基于线粒体COI基因序列的5种鲤养殖品种遗传多样性研究

本研究通过对5个鲤养殖品种即高寒鲤(Cyprinus carpio Frigid carp)、松浦鲤(Cyprinus carpio Songpu carp)、蓝鳞鲤(Cyprinus carpio blue var)、松浦镜鲤(Cyprinus carpio Songpu mirror carp)和红镜鲤(Cyprinus carpio Red mirror carp)的线粒体COI基因部分序列的测定, 比较并分析了其遗传多样性和系统进化关系。在5个鲤品种共100个样本的线粒体COI序列中检测到8种单倍型, 其中5个单倍型(H1、H2、H4、H5、H6)涵盖样本较多, 占总样本数的94.06%。蓝鳞鲤的单倍型数最少, 仅有1个, 红镜鲤单倍型数为2个, 其余3个品种的单倍型数均为5个。5个品种单倍型多样性(H_d)在0.160±0.070~0.811±0.055, 其中, 遗传多样性最高的为高寒鲤。AMOVA结果表明, 品种间变异(50.28%)略高于品种内变异(49.72%), 各品种间的F_ST值在0.711 4~0.831 2, 其中蓝鳞鲤与其他群体之间差异最大。用MEGA4.0软件构建的基于遗传距离的进化树表明, 5个养殖品种中, 高寒鲤和红镜鲤的遗传距离最近(D=0.31), 聚为一支; 松浦镜鲤和松浦鲤的遗传距离较近(D=0.33), 聚为一支; 蓝鳞鲤与其他品种存在较大遗传差异, 单独形成一个分支。除蓝鳞鲤外, 其余4个养殖品种间均存在共享的单倍型(H2、H4、H5、H6), 可能是由于其在选育过程中亲本的遗传背景存在交叉, 同时也证明DNA条码在分析种内品种间遗传关系时具有可行性但具有一定的局限性。

     

盐度胁迫下三疣梭子蟹Ferritin基因的原核表达

为验证Ferritin基因是否对三疣梭子蟹的盐度胁迫具有适应性, 利用PCR扩增获得了三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)第六对鳃的Ferritin基因, 将该目的基因克隆到表达载体pET28a(+)中, 转化大肠杆菌DE3(BL21), 并进行IPTG诱导表达。结果表明: 经诱导的转pET28-Ferritin重组质粒菌株有特异的表达蛋白条带出现, 与预期的理论值(19.448 kD)相符合; 高盐胁迫下, 转重组质粒的大肠杆菌比转pET28空载质粒存活率显著提高(P< 0.001), 并且随盐度升高, 两者差异越显著。这表明Ferritin基因能够提高大肠杆菌的盐度耐受力, 由此推测Ferritin基因参与了三疣梭子蟹盐度适应的生理过程。本研究旨在为生产过程中三疣梭子蟹养殖水体的盐度调控策略提供理论依据。

     

杜仲对凡纳滨对虾生长、血清非特异性免疫和肌肉成分的影响

在基础饲料中分别添加0.0%(对照组)、0.5%、1.0%、2.0%和3.0%的杜仲(Eucommia ulmoides), 饲喂体质量为(7.5±0.2) g的凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei), 实验共分5个处理组, 每处理组4个重复, 每重复40尾虾。经过42 d养殖, 各处理组均有较高的存活率, 且无显著差异(P>0.05); 2.0%杜仲组的虾体增重率最高(136.1%), 饲料系数最低(1.33), 较对照组提高增重率9.8%(P<0.05), 降低饲料系数0.13(P<0.05); 饲料中添加0.5%、1.0%杜仲, 显著提高了对虾血清LSZ、PO活性, 添加1.0%杜仲, 显著降低了血清MDA含量, 提高了肝胰腺蛋白酶活性(P<0.05); 攻毒实验结果表明, 以溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)肌肉注射虾体后96 h, 0.5%、1.0%、2.0%杜仲组的虾体死亡率均较对照组显著降低(P<0.05); 在肌肉成分方面, 添加2.0%、3.0%杜仲显著提高了肌肉胶原蛋白含量, 各处理在肌肉水分、灰分、粗蛋白、粗脂肪含量方面没有显著差异。上述研究表明, 在凡纳滨对虾饲料中添加杜仲2.0%, 可显著改善生产性能, 提高肌肉胶原蛋白含量; 在饲料中添加杜仲0.5%～1.0%, 可提高凡纳滨对虾非特异性免疫能力。本研究旨在考察杜仲对凡纳滨对虾生长、血清非特异性免疫和肌肉成分的影响, 为杜仲在对虾饲料中的合理应用提供科学依据。

     

半滑舌鳎Dmrt1蛋白表达、纯化及功能

通过分析半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis) Dmrt1重组蛋白注射卵巢后基因表达调控, 探讨Dmrt1在半滑舌鳎性别决定与分化中的功能。实验利用原核表达系统(Pet-32a)对半滑舌鳎Dmrt1基因进行重组表达, 并通过亲和层析纯化获得了重组目的蛋白(Pet-32-dmrt1)。重组蛋白注射卵巢后实时定量PCR分析结果显示, Cyp19a和Foxl2在6～24 h内两基因表达量均显著下调, Sox9a基因表达量在6～24 h内有显著上调, 但48 h后3个基因的表达量逐渐恢复正常表达水平。研究结果证实, Dmrt1重组蛋白具有生物活性, 且对性别相关基因表达调控具有一定的影响, 在性别决定中发挥一定作用。

     

瓯江彩鲤体色相关基因Sox10的分离与表达分析

为探明鱼类体色变异的相关调控因子, 采用RT-PCR及RACE技术获得总长度为2 830 bp的瓯江彩鲤(Cyprinus carpio var. color) Sox10基因cDNA序列。该基因序列的5′和3′非编码区分别为9 bp和1 375 bp, 开放阅读框1 446 bp, 编码481个氨基酸。氨基酸序列的系统发育分析表明, 瓯江彩鲤Sox10基因的氨基酸序列与部分物种的相似性在59%~94%。RT-PCR分析表明, 该基因在瓯江彩鲤皮肤、肌肉、眼睛和鳔表达量最高, 鳃和心表达量次之, 肾和肝没有表达。荧光定量PCR分析显示, Sox10基因在体色类型为白色(“粉玉”体色)的表达量显著地高于其他体色(P<0.05), “粉花”黑色皮肤中的表达量最低, 显著低其他体色类型(P<0.05), 而其他体色类型的表达差异不显著(P＞0.05)。结果发现, Sox10基因在瓯江彩鲤的体色变异中发挥着调控作用。

     

半滑舌鳎 WT1a 基因的克隆与性别分化期的表达分析

从半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)全基因组序列中获得肿瘤抑制基因 WT1a 的部分序列, 然后利用 RACE 技术克隆了WT1a 基因的全长, 运用组织学方法, 对半滑舌鳎性腺分化早期的组织切片进行了观察, 并分析了该阶段WT1a 的表达特征。克隆结果显示, WT1a 基因cDNA全长为1 886 bp, 开放阅读框(ORF)长为1 470 bp, 编码490个氨基酸, 并且包含 KTS 三肽, 5′-UTR 和3′-UTR 分别长为245 bp 和171 bp。在 ORF 末端发现2个微卫星(SSR)序列和2个跨膜螺旋区域, 而在其他物种中未发现这些区域。氨基酸序列分析显示, WT1a 基因的保守性很高, 与人的同源性高达90%。通过组织切片观察发现, 该批半滑舌鳎在56 d时性腺开始分化, 并且卵巢分化早于精巢。荧光实时定量分析结果显示, WT1a 在半滑舌鳎成鱼性腺中表达量显著高于其他各组织, 在肝、肾、脾、心脏等组织中有微量表达, 并且在成鱼性腺中, 雄鱼表达量显著高于雌鱼, 雌鱼显著高于伪雄鱼。在胚胎发育各时期以及初出膜后WT1a的表达结果显示, 在12 h (原肠早期)显著升高, 20 h (神经胚期)达到最高。在性腺分化早期雌雄性腺中的表达结果显示, WT1a 在雌雄半滑舌鳎16~66 d 的性腺中表达量持续平稳升高, 在性腺分化时期表达量并没有特殊的变化。这些研究结果说明, WT1a 基因是半滑舌鳎性别相关基因, 并在半滑舌鳎的性腺分化、发育过程中持续表达, 但可能对性腺的分化过程并不起决定作用。

     

丁酸钠对鲫鱼生长和肠细胞增殖的影响

以初始体质量(6.02±0.16) g的鲫鱼(Carassius auratus)为研究对象, 在鲫鱼基础饲料中分别添加0.0 g/kg、1.0 g/kg、2.5 g/kg、5.0 g/kg、7.5 g/kg的包膜丁酸钠, 配制5种等氮等能的实验饲料, 研究不同浓度包膜丁酸钠通过促进鲫鱼肠细胞增殖对其生长作用的影响。实验在室内养殖系统中进行, 每水族缸饲喂30尾, 每处理组3个重复, 以鱼体质量3%~5%投喂量, 日投喂3次, 试验持续7周。实验结果表明: 在饲料中添加丁酸钠对鲫鱼有明显的促生长作用, 显著提高了鲫鱼前肠绒毛高度/隐窝深度的比值以及肠道细胞增殖因子CREB和CDX2基因的表达。当丁酸钠添加量为2.5 g/kg时, 鲫鱼增重率、特定生长率、蛋白质效率和肥满度最高, 显著高于对照组(P<0.05), 比对照组分别提高了25.76%、16.46%、28.91%和8.37%; 与对照组相比, 丁酸钠添加量达到2.5 g/kg时, 鲫鱼干物质与蛋白质表观消化率、前肠绒毛高度、肠道CREB基因和CDX2基因的相对表达量显著升高, 分别比对照组提高8.36%、6.21%、34.22%、51.11%和42.13%(P<0.05)。上述研究表明饲料中添加适量的丁酸钠可能通过显著提高鲫鱼肠绒毛高度和肠道细胞增殖因子CREB和CDX2基因的表达量, 从而促进其生长, 适宜添加量为2.5 g/kg。

     

重组激活基因(RAGs)功能机制及其在鱼类早期发育中的作用

在B淋巴细胞和T淋巴细胞的发育过程中, BCR和TCR基因座(Igκ、Igλ、Igh、Tcrα、Tcrβ、Tcrγ、Tcrδ)的可变区(V)、多样区(D)、链接区(J)发生V(D)J重排, 该重排过程是在重组激活蛋白(RAG-1和RAG-2)的作用下完成的, V(D)J重排机制使机体拥有庞大的抗体库, 以应对自然界中多元的病原微生物。RAGs结构分为核心区和非核心区, 核心区域发挥着重要的基因片段酶切功能, 而非核心区域的九聚体序列(nonamer)、锌指等结构具有调节V(D)J重排的功能。RAGs的功能在转录水平、染色体水平以及蛋白水平受到严格的时间和空间调控, 以保证B/T细胞的正常发育。随着国内外学者对哺乳动物RAGs基因的结构与功能机制的深入研究, RAGs也在淡水鱼和海水鱼中有了越来越多的报道。由于RAGs的功能特点以及在进化过程中的稳定性, 其已成为研究鱼类免疫系统发育过程和系统进化的重要分子标记。本文在赤点石斑鱼 (Epinephelus akaara) RAGs研究的基础上探讨了RAGs定位鱼类免疫系统的发生过程, 旨在为鱼类人工繁殖技术的突破、鱼类疫苗的开发与研制以及鱼类免疫学研究等提供理论借鉴。

     

IGF-I及其受体基因在牙鲆胚胎发育过程中的表达图式

胰岛素样生长因子-I(insulin-like growth factor I, IGF-I)是脊椎动物生长发育的重要调控因子, 其生物学功能主要通过与其特异的膜受体(IGF-I receptor, IGF-IR)结合而调节。因此, IGF-I及其受体表达特征的分析对于阐述IGF系统调控的发育过程具有重要的意义。本研究采用荧光实时PCR方法, 以不同发育时期的牙鲆(Paralichthys olivaceus)胚胎为材料, 分析了胰岛素样生长因子-I(IGF-I)及其两种受体基因在鱼类胚胎发育过程中的表达图式。结果显示, 牙鲆IGF-I、IGF-IR-1和IGF-IR-2基因均有母源转录本, 且各基因的表达在胚胎发育的不同阶段具有明显的发育性变化。IGF-I 基因在早期胚胎发育阶段仅有少量的mRNA存在, 而合子基因的表达在晶体出现至出膜前阶段逐步增加。两种IGF-I 受体基因则展现出迥然不同的表达时序。IGF-IR-1 基因在受精卵、卵裂及囊胚期的早期胚胎发育中有相对较少的转录本, 至原肠期其合子基因强烈表达, 且在神经胚、晶体出现、心跳和出膜前各阶段均有高量的表达; 相反, IGF-IR-2 基因在受精卵至原肠期的早期胚胎中有丰富的转录本, 但合子基因的表达在后期胚胎形成中却相对降低, 暗示了二者可能在调节牙鲆胚胎发育中起着不同的作用。

     

秦岭细鳞鲑的年龄与生长

 2009—2012年于陕西省陇县秦岭细鳞鲑(Brachymystax lenok tsinlingensis)国家级自然保护区内采集秦岭细鳞鲑样本397尾。以鳞片为年龄鉴定材料, 显微镜下观察发现, 秦岭细鳞鲑鳞片上的年轮特征主要表现为普通切割形; 研究样本的年龄共分为5个年龄组, 其中以1～3龄为主, 约占85.64%; 体长(L, mm)和鳞径(R, mm)具有显著的相关性(L= -5.83R² + 208.06R + 34.99, r²=0.88); Von Bertalanffy生长方程分别为: L_t=729.38[1-e^-0.08(t+0.5)], W_t=        6 288.74·[1-e^-0.08(t+0.5)]^{2.968 1}, 雌雄个体的生长速率无显著差异; 生长系数为0.08, 拐点年龄为13.10 龄, 对应的的体长和体质量分别为483.66 mm和1 857.86 g。结论认为, 秦岭细鳞属生长缓慢型鱼类, 在所调查的保护区中秦岭细鳞鲑显现出个体小型化趋势。在制定资源保护策略时, 应考虑采取人工增殖放流措施来扩大自然种群数量, 增强种群的自然调节能力, 恢复种群数量。本研究旨在了解秦岭细鳞鲑的生长规律, 为秦岭细鳞鲑的资源保护与合理利用提供理论指导。

     

浒苔对刺参幼参生长影响的初步研究

对浒苔(Entero­morpha prolifera)的一般营养成分、氨基酸及脂肪酸含量进行测定, 并以浒苔为原料投喂体质量(5.26±0.14) g的刺参(Apostichopus japonicas Selenka)幼参, 与幼参常用饵料如鼠尾藻(Sargassum thunbergii)、马尾藻(Sargassum muticum)、海带(Laminaria japonica)进行效果对比。营养成分检测结果显示, 浒苔蛋白质含量为15.7%, 其中含量较高的氨基酸有天门冬氨酸、谷氨酸、丙氨酸、亮氨酸等; 脂肪含量低(1%), 多不饱和脂肪酸比例较高(0.24%); 浒苔中各重金属(无机砷、镉、铅、甲基汞)含量均低于国家相关限量标准。以4种海藻为饵料投喂幼参70 d后, 各组刺参幼参生长良好, 成活率无明显差异(P>0.05), 幼参体质量均显著增长(P<0.05); 各组刺参的特定生长率(SGR)由高到低依次为鼠尾藻组、浒苔组、马尾藻组、海带组; 摄食率(IR)由高到低依次为海带、马尾藻、浒苔、鼠尾藻, 饵料转化率(FE)由高到低依次为鼠尾藻组、浒苔组、马尾藻组、海带组。浒苔、鼠尾藻、马尾藻3个投喂组刺参幼参特定生长(SGR)无显著差异(P>0.05), 但显著高于海带组(P<0.05)。本研究说明, 浒苔蛋白含量高、脂肪含量低, 可全部或部分替代鼠尾藻添加到幼参饵料。

     

中国胭脂鱼的细胞遗传学分析

采用植物血凝素、秋水仙素活体注射和肾细胞直接制片法分析了中国胭脂鱼(Myxiocyprinus asiaticus)的染色体核型和Ag-NORs显带;并以中国胭脂鱼血细胞为样本,鸡血细胞DNA含量为标准(2.50 pg),用流式细胞仪测定了中国胭脂鱼的 DNA 含量.结果表明:(1)中国胭脂鱼染色体数目2n=100,核型公式为10 m+4 sm+12 st+74 t, NF=114,未观察到次缢痕及随体,亦未发现有性染色体.(2)中国胭脂鱼染色体具有1对Ag-NORs,位于第1对染色体短臂上,间期核中Ag-NORs的数目为1~2个,未见Ag-NORs的联合现象.(3)PI和DAPI作为荧光染料,得出中国胭脂鱼DNA含量分别为5.50±0.24 pg和6.16±0.03 pg.(4)中国胭脂鱼为四倍体,在特定的分类阶元中属于较原始的鱼类.     

蝇蛆粉替代鱼粉对黄颡鱼肌肉品质的影响

选用初始体质量约2.02 g的黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)960尾,随机分为6组,分别投喂6种用蝇蛆粉替代饲料中0%、20%、40%、60%、80%、100%鱼粉配制的等氮(39.5%)等能(16.8 MJ/kg)饲料,分别记为G0、G20、G40、G60、G80和G100。养殖期为60 d。结果显示,黄颡鱼肌肉水分、粗蛋白质、粗脂肪含量受蝇蛆粉替代鱼粉水平的影响不显著(P>0.05),但G60～G100灰分含量与G0相比显著升高(P<0.05)。蝇蛆粉替代鱼粉对肌肉pH、滴水损失(DL)、蒸煮损失(CL)和超氧化物歧化酶(SOD)活性影响不显著(P>0.05)。与G0相比,G20～G100肌肉胶原蛋白含量差异不显著(P>0.05),G40～G60肌肉丙二醛(MDA)含量显著降低(P<0.05)。与G0相比,G80肌肉精氨酸(Arg)、组氨酸(His)、苯丙氨酸(Phe)、必需氨基酸(TEAA)含量显著高(P<0.05),各替代组总氨基酸含量差异不显著(P>0.05)。各组肌肉谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)、天冬氨酸(Asp)等风味氨基酸和总风味氨基酸(TFAA)含量差异不显著(P>0.05)。肌肉C14:0、C18:3n-3、DHA、EPA+DHA、多不饱和脂肪酸(PUFA)、n-3 PUFA含量和n-3/n-6比值随蝇蛆粉替代鱼粉水平的升高而降低,其中G60～G100显著低于G0(P<0.05);C16:1、单不饱和脂肪酸(MUFA)含量随替代水平增加而升高,其中G60和G100显著升高(P<0.05)。结果表明,当蝇蛆粉替代鱼粉水平不超过40%时,除MDA含量显著降低外,蝇蛆粉对黄颡鱼肌肉常规成分、理化指标、氨基酸和脂肪酸含量影响不显著。     

半滑舌鳎Dmrt4基因DNA全序列的克隆与表达分析

克隆了半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)Dmrt4基因DNA全序列,得到的序列长度为2271 bp,包含1个内含子,2个外显子,与其他鱼类的同源性在90%以上.Dmrt4基因在雌性和雄性半滑舌鳎的7个组织中都有表达,有差异表达的组织是脑、垂体和性腺,雄性的表达显著高于雌性(P<0.05).高温处理组的伪雄鱼中Dmrt4基因的表达与对照组的雌鱼没有显著差异(P>0.05),但是甲基睾酮处理组的雄鱼和伪雄鱼的表达显著高于对照组的雌鱼和雄鱼(P<0.05).Dmrt4基因的表达在胚胎发育过程中呈现先升高后降低的趋势,在原肠期表达量最高,显著高于其他几个时期(P<0.05),从尾芽形成期开始恢复到多细胞期的表达水平,之后几个时期 Dmrt4基因的表达无显著变化(P>0.05),一直到出膜前保持恒定.研究表明, Dmrt4基因是雄性中优势表达的基因,并且受雄性基激素调节,但并不是性反转的必要因素.这一研究为半滑舌鳎全雌群体的建立提供了分子水平的研究基础.     

Foxl2基因在栉孔扇贝发育过程中的表达图式

Foxl2基因在哺乳动物中是雌性相关基因,参与卵巢发育和功能维持。本研究利用荧光定量PCR和原位杂交技术,对栉孔扇贝(Chlamys farreri)foxl2(Cf-foxl2)在发育过程中的表达图式进行了分析。研究发现Cf-foxl2在受精卵中呈低水平表达,随着发育进行表达量增高,D形幼虫期表达量最高,之后表达量迅速下降。原位杂交结果显示Cf-foxl2表达量在担轮幼虫之前在体内均匀分布;强阳性信号在担轮幼虫口凹附近呈对称分布;至D形幼虫期强阳性信号主要集中在内脏团和外套膜边缘处;之后信号消失,直到性别分化后在卵巢中再次出现。本实验结果暗示Cf-foxl2与卵巢发育相关,鉴于该基因在发育早期的持续性表达特征,暗示其可能参与栉孔扇贝的早期发育过程。     

饲料中赖氨酸水平对克氏原螯虾生长、体组成与消化酶活性的影响

克氏原螯虾(Procambarus clarkii)购自盱眙某龙虾养殖场,初始体质量为(7.60±0.01)g。以酪蛋白、明胶、小麦面筋粉和晶体氨基酸为蛋白源配制7组蛋白质水平为28.26%、能量为17.15 kJ.g 1的等氮等能半纯和饲料,各组赖氨酸质量分数分别为0.76%、1.00%、1.22%、1.47%、1.69%、1.89%和2.18%。实验虾分为7组,每组设4个重复,每个重复12尾虾,分别投喂以上7种饲料。养殖实验于室外网箱(规格为60 cm×60 cm×60 cm)中进行,饲养周期为60 d。结果表明,随着饲料中赖氨酸水平的升高,增重率、特定生长率和饲料效率均显著升高(P<0.05),分别在赖氨酸水平1.69%、1.69%和1.22%组时,三者达到最大值;当赖氨酸水平进一步升高,三者均呈下降趋势。各组的成活率为89.58%~97.92%,组间无显著差异(P>0.05)。全虾水分含量以赖氨酸水平1.22%组最低,显著低于0.76%组(P<0.05)。全虾粗蛋白和粗脂肪含量分别以赖氨酸水平1.89%组和1.69%组最高,均显著高于0.76%组(P<0.05)。各组之间的全虾灰分含量、肌肉组成、肌肉氨基酸组成和消化酶活性均无显著差异(P>0.05)。以增重率为评价指标进行一元二次回归分析,得出克氏原螯虾的适宜赖氨酸需求量为1.66%,占饲料蛋白的5.87%。本研究旨在通过确定克氏原螯虾对饲料中赖氨酸的适宜需求量,为其人工配合饲料的研制提供基础数据和理论依据。     

杀鲑气单胞菌对大西洋鲑游泳行为和血细胞数量的影响

为探讨利用鱼类行为及血细胞数量变化预警杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)病害发生的可行性,监测了生产中感染杀鲑气单胞菌的大西洋鲑(Salmo salar L.)的游泳行为,以及杀鲑气单胞菌攻毒后大西洋鲑血细胞数量的变化。实验采用同一养殖基地和同一批次的大西洋鲑,其中现场实验鱼选自生产车间健康的和感染杀鲑气单胞菌的养殖鱼,攻毒实验中处理组实验鱼每尾背肌注射100μL、浓度为3.05×107CFU/m L的菌液,对照组注射等体积灭菌生理盐水。现场实验表明,感染杀鲑气单胞菌的大西洋鲑临界游泳速度较健康鱼低26.7%(P0.05),摆尾频率与游泳速度的线性回归方程的斜率也存在显著差异(P0.05)。攻毒实验表明,从攻毒的第4天开始,处理组大西洋鲑白细胞、淋巴细胞、单核细胞和粒细胞数量较对照组均发生显著变化,其中第6天的变化最为显著,白细胞总数、粒细胞数分别降低了2.8%和43.9%(P0.05),淋巴细胞数及单核细胞数分别升高了63.3%和23.9%(P0.05),且处理组4种血细胞数随时间呈现显著的线性变化(P0.05)。研究结果表明通过监测大西洋鲑游泳行为(临界游泳速度和摆尾频率)以及血细胞相关指标的变化可快速判断其健康状况,为病害的早期预警提供依据。