非洲猪瘟病毒非结构基因实时荧光LAMP检测方法的建立

为建立非洲猪瘟病毒(ASFV)通用型高通量检测技术,利用高度保守的非结构DNA聚合酶G1211R基因,制备质粒标准品,建立实时荧光LAMP方法,出现典型的S形核酸扩增曲线,扩增产物具有特异的熔解曲线。G1211R基因质粒标准品在1.81×10~5拷贝数/μL~1.81×10~9拷贝数/μL对数值与Ct值之间的线性关系良好。以ASFV E70株病毒核酸为模板,LAMP检测灵敏度达到21pg,优于荧光定量PCR方法。重复性试验LAMP检测批内和批间变异系数均小于5%。LAMP方法检测ASFV特异性良好,与猪圆环病毒2型、伪狂犬病病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒及昆虫核酸无交叉反应。以ASFV Arm 07株制备各种临床模拟样品,检出阳性率达到17.31%。检测方法的建立,可为非洲猪瘟防控提供新的技术手段,有利于不同基因型毒株检测和出入境快速筛查。     

A型猪塞内卡病毒TaqMan荧光定量PCR方法的建立

本研究针对A型猪塞内卡病毒(Senecavirus A, SVA)基因组保守区域设计了特异性引物及探针,建立了快速检测SVA的Taq Man荧光定量PCR方法。结果显示,以构建的重组质粒为标准品建立的Taq Man荧光定量PCR方法,标准曲线具有良好的线性关系,线性相关系数达0.9974;特异性良好,与口蹄疫病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒不存在交叉反应;对SVA核酸最低检测下限为3.75 copies/μL,而普通PCR最低检测下限为3.75×103 copies/μL;批内和批间的变异系数为均小于5%,重复性良好。本研究建立的SVA TaqMan荧光定量PCR方法为检测猪水疱性疾病病原提供了一种快速、灵敏的检测方法,为开展SVA流行病学调查提供了技术支持。     

鸡传染性支气管炎病毒SYBR Green Ⅰ Real-time RT-PCR检测方法的建立及应用

为了建立一种快速检测鸡传染性支气管炎病毒(IBV)的方法,试验以构建的重组质粒作为阳性标准品,建立了IBV SYBR GreenⅠReal-time RT-PCR检测方法对其进行研究。结果表明:该检测方法的标准曲线线性关系良好,相关系数(R2)为0.998 8,可检测到7.5×103copies/μL的病毒核酸,与其他禽源病毒不发生交叉反应,重复性试验变异系数小于3%。说明该方法敏感性高、特异性强、重复性好,可用于IBV的定量检测。     

鸡传染性支气管炎病毒Real-Time PCR检测方法的建立

本试验针对肾型鸡传染性支气管炎病毒(IBV-QX)保守基因N基因设计并合成引物,构建了阳性质粒标准品;经过不断优化建立了检测IBV-QX SYBR GreenⅠReal-Time PCR标准曲线。结果显示,本次所建立的检测方法重复性好,特异性高,最低可检测到39.7copies/μl的病毒核酸,对常见禽源病毒无交叉反应。本次建立的方法不仅可以用于各基因型IBV病原检测,也可用于病毒的定量研究。因此,本实验室所建立的IBV检测方法在鸡传染性支气管炎病毒的快速检测上具有重要意义。     

基于鸽新城疫病毒M基因实时定量PCR检测方法的建立

研究通过比对鸽源和鸡源新城疫病毒M基因的序列,找到其差异位点并在保守区设计引物和TaqMan探针,建立了一种可以特异性检测鸽新城疫病毒的实时荧光定量PCR方法。以鸽新城疫病毒M基因阳性质粒为模板制作标准曲线并对检测方法的指标进行系统评价。结果显示,该方法的标准曲线为方程为:y=-3.334logX+37.837,相关系数R2=0.992;重组质粒标准品检测下限为1×101 copies/μL,比普通PCR灵敏100倍;特异性试验显示,该方法与鸡新城疫病毒不同毒株及其他常见禽类病毒无交叉反应;重复性试验的组间及组内的变异系数均小于2%,说明本研究建立的实时定量PCR检测方法敏感性高、特异性强、重复性好,可应用于鸽新城疫病毒的早期检测,为鸽新城疫病毒的防控提供了技术支持。     

野生型非洲猪瘟病毒多重数字PCR方法的建立

为建立一种鉴别诊断野生株和基因缺失株非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)的方法,针对ASFV的B646L、EP402R、DP96R基因保守序列设计3套引物和探针,优化三重荧光定量PCR体系作为基础建立微滴式数字PCR(droplet digital PCR,dd PCR)检测方法,并对方法的特异性、灵敏性及重复性进行评估。结果显示,优化后的多重荧光定量PCR检测方法的标准曲线线性关系良好,对PRRSV、PEDV、PRV、VSV、PCV、RNase-free水、重组质粒标准品进行特异性检测,特异性良好;重复性试验结果显示,变异系数均小于2%;对3种重组质粒的最低检测下限均为10² copies/μL。参照上述多重荧光定量PCR方法优化后的条件,进行多重ddPCR检测方法的建立,并且对该方法进行评价。结果显示,ddPCR检测方法标准曲线的线性关系良好;特异性及重复性良好;最低检测下限B646L为11.6 copies/μL、EP402R为13.3 copies/μL、DP96R为16.9 copies/μL;ddPCR的检测灵...     

应用非洲猪瘟病毒基因质粒标准物质评价荧光PCR试剂盒及核酸提取方法

为评价不同检测试剂盒对非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)的检测性能，以及不同提取方法对ASFV核酸的提取效率，本研究以国家标准物质“ASFV B646L基因质粒标准物质”作为模拟样品，通过荧光定量PCR检测，比较扩增曲线、Ct值等指标，分析了4个厂家的5种试剂盒的敏感性、重复性及反应耗时等检测性能，同时比较了磁珠法与柱式法等2种核酸提取方法的提取效率。结果显示：5种试剂盒均能有效检测出不同浓度的ASFV B646L基因质粒标准物质，不同的试剂盒最低检测限不同，最低的试剂盒为5.8×10^-1 copies/μL,线性关系最优的试剂盒R~2=0.997,各试剂盒实际反应时间与理论时间均有差异。2种提取方法均可有效提取ASFV B646L基因质粒标准物质，其中柱式法的提取效率高于磁珠法，但柱式法的离散度大于磁珠法。综上，4个厂家的5种试剂盒及柱式法与磁珠法均可使用ASFV B646L标准物质作为基准进行试剂盒性能及提取效率评价。在实际检测中，应根据具体情况选择合适的检测试剂盒及核酸提取方法。     

基于牛呼吸道合胞体病毒F基因TB Green Ⅱ荧光定量PCR检测方法的建立

为了对牛呼吸道合胞体病毒(bovine respiratory syncytial virus, BRSV)进行准确定量检测，针对BRSV F基因设计特异性引物，构建pMD19T-BRSV-gF重组质粒，以其为模板优化反应条件及反应体系，建立TB GreenⅡ荧光定量PCR方法并应用于临床BRSV检测。结果显示，针对BRSV F基因建立的TB GreenⅡ荧光定量PCR方法标准曲线线性关系良好，相关系数为0.995 2;灵敏度高，BRSV最低检测限达3.9×10¹ copies/μL;特异性良好，可特异性检测出BRSV,对牛传染性鼻气管炎病毒和牛病毒性腹泻病毒的扩增呈阴性；重复性好，批内和批间重复性试验变异系数均小于2%。对50份临床样品进行检测，荧光定量PCR对BRSV的阳性检出率(26%)明显优于常规PCR方法(14%)。结果表明针对BRSV F基因建立的TB GreenⅡ荧光定量PCR检测方法适合BRSV的临床检测。     

三种非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒和两种核酸提取方法的比对

为评价不同荧光PCR检测试剂盒对非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）的检测效果,以及不同核酸提取方法对ASFV的提取差异,选取ASFV B646L基因标准物质作为模板参照,通过荧光PCR检测对标准曲线、最低检出限（LOD）、特异性、检测时间等进行比较,分析3个厂家商品化ASFV荧光PCR检测试剂盒（A、B、C）的综合性能;选取磁珠法和柱式法两种核酸提取方式,对标准物质核酸提取后进行ASFV荧光PCR扩增,以Ct值大小评价试剂的提取效果。结果显示：3种ASFV荧光PCR试剂盒决定系数（R2）分别为0.985、0.996、0.985,且特异性较好;3种ASFV荧光PCR试剂盒LOD介于10-1~10-2 copies/μL,A试剂盒反应循环数最多且反应时间最长（105 min）,LOD为10-2 copies/μL。全自动核酸提取工作站与手工核酸提取Ct值无统计学差异（P＞0.1）,批内变异系数（CV）在1.5%以内。结果表明：3种荧光PCR检测试剂盒的综合性能较为理想,A试剂盒更适用于临床含毒量低的样品检测;两种核酸提取方法均可有效提取ASFV B646L基因质粒标准物质。本试验为科学、合理选择ASFV检测和提取试剂提供了数据参考。     

猫疱疹病毒Ⅰ型PCR检测方法的建立与初步应用

建立猫疱疹病毒Ⅰ型(FHV-1)PCR检测方法,应用于临床样品中FHV-1的快速检测。根据猫疱疹病毒Ⅰ型的gI基因序列设计了一对特异性引物,以疑似猫疱疹病毒Ⅰ型感染猫的眼鼻分泌物总DNA为模板,建立了PCR检测方法,对所建立的方法进行特异性、敏感性和重复性验证,并对26份临床样本进行检测。结果表明,所建立的PCR诊断方法与犬细小病毒(CPV)、犬瘟热病毒(CDV)、绵羊肺炎支原体(M.ovis)、牛支原体(M.bovis)、牛疱疹病毒Ⅰ型(BHV-1)均无交叉性反应,最低检测DNA模板浓度为3.23×10~3 copies/μL。对26份临床病例进行检测,阳性率61.54%。说明建立的FHV-1PCR检测方法具有特异性强、敏感度高、方便快捷等优点,适合于临床FHV-1感染的快速检测。     

鹿流行性出血病病毒实时荧光PCR检测方法的初步建立

利用鹿流行性出血病（EHD）病毒核酸的保守靶序列（VP7）,设计引物和TaqMan荧光探针,建立了EHDV荧光定量RT-PCR技术,并进行了特异性、敏感性、重复性等实验评价。结果显示,该技术可有效检出EHD-1、EHD-2、EHD-4、EHD-7型病毒,与蓝舌病病毒（BTV）等病毒无交叉反应;对阳性模板（重组质粒）的检测灵敏度为1个copies;重复检测CV〈5%。因此,所建立的EHDV TaqMan/荧光定量RT-PCR方法可为鹿流行性出血病病毒检测提供一种快速、可靠的病原检测手段。     

C型禽偏肺病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法的建立及应用

根据GenBank发表的禽偏肺病毒(aMPV)F基因序列,设计一对特异性引物,建立C亚型aMPV的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。对该反应体系进行条件优化,建立了标准曲线,并进行特异性、敏感性及重复性试验,然后将建立的方法应用于临床样品和攻毒样品的检测。结果显示:标准曲线循环阈值与模板浓度呈现良好的线性关系;建立的方法只能检测出C亚型aMPV,最低可以检测到0.8×10~1拷贝/μL的核酸模板,重复性试验的变异系数小于4%。应用建立的方法对43份临床样品检测,结果显示均为阴性;对42份35日龄SPF鸡人工感染后1～21 d的气管和肺脏样品进行检测,结果显示攻毒样品均为阳性。因此,研究建立的特异、灵敏、重复性好的C型aMPV实时荧光定量PCR方法,既可适合于该病的早期诊断和流行病学调查,又为该病毒的致病机制研究提供技术支撑。     

猪IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ的TaqMan实时定量RT-PCR检测体系的建立

为了解猪体内细胞免疫应答机制,本研究建立猪细胞因子IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ的TaqMan实时定量RT-PCR检测体系.以五指山小型猪cDNA为模板,扩增IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ的基因保守区,构建相应的重组质粒,并将其作为标准品构建标准曲线.结果显示,各标准曲线的相关系数r值均大于0.990,扩增效率为90%～105%;该检测方法的敏感性较高,IL-4检测下限为1 copies/μL,IL-2、IL-10及IFN-γ检测下限达为102copies/μL;重复性较好,批内重复试验与批间重复试验变异系数均小于5%.本研究为病毒感染后猪体内免疫应答等研究提供方法.     

非洲猪瘟病毒、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒二重实时荧光定量PCR检测方法的建立与初步应用

建立一种特异、敏感、快速的实时荧光定量PCR(FQ-PCR)方法,用于非洲猪瘟病毒(ASFV)和高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)的鉴别诊断。针对ASFV的B646L基因和HP-PRRSV的NSP2基因分别设计特异性引物/探针对,经优化反应体系、反应程序等反应条件,建立一种基于探针技术的FQ-PCR方法,验证方法的敏感性、特异性和重复性,对130份临床样品进行检测,并与OIE检测方法(ASFV)及国标方法(HP-PRRSV)进行比较分析。本研究成功建立的ASFV和HP-PRRSV二重FQ-PCR检测方法在10^-1～10⁵ copies/μL模板范围内有良好的线性关系;对ASFV和HP-PRRSV基因出现阳性扩增,但对猪日本乙型脑炎病毒(JEV)、猪瘟(CSFV)、猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)美洲经典株(VR2332株)、健康猪脾脏等7种病原核酸样品对照未出现扩增;批内、批间试验变异系数在0.53%～3.14%,重复性良好;对ASFV和HP-PR...     

鉴别猪圆环病毒2型和3型双重TaqMan MGB探针FQ-PCR检测方法研究

建立一种快速、特异鉴别检测猪圆环病毒2型(PCV2)和猪圆环病毒3型(PCV3)的双重TaqMan MGB探针FQ-PCR方法,本研究以PCV2的Rep蛋白和PCV3的Cap蛋白基因作为靶基因,各设计1对特异性引物和1条TaqMan MGB探针,经优化各反应条件和进行敏感性、特异性、重复性和干扰性试验,建立鉴别检测PCV2/PCV3的双重FQ-PCR方法。结果显示：该方法可特异性扩增PCV2、PCV3核酸,与猪伪狂犬病病毒(PRV)等8种病原及阴性对照无交叉反应,特异性较强;对PCV2和PCV3阳性质粒标准品的最低检出限均可达10 copies/μL,敏感性较高;PCV2/PCV3批内/批间重复试验变异系数(CV)值均在3%以下,表明方法稳定性、重复性较好;干扰性试验表明在两种病毒阳性质粒起始模板相差较大时该方法不会影响对其中任一病毒核酸的检出和准确定量。对42份临床疑似PCV感染样品检测结果与PCV2 、PCV3基因测序结果符合率100%。本研究建立的双重FQ-PCR方法具有敏感性高达10 copies/μL、特异性强、在同一反应体系中能同时快速鉴别检测PCV2、PCV3等优点,可用...     

猪星状病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立与初步应用

本研究旨在建立一种能够快速、简便、灵敏地检测猪星状病毒的基于SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。根据已报道的猪星状病毒ORF2基因序列,设计并合成1对引物,通过PCR扩增ORF2基因片段,将测序正确的ORF2基因片段克隆入pMD18-T载体,转化大肠杆菌DH5α,经测序鉴定后得到阳性重组质粒,作为标准品模板建立SYBR GreenⅠ荧光定量PCR标准曲线和熔解曲线,并对其灵敏性、特异性和重复性进行验证。结果表明,猪星状病毒荧光定量PCR的标准曲线Ct值与模板浓度呈良好的线性关系,熔解曲线特异,灵敏度可达1×101拷贝,是普通PCR检测方法的100倍,特异性和重复性较好。本次建立的猪星状病毒荧光定量PCR检测方法具有快速、简便、敏感等优点,有重要的实用价值。     

基于胞内劳森菌16S rDNA基因的TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立与应用

参考GenBank发表的胞内劳森菌(Lawsonia intracellularis,L.intracellularis)基因组16SrDNA序列,设计1对特异性引物和1条TaqMan探针,以L.intracellularis疫苗核酸为模板,建立L.intracellularis TaqMan实时荧光定量PCR检测方法。对该检测法制作了标准曲线,并进行了特异性、敏感性和重复性试验,并将其应用于猪增生性肠炎诊断。结果表明,所建立的TaqMan实时荧光定量方法特异性强,仅对含有L.intracellularis扩增出S型荧光曲线,而对大肠杆菌、沙门菌、金黄色葡萄球菌、副猪嗜血杆菌等均无扩增;该方法在1.2×102¹.2×108 copies/μL有良好的线性关系,相关系数为0.972;最低检测浓度为10copies/μL,重复性良好。对79份临床样品检测表明,该方法灵敏度高于普通PCR方法,可用于猪增生性肠炎的临床诊断。     

马疱疹病毒8型TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立

为了建立一种能够快速检测马疱疹病毒8型(EHV-8)的方法，本试验以EHV-8的全基因组序列为模板，针对糖蛋白B(gB)基因的保守序列，进行对比分析，设计EHV-8的特异性引物和探针，优化反应条件，建立EHV-8 TaqMan实时荧光定量PCR检测方法，并对该方法的敏感性、特异性和重复性进行验证，使用该方法进行临床样本检测。结果显示，建立的EHV-8 TaqMan实时荧光定量PCR检测方法对EHV-8 DNA模板的最低检测限为1.1×10² copies/μL,敏感性高；EHV-8与EHV-1、EHV-4、马流产沙门氏菌和肠产毒性大肠杆菌均无交叉反应，特异性强；批内重复性试验和批间重复性试验均表明该方法重复性好。对132份临床样本的检测结果显示，阳性检出率为10.61%,基因测序正确。由此可见，本试验建立的EHV-8 TaqMan实时荧光定量PCR检测方法能够满足EHV-8的检测需求，且该方法敏感性高、特异性强、重复性好，为EHV-8的进一步研究提供了有效的辅助检测手段。     

犬圆环病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

犬圆环病毒(DogCV)是圆环病毒科新发现的圆环病毒,旨在建立犬圆环病毒实时荧光定量PCR检测方法。试验用PCR方法克隆犬圆环病毒ORF2基因保守区域,构建标准阳性质粒pClon007-ORF2。以标准阳性质粒pClon007-ORF2为模板对荧光定量PCR反应体系进行优化。结果表明,所建立的方法 Ct值与标准品在4.67×10~9 copies/μL~4.67×10~3 copies/μL范围内呈良好的线性关系,相关系数为0.998,斜率为-3.445。该方法检测灵敏度为4.67×10~1copies/μL。该方法对狂犬病病毒、犬细小病毒、犬瘟热病毒、犬副流感病毒、犬腺病毒2型等犬常见病原的检测均无交叉反应;所有稀释度标准品模板均在83.35℃出现窄的特异性熔解峰。临床样品检测表明,所建立的实时荧光定量PCR对犬圆环病毒的阳性检测率为12.50%(4/32)。     

羊口疮病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR法的建立

为建立快速、灵敏、特异的检测羊口疮病毒(ORFV)的方法,基于羊口疮病毒保守序列B2L基因合成一对用于建立SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR的特异性引物,将ORFV B2L全长基因和pMD19-T质粒载体连接,构建重组阳性质粒,以构建的重组质粒DNA作为模板,建立ORFV SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法。结果显示:所建立的ORFV SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法线性关系良好,重复性好,扩增效率高,无引物二聚体和非特异性扩增,最低检测限为2.13×101copies/μL,比普通PCR高出1 000倍,该方法对绵羊羊痘病毒和山羊痘病毒的核酸cDNA不检出,特异性好;对180份山羊全血样本进行ORFV检测,结果得出常规PCR阳性检出率为2.8%(5/180),荧光定量PCR阳性检出率为4.4%(8/180)。试验表明,本次建立的ORFV SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法特异性强、敏感度高、重复性好,适用于羊口疮病毒临床样本的检测。