非洲猪瘟病毒pK205R蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

非洲猪瘟(ASF)传播对我国生猪养殖造成重大危害,开发用于ASF诊断产品已刻不容缓。本研究为制备非洲猪瘟病毒(ASFV)pK205R蛋白单克隆抗体,构建了能表达ASFV pK205R蛋白的工程菌BL21/pET-pK205R。经IPTG诱导,可表达可溶性的pK205R蛋白。经SDS-PAGE检测,获得的蛋白大小为25 kDa左右。经Western blot鉴定,纯化后的蛋白可与ASFV阳性血清发生特异性反应。以纯化的ASFV pK205R蛋白作为抗原免疫BALB/c小鼠,制备了12株针对ASFV pK205R蛋白的单克隆抗体。经间接ELISA方法鉴定,单克隆抗体的效价均不低于1∶80 000。单克隆抗体重链亚类分别为IgG1及IgG2b,轻链亚类均为κ。通过间接免疫荧光试验(IFA)测定12株单克隆抗体均不与猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、猪流行性腹泻病毒存在交叉反应,且均能与ASFV反应。本研究为建立快速检测非洲猪瘟病毒感染的诊断方法奠定了基础。     

非洲猪瘟病毒p30基因的原核表达及间接ELISA抗体检测方法的建立

为建立检测血清中非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)抗体的间接ELISA方法,本试验将ASFVp30基因进行原核表达,采用SDS-PAGE和Western blotting方法对重组蛋白进行表达鉴定和免疫原性分析,随后以纯化的重组蛋白为包被抗原,经条件优化、特异性试验、敏感性试验和重复性试验,建立一种血清中ASFV抗体的检测方法。结果显示,ASFVp30基因成功克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,获得pET-32a-p30重组质粒;转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞进行诱导表达,得到P30重组蛋白,重组蛋白大小约为42ku,主要以包涵体形式存在;Western blotting结果显示,纯化后的蛋白具有良好的免疫原性;以纯化的P30重组蛋白为包被抗原,建立了检测ASFV抗体的间接ELISA方法,通过方阵试验对间接ELISA方法进行优化,最终确定了抗原最佳包被浓度为1.2μg/mL,待检血清最佳稀释倍数为1∶100,最佳封闭液为1%BSA,酶标抗体最佳稀释度为1∶4 000,以此建立的ASFV间接ELISA方法临界值为0.322。本方法仅与ASFV阳性血清发生特异性反应,与猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、口蹄疫病毒、伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型及猪流行性腹泻病毒阳性血清均无交叉反应,具有较强的特异性。该方法检测ASFV阳性血清灵敏度可达到1∶1 600;批内重复性和批间重复性变异系数均10%。本试验建立的间接ELISA方法具有良好的特异性、灵敏度和重复性,可初步应用于ASFV抗体的检测。     

非洲猪瘟病毒p30基因的原核表达及间接ELISA抗体检测方法的建立

为建立检测血清中非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）抗体的间接ELISA方法,本试验将ASFV p30基因进行原核表达,采用SDS-PAGE和Western blotting方法对重组蛋白进行表达鉴定和免疫原性分析,随后以纯化的重组蛋白为包被抗原,经条件优化、特异性试验、敏感性试验和重复性试验,建立一种血清中ASFV抗体的检测方法。结果显示,ASFV p30基因成功克隆到原核表达载体pET-32a （+）中,获得pET-32a-p30重组质粒;转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞进行诱导表达,得到P30重组蛋白,重组蛋白大小约为42 ku,主要以包涵体形式存在;Western blotting结果显示,纯化后的蛋白具有良好的免疫原性;以纯化的P30重组蛋白为包被抗原,建立了检测ASFV抗体的间接ELISA方法,通过方阵试验对间接ELISA方法进行优化,最终确定了抗原最佳包被浓度为1.2 μg/mL,待检血清最佳稀释倍数为1：100,最佳封闭液为1% BSA,酶标抗体最佳稀释度为1：4 000,以此建立的ASFV间接ELISA方法临界值为0.322。本方法仅与ASFV阳性血清发生特异性反应,与猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、口蹄疫病毒、伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型及猪流行性腹泻病毒阳性血清均无交叉反应,具有较强的特异性。该方法检测ASFV阳性血清灵敏度可达到1：1 600;批内重复性和批间重复性变异系数均<10%。本试验建立的间接ELISA方法具有良好的特异性、灵敏度和重复性,可初步应用于ASFV抗体的检测。     

非洲猪瘟病毒E183L、B602L、K205R和A104R基因表达及诊断抗原筛选

为了获得非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)重组蛋白pK205R、pE183L、pA104R和pB602L,将Ba71V株的K205R、E183L、A104R和B602L基因分别亚克隆进行原核表达载体pET30a(+),构建重组质粒pET-E183L、pET-B602L、pET-K205R和pET-A104R,转化大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)。IPTG诱导后,纯化表达的蛋白,并进行Western blotting鉴定,结果4种重组蛋白与预期大小一致,且与ASFV抗体发生特异性反应。为了从表达的4种重组蛋白中筛选最佳诊断抗原,将其分别包被酶标板,间接ELISA检测ASFV阳性血清,发现重组蛋白pK205R、p54和pB602L血清学反应良好;在检测ASFV感染后第13天分离血清时,重组蛋白p54和pK205R效果更佳,这表明p54和pK205R重组蛋白是较好的诊断抗原,可用于ASFV感染后早期或中后期血清学诊断。     

非洲猪瘟病毒CD2v抗体间接ELISA方法的建立及其初步应用

为建立血清中非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)抗体的间接酶联免疫吸附试验(ELISA)方法,研究真核表达ASFV CD2v重组蛋白,并以纯化的蛋白为包被抗原,通过反应条件优化、特异性试验、敏感性试验和重复性试验,建立一种快速的ASFV间接ELISA检测方法。通过方阵试验对间接ELISA方法进行优化,最终确定抗原的最佳包被浓度为10μg/m L,待检血清的最佳稀释倍数为1∶25,最佳封闭液为1%BSA与明胶封闭缓冲液,酶标抗体最佳稀释度为1∶2 000,最优二抗稀释液为PBST,以此建立的ASFV间接ELISA方法临界值为0.366。该方法仅与ASFV阳性血清发生特异性反应,与猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、伪狂犬病病毒、口蹄疫病毒阳性血清均无交叉反应,具有较强的特异性。该方法检测ASFV阳性血清灵敏度可达1∶50,批内重复性和批间重复性变异系数分别为2.2%～9.4%和4.7%～8.1%。试验建立的间接ELISA方法具有良好的特异性、灵敏性和重复性,可初步应用于ASFV抗体检测。     

非洲猪瘟病毒P30蛋白的真核表达及间接ELISA抗体检测方法的建立

为建立快速检测猪血清中非洲猪瘟病毒(ASFV)抗体的间接ELISA方法,本研究以ASFV Pig/HLJ/2018株基因组为模板优化合成CP204L基因(1 bp～549 bp),构建pFastbac1-P30-His重组表达载体,利用杆状病毒-昆虫细胞真核表达系统表达ASFV重组P30蛋白(rP30),以Ni亲和纯化后的rP30作为包被抗原,经过一系列条件优化,建立了一种快速检测ASFV P30抗体的血清学方法。结果显示,胞外分泌的rP30约为30 ku,western blot鉴定结果显示其具有良好的反应原性;经优化确定了ELISA最佳反应条件:包被量为0.4μg/mL,待检血清稀释倍数为1.25,血清反应时间为30 min,兔抗猪IgG-HRP稀释度为1.10 000。利用该方法同时检测猪临床常见病毒阳性血清,结果显示建立的ASFV抗体间接ELISA方法仅对ASFV感染血清检测为阳性,与猪瘟病毒、猪伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合症病毒、猪圆环病毒和猪口蹄疫病毒阳性血清均无交叉反应,具有较强的特异性;将ASFV感染血清2倍倍比稀释后,利用本实验建立的ASFV抗体间接ELISA方法、ID.VET(P32)试剂盒和INGENASA(P72)试剂盒同时检测,结果显示本实验建立的方法检测灵敏度为1.128,与INGENANA(P72)试剂盒相同,低于ID.VET(P32)试剂盒(1.1 024);批内和批间重复性试验的变异系数均小于10%,重复性良好。利用该方法与ID.VET试剂盒同时对383份临床样品进行检测,二者符合率为98.9%。本研究建立的方法可为ASF的监测和防控提供技术支持。     

猪流行性腹泻病毒重组N蛋白间接ELISA检测方法的建立

为建立检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)血清抗体的间接ELISA方法,本研究以原核表达的重组N蛋白作为检测抗原,优化ELISA反应条件,建立了PEDV间接ELISA抗体检测方法。该方法仅对PEDV血清检测为阳性,对猪传染性胃肠炎、猪轮状病毒感染猪的阳性血清检测结果均为阴性;其批内和批间重复性试验的变异系数均小于10%。采用建立的ELISA方法检测了130份临床样品,其中78份血清样品为PEDV抗体阳性。表明建立的以重组N蛋白为包被抗原检测PEDV血清抗体的方法可以用于检测PEDV感染及相关的流行病学调查。     

非洲猪瘟病毒p72蛋白阻断ELISA检测方法的建立

本研究旨在建立一种非洲猪瘟病毒(ASFV)p72蛋白阻断ELISA抗体检测方法。以纯化的重组p72蛋白作为包被抗原,HRP标记的6E5抗体作为阻断抗体,通过对反应条件进行优化,建立了基于ASFV p72蛋白的阻断ELISA方法。用建立的阻断ELISA方法检测119份临床阴性血清,计算血清阻断率确定临界值,确定了该方法的判定标准：当阻断率PI≥50%时判定为ASFV抗体阳性;PI≤40%时判定为ASFV抗体阴性;当阻断率介于两者之间时,判定为可疑。该方法与猪伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、A型塞内卡病毒、猪口蹄疫病毒、猪大肠杆菌、猪多杀性巴氏杆菌、副猪格拉瑟菌和猪胸膜肺炎放线杆菌的抗体阳性血清无交叉反应,批间、批内试验的变异系数均小于15%。用该方法与商品化ASFV抗体检测试剂盒同时检测447份猪临床血清样品,两种方法的相对敏感性和相对特异性分别为95.3%和94.5%,符合率为94.9%。本研究建立的阻断ELISA方法具有较高的敏感性和良好的特异性,可用于ASFV感染诊断和流行病学调查。     

猪细小病毒3型VP2蛋白主要抗原表位区的原核表达及间接ELISA方法的建立

为建立检测猪细小病毒3型(PPV3)的间接ELISA方法,本研究选取PPV3 VP2多表位亲水区序列设计引物,扩增并原核表达该基因片段,以表达的重组蛋白作为包被抗原建立了PPV3间接ELISA抗体检测方法。结果显示,该检测方法仅对PPV3血清检测为阳性,与PPV1、PPV2、猪瘟病毒、口蹄疫病毒、猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病毒和猪繁殖障碍与呼吸综合征病毒等的标准阳性血清均无交叉反应,具有较强的特异性;批内和批间重复性试验的变异系数均小于10%,具有良好的重复性。本研究为临床上PPV3的检测提供了血清学检测手段。     

非洲猪瘟病毒p30蛋白单克隆抗体的制备及阻断ELISA抗体检测方法的建立

为建立检测非洲猪瘟病毒(ASFV)抗体的阻断ELISA方法,本研究利用原核表达的ASFV p30重组蛋白免疫BALB/c小鼠制备单克隆抗体。以重组p30蛋白作为包被抗原,以辣根过氧化物酶(HRP)标记的p30单克隆抗体作为检测抗体,经条件优化,建立了一种检测ASFV抗体的阻断ELISA方法。ROC曲线分析显示,该方法最佳阻断率临界值为16.63%。该方法与CSFV、FMDV-O/A、PRRSV、PEDV、SVA的阳性血清均无交叉反应;最低能检出1∶128稀释的阳性血清;批内和批间变异系数(CV)均＜10%。用本方法与商品化试剂盒平行检测208份血清样品,Kappa值为0.96,表明具有高度一致性。上述结果表明,本研究建立的阻断ELISA方法具有较高的特异性和敏感性,可用于血清ASFV抗体的检测,为ASFV流行病学调查及猪群疫情监控提供技术支持。     

非洲猪瘟病毒p72蛋白单克隆抗体的制备及阻断ELISA方法的建立

为建立检测非洲猪瘟病毒(ASFV)血清抗体的阻断ELISA方法，本研究对ASFV p72蛋白进行原核表达并纯化，将其免疫BALB/c小鼠并通过间接ELISA方法筛选到1株稳定分泌p72蛋白的杂交瘤细胞株3F8。以纯化的p72蛋白作为包被抗原，辣根过氧化物酶(HRP)标记的单克隆抗体(MAb)作为检测抗体，采用方正滴定法对反应条件优化后初步建立了检测ASFV的阻断ELISA方法。利用该方法检测133份ASFV阳性血清和73份ASFV阴性血清，通过ROC曲线分析确定临界值。结果显示，该方法的临界值为25.62%时，ROC的曲线面积最大，为0.9989，诊断敏感性和特异性分别为98.63%和98.5%。利用该方法检测ASFV、O型口蹄疫病毒(FMDV)、A型FMDV、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪流行性腹泻病毒、猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒阳性血清，结果显示，除ASFV阳性血清外，其他阳性血清均为阴性，表明特异性强；利用该方法和商品化试剂盒对2倍倍比稀释(1∶4～1∶2 048)的两种ASFV灭活阳性血清(P1、P2)检测，结果显示该方法检测结果与商品化试剂盒基本一致，敏感性高。利用该方法对3份灭活的...     

猪丁型冠状病毒重组N蛋白间接ELISA抗体检测方法的建立

猪丁型冠状病毒(PDCoV)是2014年检测出的一种新型猪源肠道冠状病毒,对养殖业造成严重的经济损失。为建立快速检测PDCoV的血清学方法,本研究以原核表达的PDCoVN重组蛋白为包被抗原,通过反应条件优化,建立了一种PDCoV重组N蛋白的间接ELISA抗体检测方法。结果显示,原核表达的PDCoV重组N蛋白约为28ku,westernblot证实表达蛋白具有良好的反应原性;以其作为包被抗原建立的PDCoV抗体间接ELISA方法仅对PDCoV血清检测为阳性,与猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪繁殖与呼吸系统综合征病毒等7种主要猪源病毒阳性血清均无特异性反应,具有良好的特异性。该方法检测灵敏度较高、重复性好,批内和批间重复性变异系数均小于10%;采用该ELISA方法对我国2014年~2016年间采集的不同地区猪场的100份临床血清样品进行了检测,阳性率高于45.9%,表明我国猪群中存在PDCoV感染。本实验建立的ELISA方法可以用于检测临床样品中的PDCoV抗体,是PDCoV流行病学调查的一种有效工具,对该病的防控具有重要意义。     

猪圆环病毒3型ORF2基因的截短表达及间接ELISA抗体检测方法的建立

试验旨在建立一种快速的猪圆环病毒3型(PCV3)抗体检测方法。采用PCR方法对PCV3 ORF2基因主要抗原区域进行扩增,并利用原核表达系统进行截短表达,以纯化后的重组蛋白作为包被抗原,建立间接ELISA抗体检测方法。结果显示:PCR扩增了片段大小为348 bp的ORF2基因主要抗原区域,PCR扩增产物克隆至pET-32a原核表达载体,转入大肠杆菌BL21,获得了以包涵体形式表达的重组蛋白,纯化后经Western blot鉴定表明具有良好的反应活性。以重组蛋白作为包被抗原建立了检测PCV3抗体的间接ELISA方法,对PCV3阳性血清的最低检出效价可达1∶20 480;用该方法检测猪圆环病毒2型(PCV2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪细小病毒(PPV)、伪狂犬病毒(PRV)、乙型脑炎病毒(JEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)等猪常见疫病阳性血清,结果均为阴性;批内重复性试验和批间重复性试验的变异系数均小于5%。应用该方法检测四川地区533份不同日龄临床猪血清样品,PCV3阳性感染率达14.82%。表明建立的ELISA方法具有良好的敏感性、特异性、重复性和临床适用性,为我国商品化PCV3血清学抗体检测试剂盒的研制奠定了基础。     

猪伪狂犬病毒野毒抗体间接ELISA检测方法的建立与应用

为建立一种敏感、特异、高通量的猪伪狂犬病毒(PRV)野毒抗体血清学检测方法,本研究利用原核表达技术表达了猪伪狂犬病毒gE蛋白,以纯化的重组gE蛋白为包被抗原建立了检测猪伪狂犬病毒野毒抗体的间接ELISA方法。参照已发表的PRV基因组gE基因序列,设计合成1对特异性引物,PCR扩增了长约606 bp的gE基因片段,将目的片段亚克隆至pET30a原核表达载体中,经IPTG诱导重组gE蛋白的表达,重组蛋白纯化后,免疫印迹检测证明具有良好的抗原性和特异性。以纯化蛋白为包被抗原,经间接ELISA反应条件的优化,建立了检测伪狂犬病毒野毒抗体的间接ELISA方法,该方法检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪细小病毒(PPV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)、PRV疫苗毒的阳性血清均为阴性;该方法批内与批间重复性试验的变异系数分别小于5%和10%;该方法与IDEXX gE-ELISA抗体检测试剂盒的符合率为96.2%。本研究建立的gE-ELISA检测方法为PRV野毒抗体检测以及野毒感染的快速诊断与流行病学调查等提供了一种简便、快速、高通量的血清学检测方法。     

非洲猪瘟病毒p22蛋白表达、多克隆抗体制备及间接ELISA方法的建立

【目的】试验旨在表达与纯化非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)的结构蛋白p22,将其作为包被抗原建立ASFV抗体的间接ELISA检测方法,用于诊断非洲猪瘟。【方法】将ASFV p22编码基因KP177R的截短体(24―145位氨基酸)克隆至原核表达载体pET-32a(+)中,将重组质粒pET-32a-p22转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经0.1 mmol/L IPTG诱导表达5 h,利用镍柱亲和纯化p22蛋白,并进行Western blotting鉴定。利用p22蛋白免疫BALB/c小鼠制备抗血清,并以含p22全长基因的真核表达质粒pCAGGS-EGFP-fp22转染HEK293T细胞为抗原基质,利用间接免疫荧光(IFA)鉴定抗血清的反应性。以重组p22蛋白为包被抗原,优化最佳抗原包被浓度、待检血清稀释度、封闭条件、抗原抗体反应时间、酶标二抗工作浓度等参数,建立ASFV抗体间接ELISA检测方法,并对临床猪血清样品进行检测。【结果】ASFV p22截短蛋白在大肠杆菌中高水平表达,蛋白产量为0.85 mg/100 g菌体;p22蛋白具...     

猪繁殖与呼吸综合征病毒重组N蛋白间接ELISA检测方法的建立及应用

为建立一种敏感、特异、快速的猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）抗体检测方法,本研究利用原核表达技术表达了PRRSV N蛋白,亲和层析纯化后作为包被抗原,通过对各反应条件优化选择,建立了PRRSV血清抗体的间接ELISA检测方法,并进行了交叉反应和重复性试验,以及同类成品试剂盒间的应用效果对比试验。最终确定了抗原包被最佳浓度为2 μg/mL,血清最佳稀释度为1∶100,血清及酶标二抗孵育时间均为30 min,显色时间为10 min,检测猪瘟病毒、猪圆环病毒、猪伪狂犬病病毒等5种常见猪病病原的阳性血清均为阴性;该ELISA检测方法批内和批间重复性的变异系数均小于10%;与商品化ELISA试剂盒效果比较显示符合率为94.7%。本研究建立的间接ELISA方法将为猪群感染野毒PRRSV后的快速诊断及流行病学调查提供一种简便易行、快速高效的血清学抗体检测方法。     

猪瘟病毒E2蛋白主要抗原区高效表达及间接ELISA抗体检测方法的建立和应用

利用大肠杆菌表达猪瘟病毒E2蛋白主要抗原区,建立猪瘟病毒间接ELISA抗体检测方法。依据大肠杆菌密码子偏好性对猪瘟病毒E2基因主要抗原区的稀有密码子进行同义替换,克隆至pET-30a(+),转化大肠杆菌BL21(DE3)构建重组表达菌,并将纯化重组蛋白作为抗原建立猪瘟病毒间接ELISA抗体检测的方法。对重组蛋白进行SDS-PAGE和Western blot检测,结果显示获得分子量为30 ku的重组蛋白,占细菌总蛋白的41%,与猪瘟抗体特异性反应强;间接ELISA重复性检测显示批内变异系数为3.72%,批间变异系数为4.75%;特异性检测显示,与猪圆环病毒、蓝耳病病毒、伪狂犬病病毒、猪细小病毒、猪流行性腹泻病毒和口蹄疫病毒的抗体阳性血清无交叉反应,并且对566份样品的临床检测结果显示与爱德仕猪瘟阻断ELISA试剂盒的阳性符合率为90.80%,阴性符合率为93.29%,总符合率为91.52%。结果表明密码子优化后E2重组蛋白实现高效表达,建立的猪瘟病毒间接ELISA抗体检测方法成本低、准确率高,可进一步开发应用。     

非洲猪瘟病毒无标签p30-ELISA抗体检测方法的建立及应用

非洲猪瘟(African swine fever, ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)引起猪的一种急性、热性、出血性、高度接触性传染病,临床症状以败血症、皮炎和关节炎为特征,高发病率和高死亡率。为建立临床检测ASFV抗体的间接ELISA检测方法,本研究扩增了ASFV-CP204L基因,通过pET-30a原核表达系统表达p30蛋白,使用Ni-NTA纯化表达产物,通过肠激酶切除外源性蛋白,得到无His-组氨酸标签的p30蛋白,以此为诊断抗原,建立间接ELISA方法。结果显示：表达的无标签p30重组蛋白大小约为30 ku,与ASF阳性猪血清具有较好的反应原性;确定ELISA抗原包被浓度为1 μg·mL^-1,根据ROC曲线下面积确定S/P值>0.398判定为阳性,批内、批间变异系数均<10%;与PCV2、CSFV、PRV-gE、PRRSV阳性血清无交叉反应与INGENASA商品化试剂盒总符合率为97.78%。用该方法分别检测标准阳性血清、动物感染试验血清和收集的区域性临床血清644份,该方法最低可检测到1∶512倍稀释的标准阳性血清样品;检测感染动物血清,其中80%(4/5)的试验动物在第10天抗体为阳性。644份临床猪血清样品中抗体阳性率为7.61%,其中,母猪、后备母猪、仔猪、保育猪和育肥猪抗体阳性率分别为3.03%、0%、4.94%、7.55%和28.7%。本试验建立的ASFV-p30间接ELISA方法具有良好的特异性、灵敏度和重复性,可应用于ASFV的抗体检测,为ASF的诊断和流行病学调查提供了技术手段。     

猪细小病毒间接ELISA抗体检测方法的建立与应用

为建立一种敏感、特异、高通量的猪细小病毒抗体检测方法,参照猪细小病毒(PPV)VP2蛋白的基因序列设计合成1对特异性引物,PCR扩增了VP2蛋白主要抗原区域,将目的片段克隆至p ET30a原核表达载体中,获得了以可溶形式表达的重组VP2蛋白,重组蛋白纯化后,经免疫印迹检测显示具有良好的抗原性;以纯化蛋白为包被抗原,经间接ELISA反应条件的优化,建立了检测PPV抗体的间接ELISA方法。结果表明:用该方法检测猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)阳性血清,结果均为阴性;批内重复性试验的变异系数小于5%,批间重复性试验的变异系数小于10%;与血凝抑制试验(HI)方法的符合率为94.49%;应用该方法检测869份疫苗免疫猪血清样品,免疫合格率为87.92%;检测248份未免疫疫苗猪血清样品,阳性感染率为7.25%。     

猪萨佩罗病毒3C蛋白间接ELISA抗体检测方法的建立

为建立快速检测猪萨佩罗病毒(PSV)的血清学方法,本研究以原核表达的PSV 3C重组蛋白为包被抗原,通过反应条件优化,建立了一种PSV重组3C蛋白的间接ELISA抗体检测方法。结果显示,该ELISA方法仅对PSV血清检测为阳性,与猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型等主要猪源病毒阳性血清均无特异性反应,具有良好的特异性。该方法的批内和批间重复性变异系数均小于10%,血清稀释度可以达到1∶320;采用该ELISA方法对我国2016年间采集的江苏省6个不同地区猪场的281份临床血清样品进行了检测,阳性率高达38.43%,表明江苏地区猪群中存在PSV感染。本实验建立的ELISA方法可以用于检测临床样品中的PSV抗体,特异性强、敏感性高、重复性好,是PSV流行病学调查的一种有效工具,对该病的防控具有重要意义。