧光定量PCR检测细胞中Toll样受体2(TLR2)和Toll样受体4(TLR4)以及NOD样受体3(NLRP3)和NOD样受体6(NLRP6)的表达,采用Western blot检测细胞中丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)[p38和细胞外信号调节激酶(ERK)]和核转录因子-κB(NF-κB)p65的磷酸化水平以及紧密连接蛋白——闭合小环蛋白-1(zonula occludens-1,ZO-1)和闭锁蛋白(occludin)的表达。分别采用p38 MAPK抑制剂、ERK-MAPK抑制剂和NF-κB p65抑制剂处理IPEC-J2细胞1 h,再用植物乳杆菌预处理细胞3 h,最后用ETEC处理细胞24 h,收集细胞和培养上清,采用ELISA法检测IL-1β、IL-8和TNF-α含量以及乳酸脱氢酶(LDH)活性。结果表明:1)与ETEC处理相比,植物乳杆菌预处理能够极显著降低ETEC感染12～24 h细胞产生IL-1β、IL-8和TNF-α的含量(P0.01),显著或极显著提高ETEC感染3～12 h细胞中TLR2、TLR4、NLRP3和NLRP6的mRNA相对表达量(P0.05或P0.01),极显著降低ETEC感染24 h细胞中TLR2和NLRP3的mRNA相对表达量(P0.01),极显著降低ETEC感染3～6 h细胞中p38 MAPK和NF-κB p65的磷酸化水平(P0.01),显著或极显著提高ETEC感染6～24 h细胞中ZO-1和occludin的表达量(P0.05或P0.01)。2)与ETEC处理相比,抑制剂和植物乳杆菌共同作用能够极显著降低ETEC感染细胞产生IL-1β、IL-8、TNF-α的含量和LDH的活性(P0.01),植物乳杆菌单独作用也可以极显著降低ETEC感染细胞产生LDH的活性(P0.01),并且信号通路抑制剂对植物乳杆菌调控部分促炎性细胞因子的产生有协同作用。综上所述,植物乳杆菌可以通过致弱p38 MAPK磷酸化和阻断NF-κB信号通路的活化而降低炎症相关因子的产生,从而表现出提高猪肠上皮细胞完整性的潜力。     

二甲双胍对犬乳腺肿瘤细胞周期及其相关蛋白的影响

为研究二甲双胍对犬乳腺肿瘤细胞增殖和细胞周期的影响,以犬乳腺肿瘤CHMm和CHMp为模型,采用终浓度为0、5、10、20、40mmol/L二甲双胍对其进行干预,应用CCK-8法检测细胞增殖活性,流式细胞仪检测细胞周期分布比例,再通过Western blot检测细胞周期相关蛋白cyclin D1和p27的表达情况。二甲双胍作用48 h后,与对照组比较,CHMm细胞试验各组的成活率显著降低(P0.05),而CHMp细胞除了5 mmol/L组(P0.05),其他试验各组的成活率也显著低于对照组(P0.05),并且均呈现一定的浓度依赖性。流式细胞仪分析细胞分布比例发现,CHMm的G0/G1期细胞比例从(38.7±5.89)%增加到(70.36±5.78)%,CHMp的G0/G1期细胞比例也从(37.03±4.23)%增加到(54.92±4.67)%。随着二甲双胍作用浓度的增加,CHMm和CHMp细胞内cyclin D1表达量呈现减少的趋势,而p27表达量呈现上升的趋势。研究结果表明,二甲双胍可以抑制犬乳腺肿瘤细胞体外增殖能力,诱导细胞发生G0/G1期阻滞,并下调cyclin D1和上调p27细胞周期相关蛋白表达量,从而为犬乳腺肿瘤治疗提供一定的理论基础。