gga-miR-142-5p负调控chMDA5抗传染性法氏囊病病毒感染的分子机制

传染性法氏囊病(infectious bursal disease,IBD)是由传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus,IBDV)引起的一种高度危害养鸡业的传染病。chMDA5在识别病原相关分子模式(pathogen associated molecular pattern,PAMPs)及激活宿主的天然免疫应答中具有重要的作用,但chMDA5识别IBDV的分子机制仍然不清楚。本研究用IBDV感染DT40细胞,在IBDV感染的DT40细胞中,chMDA5的表达水平显著升高。chMDA5过表达可以抑制IBDV的复制,并激活IFN-β promoter和Mx promoter活性,chMDA5抑制表达则得到相反的结果;chMDA5激活IFN-β promoter活性主要是通过IRF7通路。用生物信息学方法和双荧光素酶报告系统分析发现gga-miR-142-5p可作用于chMDA5的3'UTR;qRT-PCR和免疫印迹分析表明gga-miR-142-5p可以使chMDA5的蛋白水平表达降低,但mRNA水平没有变化;gga-miR-142-5p可依赖IRF7通路使IFN-β promoter和Mx promoter活性降低,IBDV复制水平升高。本研究表明,gga-miR-142-5p可以作用于chMDA5的3'UTR负调控chMDA5的表达从而影响其下游IFN-β promoter和Mx promoter活性来发挥抗IBDV感染的作用。     

chTLR3在传染性法氏囊病病毒感染中的作用及gga-miR-6655-5p对其调控的分子机制

为了探讨鸡Toll样受体3(chicken toll-like receptor 3,chTLR3)在传染性法氏囊病病毒(infectious bursal dis-ease virus,IBDV)感染中的作用及microRNA(miRNA)对其调控的分子机制,本研究用IBDV感染DF-1细胞,qRT-PCR和Western blot分析表明IBDV感染可使DF-1细胞中chTLR3的表达水平显著升高。chTLR3激活表达后可抑制IBDV的复制,进一步分析其机理发现,chTLR3表达上调可激活IFN-β启动子和抗病毒天然免疫基因Mx启动子的活性及NF-κB和IRF-7信号通路。用生物信息学方法和双荧光素酶报告系统分析发现gga-miR-6655-5p可作用于chTLR3的3′UTR;qRT-PCR和Western blot分析表明gga-miR-6655-5p可以使chTLR3的蛋白水平表达降低,但mRNA水平没有变化。本研究表明:gga-miR-6655-5p可以作用于chTLR3的3′UTR负调控chTLR3的表达,抑制IFN-β启动子和Mx启动子活性,使IBDV在细胞中的复制水平提高。     

gga-miR-21过表达细胞株对传染性法氏囊病病毒复制的影响

为研究microRNA(gga-miR-21)对传染性法氏囊病病毒(IBDV)复制的影响,本研究利用PCR方法从鸡的肝细胞基因组中扩增细胞pri-gga-miR-21,克隆于慢病毒表达质粒pL-EGFP中构建重组质粒pL-miR-21。将pL-miR-21与3个包装质粒pLP1、pLP2和pLP/VSVG共转染293FT细胞,制备含gga-miR-21基因的重组慢病毒VL+miR-21。将VL+miR-21感染DF-1细胞,经杀稻瘟菌素筛选获得过表达gga-miR-21的细胞株DF-miR-21,采用定量RT-PCR(qRT-PCR)检测表明,gga-miR-21的表达量比正常DF-1细胞提高60%。将IBDV接种于DF-miR-21细胞,在96 h后,其病毒滴度(104.75TCID50/0.1 mL)显著低于正常DF-1细胞的病毒滴度(108.75TCID50/0.1 mL)。采用生物信息学方法和双荧光素酶报告系统分析验证,在IBDV基因组VP1基因中存在gga-miR-21的结合靶点。将IBDV感染DF-miR-21细胞,采用western blot分析,VP1蛋白的表达量比正常DF-1细胞显著降低;用qRT-PCR分析,VP1 mRNA水平与正常DF-1细胞没有明显差异。本实验结果表明:细胞gga-miR-21可以抑制IBDV的复制,其分子作用机理是在VP1基因翻译水平上实现的。     

传染性法氏囊病病毒对鸡法氏囊组织中干扰素和p53转录的影响

为了分析传染性法氏囊病病毒(IBDV)感染对鸡体抗病毒天然免疫能力的影响,本研究应用IBDV弱毒(B87)和强毒(QL/12)分别感染4周龄SPF鸡,每隔12h(12~84h)取3只鸡的法氏囊组织作为1个pool,用荧光定量PCR(qRT-PCR)检测其感染前后干扰素(IFN)和p53的mRNA水平,同时分析法氏囊组织的病理变化和病毒载量。结果显示:在QL/12组,IFN-α和IFN-βmRNA水平随着时间的增加逐渐升高,48h达到峰值,随后降低;IFN-γmRNA水平随着时间的增加逐渐升高,60h达到峰值,随后逐渐降低;p53mRNA含量迅速升高,60h达到峰值,随后降低。在B87组,IFN-αmRNA水平先降低后升高(48h达到最低值),而IFN-βmRNA水平变化不规则,72h含量最高;IFN-γmRNA水平先逐渐升高后降低(72h达到峰值);p53mRNA含量变化较小,36h含量最高。QL/12组诱导法氏囊组织产生的IFN mRNA(IFN-α、IFN-β和IFN-γmRNA)以及p53mRNA水平均显著高于B87组。病理组织学检查,QL/12组法氏囊淋巴滤泡呈不同程度的损伤,而B87组法氏囊组织未见明显的组织病变。qRT-PCR检测,QL/12组法氏囊组织中病毒含量48h达到峰值(8.4×106拷贝/mg),而B87组法氏囊组织中病毒含量72h达到峰值(6.6×104拷贝/mg)。本研究结果表明IBDV感染严重干扰了鸡体IFN和p53介导的抗病毒天然免疫反应。     

IBDV感染雏鸡不同组织Mx基因的分布研究

为了探究传染性法氏囊病病毒(IBDV)感染雏鸡后抗病毒基因Mx在其体内不同组织的表达变化,试验以IBDV感染3天(22日龄)的SPF蛋鸡为研究对象,应用实时荧光定量PCR方法,检测了IBDV感染组雏鸡与对照组雏鸡法氏囊、盲肠扁桃体、脾脏、胸腺、肝脏、腺胃、十二指肠、卵巢等组织中Mx mRNA和IBDV VP2 mRNA表达水平。结果表明:IBDV感染雏鸡3 d后,Mx mRNA在盲肠扁桃体中表达水平最高,显著高于其他组织(P0.05);其次为法氏囊和肝脏;卵巢表达量最低(P0.05)。IBDV感染组雏鸡各组织Mx mRNA表达水平均显著高于对照组(P0.05)。IBDV感染雏鸡3 d后,IBDV VP2 mRNA在法氏囊中的表达量最高(P0.05),脾脏次之,其他被检组织无统计学差异(P0.05)。说明雏鸡感染IBDV 3 d后,IBDV载量在免疫器官较非免疫器官高;抗病毒基因Mx转录表达水平相对都比较高,其转录表达水平与器官的病毒载量没有明显的相关性。     

IBDV感染雏鸡法氏囊和脾脏中抗病毒基因Mx的表达变化

Mx蛋白是由干扰素诱导产生的在多种脊椎动物中发挥抗病毒作用的效应分子。为探究雏鸡感染传染性法氏囊病病毒(IBDV)后鸡抗病毒基因Mx m RNA在法氏囊和脾脏中的表达变化,采用IBDV感染雏鸡70只,分别于感染后0、24、72、120、168、192 h随机选取6只,收集法氏囊和脾脏,利用q RT-PCR技术检测IBDV感染后不同时间点鸡Mx m RNA表达变化。结果显示,雏鸡感染IBDV后,法氏囊和脾脏中Mx m RNA表达水平均极显著高于对照组(P0.01),对照组各时间点之间几乎无变化;且随着感染时间延长,法氏囊和脾脏中Mx m RNA表达量呈先增高后降低的趋势,法氏囊和脾脏分别在72和24 h Mx表达量达到最高,是对照组的66.13和25.40倍。结果表明,法氏囊和脾脏中Mx的转录水平随着IBDV在法氏囊中的增殖而迅速升高,而IBDV减少后Mx的转录水平下降;脾脏中Mx对IBDV感染的转录水平变化比法氏囊更为快速。     

传染性法氏囊病病毒感染对鸡细胞模式识别受体及抗病毒基因转录的影响

为研究传染性法氏囊病病毒(IBDV)感染对鸡细胞模式识别受体(PRRs)及天然免疫抗病毒基因转录的影响,本实验分别采用IBDV弱毒感染DT40细胞和强毒感染SPF鸡,以荧光定量RT-PCR(q RT-PCR)检测感染细胞和法氏囊组织中PRRs(TLR2、TLR3、TLR4、TLR7、MDA5和LGP2)及天然免疫抗病毒基因(IPS-1、IRF3、PKR、OAS、Mx)的m RNA转录变化。在IBDV感染DT40细胞的2 h到24 h内,ch MDA5、ch TLR3、ch LGP2、IRF3、PKR、OAS、Mx的转录水平显著上升,分别为324、22、61、29、16、225 000和18 700倍。当采用si RNA分别敲除DT40细胞中ch MDA5、ch TLR3和ch LGP2时,IPS-1、IRF3、PKR、OAS和Mx在IBDV感染后的2 h到24 h差异变化不显著。在IBDV感染SPF鸡法氏囊组织细胞中,ch MDA5和ch TLR3的表达显著降低,而ch LGP2表达无显著差异,IRF3、PKR、OAS和Mx的转录水平显著上升。TLR4和TLR7在IBDV的体外和体内感染试验中均未检测到,而IPS-1在IBDV的体外和体内感染试验中均变化不显著。本实验结果表明,ch MDA5、ch TLR3和ch LGP2在识别IBDV的感染中起着关键作用,IBDV感染严重抑制了PRRS ch MDA5和ch TLR3的转录,并且提示其抑制作用在体内与体外可能存在不同的分子机制。     

黄芩苷体外抗传染性法氏囊病病毒作用

为探讨黄芩苷体外抗传染性法氏囊病病毒(IBDV)感染鸡胚成纤维细胞系(DF1)作用机制,以DF1细胞为宿主细胞,利巴韦林为阳性对照药物,从黄芩苷对IBDV的直接灭活作用、阻滞作用、抑制吸附、穿入及其复制5个方面探讨黄芩苷抗IBDV机理。结果显示,黄芩苷的CC50为(206.48±12.74)mg/L,EC50为(46.76±3.15)mg/L,选择指数SI为4.415,在无毒质量浓度范围内其对IBDV的最高抑制率为72.02%;在阻滞试验和复制抑制试验中最高抑制率分别达到60.85%和68.11%;在病毒吸附、穿入抑制和直接灭活试验中抑制率很低,表明黄芩苷不能阻断IBDV对DF1细胞的吸附、穿入和直接灭活。结果表明,黄芩苷在体外可有效抑制IBDV对DF1细胞的感染,其抗病毒机制可能是干扰病毒的复制和阻滞,提示黄芩苷可作为预防及治疗传染性法氏囊病病毒的药物。     

鸡传染性法氏囊病毒病毒样颗粒的制备

为了制备鸡传染性法氏囊病毒病毒样颗粒,本试验通过RT-PCR技术扩增出鸡传染性法氏囊病病毒超强毒株JL株的VP2全长基因,并将其插入杆状病毒表达系统的供体质粒pFastBacHTA中,构建含有IBDV VP2基因的重组供体质粒pFast-VP2,转化DH10Bac E.coli感受态细胞中,经蓝白斑筛选,获得重组杆粒rBacmid-VP2,将重组杆粒rBacmid-VP2转染sf9细胞后得到重组杆状病毒vBac-VP2。rBac-VP2感染sf9细胞,提取DNA,经PCR电泳分析,得到1条与预期大小相符的特异性条带;间接免疫荧光检测,可见特异性荧光;Western-blotting分析,在大约53 000处出现1条特异性的蛋白条带;电镜观察感染重组杆状病毒的细胞上清和沉淀,均可见重组VP2蛋白自行组装形成的病毒样颗粒。试验结果表明IBDV VP2基因在昆虫细胞中得到了表达,并自组装成了IBDV病毒样颗粒。本试验为研制鸡传染性法氏囊病病毒样颗粒疫苗奠定了基础。     

传染性法氏囊病病毒VP2基因在转基因烟草中的初步表达

将鸡传染性法氏囊病病毒TS株VP2基因置于植物组成型表达启动子CaMV 35 S之下,构建了IBDV VP2基因的表达载体pBR-VP2,经根瘤农杆菌介导法将VP2基因整合到烟草基因组中,Northern杂交结果表明,转基因烟草中存在IBDV VP2基因的mRNA;Dot-ELISA和Western blotting检测表明IBDV VP2基因在烟草中得到了表达.     

鸡传染性法氏囊病的诊治

鸡传染性法氏囊病又称鸡传染性腔上囊病.鸡传染性法氏囊病是由传染性法氏囊病病毒(IBDV)所引起的一种急性,高度接触性传染病.发病率高,病程短.幼鸡感染后,可导致免疫抑制,并可诱发多种疫病或使多种疫苗免疫失败.本病病原为传染性法氏囊病毒(IBDV).     

传染性法氏囊病病毒免疫学研究进展

传染性法氏囊病病毒(IBDV)母源抗体对雏鸡的保护期大约为3周,在自然条件下,大多数鸡在2周龄～15周龄都能够感染IBDV.IBDV通过口腔或者呼吸道方式进入机体,在肠道相关组织的淋巴细胞和巨噬细胞内复制,然后通过血液循环进入法氏囊,盲肠扁桃体的细胞因子表达在强毒攻入SPF鸡体内后发生变化即是很好的例证.体内外的研究表...     

表达牛乳铁蛋白肽的重组鸡源乳酸杆菌抗IBDV感染的研究

为探究表达牛乳铁蛋白肽的重组鸡源乳酸杆菌pPG-XLFEC/M11对雏鸡抵抗传染性法氏囊病病毒(IBDV)感染的作用,本研究利用IBDVCEF94株感染DF-1细胞,通过CCK-8法检测病毒感染后的细胞活性,利用qRT-PCR检测病毒载量,结果显示重组乳酸菌表达的牛乳铁蛋白肽可以抑制IBDV在DF-1细胞内的增殖;以重组乳酸菌pPG-XLFEC/M11饲喂雏鸡,利用IBDV强毒UK661株进行攻毒实验,结果显示饲喂重组菌的雏鸡相比于对照组,IBDV的感染对其组织器官的损伤较小,总免疫球蛋白IgG和SIgA含量增加,细胞因子IL-6、IL-8、TNF-琢和IFN-酌以及TLR2的mRNA转录水平均显著升高,且提高了雏鸡的存活率。本实验结果表明,重组鸡源乳酸杆菌表达的牛乳铁蛋白肽可以增强机体的免疫应答水平,对雏鸡具有一定的抗IBDV感染的作用。本研究为表达牛乳铁蛋白肽的重组鸡源乳酸杆菌在生产中的应用以及为禽类疾病的预防奠定基础。     

IBDV感染对法氏囊RNA m~6A和DNA 5mC修饰以及相关催化酶基因表达的影响

传染性法氏囊病毒(IBDV)感染造成病鸡法氏囊严重损伤,引起免疫抑制,然其具体机制仍不明晰。本研究旨在探讨IBDV感染对法氏囊表遗传修饰及其相关酶表达的影响。试验采用21日龄商品肉鸡,给予IBDV处理,感染后3,5 d收集法氏囊组织。应用基于ELISA试剂盒检测总5mC和m~6A,Real-time PCR检测相关催化酶基因表达。结果显示,感染后5 d,总m~6A水平及其甲基转移酶METTL3和METTL14 mRNA表达均显著降低(P0.01);去甲基化酶FTO的表达在感染后3,5 d均显著降低(P0.05)。总5mC水平在感染后3 d明显升高(P0.05),其去甲基化酶Tet1 mRNA表达明显降低(P0.01);感染后5 d,甲基转移酶DNMT1 mRNA表达显著降低(P0.01),而DNMT3a的表达明显升高(P0.01);结果表明IBDV能够影响法氏囊5mC和m~6A谱及相关酶的表达,这可能是IBDV影响宿主免疫功能的途径之一。     

盐酸川芎嗪体外抗IBDV活性及其作用机制

为在体外成纤维细胞培养体系上探讨盐酸川芎嗪抗鸡传染性法氏囊病病毒的活性及其作用机制,采用MTT法结合细胞病变观察法,通过病毒感染抑制、复制抑制、吸附抑制和直接灭活试验进行评价。结果显示,盐酸川芎嗪在体外对鸡传染性法氏囊病病毒具有较强的作用,其EC50为(92.52±21.13)mg/L,SI≥21.62,最大抑制率达83.7%;盐酸川芎嗪对病毒具有较强的直接杀灭作用,但不能阻止病毒吸附;在复制抑制试验中,盐酸川芎嗪的抗病毒作用具有时间依赖性,分别在病毒吸附0、2、4h时将盐酸川芎嗪加入到体系中,盐酸川芎嗪显示出较强的抗病毒作用,随着病毒吸附时间的延长,盐酸川芎嗪对鸡传染性法氏囊病病毒的抑制作用逐渐减弱。结果表明,盐酸川芎嗪可通过直接杀灭鸡传染性法氏囊病病毒或/和干扰其早期复制过程而表现出抗病毒活性。     

盐酸川芎嗪体外抗IBDV活性及其作用机制

为在体外成纤维细胞培养体系上探讨盐酸川芎嗪抗鸡传染性法氏囊病病毒的活性及其作用机制,采用MTT法结合细胞病变观察法,通过病毒感染抑制、复制抑制、吸附抑制和直接灭活试验进行评价。结果显示,盐酸川芎嗪在体外对鸡传染性法氏囊病病毒具有较强的作用,其EC50为（92．52±21．13）mg／L,SI≥21．62,最大抑制率达83．7％;盐酸川芎嗪对病毒具有较强的直接杀灭作用,但不能阻止病毒吸附;在复制抑制试验中,盐酸川芎嗪的抗病毒作用具有时间依赖性,分别在病毒吸附O、2、4h时将盐酸川芎嗪加入到体系中,盐酸川芎嗪显示出较强的抗病毒作用,随着病毒吸附时间的延长,盐酸川芎嗪对鸡传染性法氏囊病病毒的抑制作用逐渐减弱。结果表明,盐酸川芎嗪可通过直接杀灭鸡传染性法氏囊病病毒或／和干扰其早期复制过程而表现出抗病毒活性。     

CAV与REV共感染SPF鸡对疫苗免疫反应的抑制作用

用1日龄SPF鸡人工感染鸡贫血病毒(CAV)和禽网状内皮增生病病毒(REV),探讨病毒感染对鸡体疫苗免疫反应的影响。结果表明,在用禽流感病毒(AIV,H5和H9)疫苗免疫后,CAV与REV单独感染均显著抑制了鸡体对H5和H9亚型禽流感病毒灭活疫苗的HI抗体反应,在CAV与REV共感染后,这种抑制作用更为明显。CAV单独感染后鸡体对新城疫病毒(NDV)和传染性法氏囊病病毒(IBDV)疫苗的免疫反应受到抑制,但与对照组在统计学上的差异不显著,然而,CAV可以显著加重REV感染对鸡体在NDV和IBDV疫苗免疫后抗体反应的抑制作用。从而证实CAV与REV共感染在疫苗免疫抑制上有协同作用。     

复方中药防治鸡传染性囊病的试验

观察中药对人工感染传染性囊病(IBD)雏鸡的死亡率、器官出血率、增重效果的影响,以及抑制人工感染的传染性囊病病毒(IBDV)致死鸡胚试验。结果表明:中药对人工感染传染性囊病雏鸡的治愈率为83.3%,降低死亡率61.1%(P<0.05);法氏囊、脾脏出血率显著降低;适量中药明显控制感染,提高增重,抑制IBDV致死鸡胚效果明显。     

黄连解毒汤防治鸡传染性法氏囊病的试验研究

用"黄连解毒汤"方剂对鸡传染性法氏囊病(IBD)做治疗试验和抑制传染性法氏囊病毒(IBDV)致鸡胚死亡试验.研究结果表明,黄连解毒汤对人工致病的鸡传染性法氏囊病的治愈率为83.3%,差异显著(P＜0.05);临床治疗治愈率为90.2%.抑制IBDV致死鸡胚效果明显.     

基于内部核糖体进入位点提高重组NDV表达IBDV VP2基因的研究

为提高重组新城疫病毒(NDV)外源基因表达量,本研究采用内部核糖体进入位点序列(IRES)构建表达鸡传染性法氏囊病病毒超强毒(vvIBDV) HLJ07株VP2双拷贝基因的重组NDV(rClone30-VP2-IRES-VP2),同时构建表达单拷贝VP2基因的重组NDV (rClone30-VP2)作为对照.间接免疫荧光试验表明VP2蛋白在感染两种重组病毒的鸡胚成纤维细胞(DF-1)中得到表达.Real-time PCR检测结果表明rCIone30-VP2-IRES-VP2中VP2 mRNA转录水平明显高于rClone30-VP2.生长曲线分析表明,两株重组病毒株与亲本NDV LaSota (Clone30)株在细胞培养中可以同样稳定复制.重组病毒株在鸡胚中多次传代之后仍稳定表达VP2蛋白.本研究通过建立NDV的反向遗传操作系统构建了独立表达IBDV双拷贝VP2基因的重组NDV,并证明双拷贝基因的表达水平优于单拷贝基因,为提高重组NDV外源基因的表达量提供了新的思路.