半滑舌鳎Dmrt3基因cDNA片段的克隆与表达分析

同源克隆了半滑舌鳎Dmrt3基因的部分cDNA片段,片段长度为228 bp,NJ系统发育树显示,半滑舌鳎Dmrt3基因cDNA片段与红鳍东方鲀、青鳉以及斑马鱼的Dmrt3基因cDNA片段同源性最高,首先聚为一支。实时定量分析了Dmrt3基因在半滑舌鳎雌性和雄性个体的各组织中的表达情况,以及在高温处理和甲基睾酮处理组的雌性、雄性和伪雄鱼的性腺组织中的表达。Dmrt3基因在雌性和雄性的脑、垂体、性腺、肝脏、脾脏、心脏、肾脏7个组织中都有表达,但是表达量有差异,在精巢中的相对表达量高,Dmrt3基因在精巢的表达与其它组织中的表达差异极显著(P<0.01),而在卵巢中的表达很微弱,结果预示Dmrt3基因可能在雄性的性腺发育过程中起着重要的作用。高温处理组的雌性、雄性和伪雄鱼的性腺组织之间Dmrt3的表达无显著差异(P>0.05),但都极显著低于对照组的雄鱼(P<0.01)。高温处理组的伪雄鱼与对照组雌鱼性腺中Dmrt3的表达表达无显著差异(P>0.05)。甲基睾酮处理组的雄鱼和伪雄鱼性腺中Dmrt3的表达都显著高于对照组雄性(P<0.01)。从孵化后43 d到5月龄,Dmrt3的相对表达量很低,7月龄时表达量显著升高,9月龄时达到最高峰,12月龄时表达量下降,这也预示Dmrt3基因在半滑舌鳎性腺的发育过程中起重要作用,可能是促进生殖细胞发育的重要转录因子。     

半滑舌鳎Shh基因的克隆与表达及甲基化分析

通过RACE方法获得半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)Hh基因家族的Shh基因,该基因全长1 922 bp,其中5′UTR 266 bp,3′UTR 360 bp,ORF1 296 bp,编码431个氨基酸,经预测该多肽的相对分子质量为47.28 k D,理论等电点6.95,具有Hh基因家族特有的保守结构域。氨基酸序列分析表明,半滑舌鳎Shh与牙鲆的同源性最高,为82%,与其他鱼类同源性为74%~81%,与非洲爪蟾的同源性为61%,与人和鼠的同源性为63%~64%。甲基化结果显示,Shh基因在1龄卵巢中的甲基化程度普遍低于雄鱼与伪雄鱼精巢。基因表达分析显示,Shh基因在胚胎期的囊胚期表达显著高于其它时期(P0.05),在雌雄成鱼8个组织器官均表达,在雌性性腺分化的关键期孵化后50 d,雌性性腺中表达量较前期升高,且显著高于同时期雄性性腺中的表达(P0.05),在雄性性腺分化的关键期80~95 d,Shh基因在雄性中的表达水平显著升高(P0.05),在8月龄、1龄及2龄雌鱼性腺中表达显著高于雄鱼与伪雄鱼。本研究表明,半滑舌鳎Shh基因在进化中高度保守,与胚胎分化、组织器官形成、雌雄性腺分化及性腺发育密切相关。     

半滑舌鳎养殖群体中自然性逆转伪雄鱼的发现

利用雌性特异标记遗传性别鉴定技术,对71尾4龄半滑舌鳎的生理和遗传性别进行鉴定,结果显示32尾生理型雌鱼均能扩增出205bp的雌性特异条带;39尾生理型雄鱼,仅一尾鱼体重显著高于其他雄鱼并扩增出了雌性特异条带,因此这尾鱼遗传上为雌性,是一尾伪雄鱼。对养殖的600尾半滑舌鳎生理雄鱼大规模检测发现,养殖群体自然性逆转伪雄鱼比例为1.66%。对正常雌、雄鱼和1龄自然性逆转伪雄鱼的性腺组织学观察显示,与正常雄鱼相比,伪雄鱼性腺中也有大量的精母细胞,但数量比正常雄鱼的要略少;且未在伪雄鱼的性腺组织中观察到卵母细胞,说明半滑舌鳎性逆转发生在性腺分化期。半滑舌鳎自然性逆转现象的发现有助于解释当前半滑舌鳎养殖群体中雄性率偏高的现象,为半滑舌鳎全雌苗种生产提供了一条新的技术途径,并丰富了鱼类性别分化理论。     

半滑舌鳎养殖群体的性比与雌雄形态差异比较

为研究半滑舌鳎养殖群体幼鱼阶段的性比变化,实验用分子标记法鉴定半滑舌鳎遗传性别,用组织切片方法鉴定表型性别,并比较了表型雌雄的生长差异。结果发现,在半滑舌鳎幼鱼阶段,在遗传性别上,雌雄所占比例约为1∶1,差异不显著(P>0.05)。在表型性别上,雌雄比例约为1∶3,差异极显著(P<0.01)。表型雄性中,由遗传性雄性和遗传上为雌性而表型上为雄性的"伪雄鱼"两部分组成。在养殖群体中,表型雌性、伪雄鱼和雄性三者的比例大致为1∶1∶2。养殖现场反映的雌性约占1/4的情况与本研究结果基本一致。本研究没有发现遗传上为雄性,而表型上为雌性的个体。在6～8月龄间,伪雄鱼的全长、体质量处于表型雌性与正常雄性之间,与两者均无显著差异。在相似全长范围内,雄鱼体高小于雌鱼,雄鱼的全长/体高的平均值为4.05,雌鱼的平均值为3.89,雄鱼的全长/体高比值显著大于雌鱼(P<0.05),此比值可以作为区分雌雄鱼苗种的参考。     

半滑舌鳎雌、雄鱼myostatin基因差异表达的初步研究

半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)生长具有明显的性别二态性,性成熟雌鱼体重显著高于雄鱼。鱼体肌肉占体重的40%~60%,肌肉生长是生长性状的核心,而myostatin (mstn)基因是肌肉生长发育的负调控因子,对成肌细胞的增殖具有抑制作用。本研究旨在探究肌肉生长发育过程中,mstn基因在半滑舌鳎雌、雄鱼的时空表达模式及其与雌、雄鱼生长差异的关系。结果显示,在所检测的1龄鱼的9个组织中,mstn在肌肉中的表达量最高。不同发育时期的肌肉组织定量结果显示,1龄和2龄雄鱼中的表达量显著高于雌鱼(P<0.05),而在选取的其他时期,雌、雄鱼之间的表达量不存在显著差异。原位杂交结果显示,mstn基因的表达位置在肌纤维边缘,即成肌细胞增殖分化的位置。本文系统研究了肌肉生长发育的负调控因子mstn在半滑舌鳎雌、雄鱼中的时空表达模式,为深入研究半滑舌鳎雌、雄鱼生长差异的原因及其机制提供了基础。     

半滑舌鳎快速生长及高雌性家系的筛选

为查明半滑舌鳎不同家系雌、雄鱼遗传和生理性别比例及其与生长速率的关系,并试图筛选出生理雌鱼比例高且生长快的家系,实验首先建立了22个半滑舌鳎家系,并进行同池养殖以比较生长性能,再选取5个正常雄鱼家系和5个伪雄鱼家系进行遗传性别和生理性别测定.结果发现,不同家系鱼苗不仅生长速度差异显著,而且雌雄比例差异也很显著.筛选出生长快速的家系2个(家系16号和61号),其相对增重率分别为0.81和0.56 g/d;筛选出生长较快的家系4个(家系21、28、57和63号),其相对增重率为0.48 ～0.53 g/d;筛选出生长速度一般的家系12个,生长慢速家系4个.所检测的5个正常雄鱼(ZZ类型)家系的遗传雌鱼比例平均为51.87％,生理雌鱼比例平均为42.94％,遗传雌鱼转化为生理雄鱼的比例平均为14.08％.相反,检测的5个伪雄鱼(ZW类型)家系的遗传雌鱼比例平均为49.34％,生理雌鱼比例平均为4.45％,遗传雌鱼转化为生理雄鱼的比例平均为91.41％.实验发现半滑舌鳎不同家系在雌、雄生理性别比例上存在明显差异;伪雄鱼后代中的遗传雌鱼更容易转化为伪雄鱼,增加养殖群体中生理雄鱼的数量.研究表明,通过家系选育可以筛选出雌性比例高、生长速度快的半滑舌鳎家系.     

半滑舌鳎早期不同性别的形态差异及判别分析

为检验半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)鱼苗70日龄时不同性别间的形态差异,对采集的349尾半滑舌鳎幼苗准确鉴定性别,并测量形态性状,进行数据分布检验、方差分析、主成分分析和判别分析等。结果显示,所测各性别群组的形态指标数据均符合正态分布、方差齐性(P0.05)。对半滑舌鳎形态学性状的方差分析和主成分分析表明,雌、雄性别间差异主要集中在全长和体高等方面,且雌鱼全长、体高平均值都大于雄鱼和伪雄鱼。利用各项标准化指标进行判别分析,雌性个体判别准确率为37%,雄性个体判别准确率为85%,伪雄鱼极不易判别且更接近雄性。研究表明,对雄鱼的判别方法可满足生产中半滑舌鳎早期苗种性别观测鉴定的要求,从而达到提高苗种雌性率的目的。     

Sox9和amh基因在雌、雄虹鳟和伪雄鱼各组织中的表达模式分析

本研究利用Real-time PCR分析和比较sox9与amh基因在雄、雌虹鳟Oncorhynchus mykiss及及其伪雄鱼各组织中的表达模式。结果表明:sox9基因在这三种鱼性腺、脑、脾、肝以及脑垂体中的表达显著高于其他组织(P0.05)。在性腺组织中,sox9基因在雄鱼中的表达量显著高于伪雄鱼(P0.01),而在伪雄鱼中的表达量又显著高于普通雌鱼(P0.01)。脑组织中,雌鱼sox9的表达显著高于雄鱼和伪雄鱼(P0.05)。Amh基因在性腺和脑组织中的表达显著高于其他组织(P0.05)。该基因在伪雄鱼性腺和脑中的表达均显著高于雄鱼和雌鱼(P0.05)。结果表明,外源雄激素的诱导可导致伪雄虹鳟性腺和脑组织中sox9和amh基因的表达显著高于雌性虹鳟,促进其性腺的雄性化发育。本研究可为全雌性虹鳟制种技术研究奠定重要理论基础。     

半滑舌鳎抗缪勒氏管激素(AMH)基因的克隆及组织表达分析

本研究克隆了半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)AMH基因并对其进行表达分析。该基因cDNA序列开放阅读框长为1 563 bp,编码蛋白含520个氨基酸。该蛋白含有TGF-β超家族的特征序列,包含1个AMH-N区域和TGF-β结构域,并在C端生物活性区含有9个保守的半胱氨酸残基。系统进化分析表明,半滑舌鳎AMH和所有鱼类AMH聚为一簇,与鲽形目相似性最高。实时定量结果表明,AMH基因在半滑舌鳎不同组织中有差异表达,在正常雄鱼和伪雄鱼性腺中表达量最高。胚后不同时期性腺的实时定量结果表明,性腺分化之前AMH在精巢中相对表达量较低,70 dph(days post hatching)达到最高峰,而在卵巢中呈现先升高后下降的趋势,预示AMH基因可能在半滑舌鳎性腺发育中起重要作用。较正常雄鱼后代而言,AMH基因在伪雄鱼后代的雄鱼和伪雄鱼性腺中的表达都有升高的趋势,而在雌鱼中无明显差异,也预示其可能参与半滑舌鳎的性反转过程。     

中国胭脂鱼的细胞遗传学分析

采用植物血凝素、秋水仙素活体注射和肾细胞直接制片法分析了中国胭脂鱼(Myxiocyprinus asiaticus)的染色体核型和Ag-NORs显带;并以中国胭脂鱼血细胞为样本,鸡血细胞DNA含量为标准(2.50 pg),用流式细胞仪测定了中国胭脂鱼的 DNA 含量.结果表明:(1)中国胭脂鱼染色体数目2n=100,核型公式为10 m+4 sm+12 st+74 t, NF=114,未观察到次缢痕及随体,亦未发现有性染色体.(2)中国胭脂鱼染色体具有1对Ag-NORs,位于第1对染色体短臂上,间期核中Ag-NORs的数目为1~2个,未见Ag-NORs的联合现象.(3)PI和DAPI作为荧光染料,得出中国胭脂鱼DNA含量分别为5.50±0.24 pg和6.16±0.03 pg.(4)中国胭脂鱼为四倍体,在特定的分类阶元中属于较原始的鱼类.     

盐度胁迫下三疣梭子蟹Ferritin基因的原核表达

为验证Ferritin基因是否对三疣梭子蟹的盐度胁迫具有适应性, 利用PCR扩增获得了三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)第六对鳃的Ferritin基因, 将该目的基因克隆到表达载体pET28a(+)中, 转化大肠杆菌DE3(BL21), 并进行IPTG诱导表达。结果表明: 经诱导的转pET28-Ferritin重组质粒菌株有特异的表达蛋白条带出现, 与预期的理论值(19.448 kD)相符合; 高盐胁迫下, 转重组质粒的大肠杆菌比转pET28空载质粒存活率显著提高(P< 0.001), 并且随盐度升高, 两者差异越显著。这表明Ferritin基因能够提高大肠杆菌的盐度耐受力, 由此推测Ferritin基因参与了三疣梭子蟹盐度适应的生理过程。本研究旨在为生产过程中三疣梭子蟹养殖水体的盐度调控策略提供理论依据。

     

秦岭细鳞鲑的年龄与生长

 2009—2012年于陕西省陇县秦岭细鳞鲑(Brachymystax lenok tsinlingensis)国家级自然保护区内采集秦岭细鳞鲑样本397尾。以鳞片为年龄鉴定材料, 显微镜下观察发现, 秦岭细鳞鲑鳞片上的年轮特征主要表现为普通切割形; 研究样本的年龄共分为5个年龄组, 其中以1～3龄为主, 约占85.64%; 体长(L, mm)和鳞径(R, mm)具有显著的相关性(L= -5.83R² + 208.06R + 34.99, r²=0.88); Von Bertalanffy生长方程分别为: L_t=729.38[1-e^-0.08(t+0.5)], W_t=        6 288.74·[1-e^-0.08(t+0.5)]^{2.968 1}, 雌雄个体的生长速率无显著差异; 生长系数为0.08, 拐点年龄为13.10 龄, 对应的的体长和体质量分别为483.66 mm和1 857.86 g。结论认为, 秦岭细鳞属生长缓慢型鱼类, 在所调查的保护区中秦岭细鳞鲑显现出个体小型化趋势。在制定资源保护策略时, 应考虑采取人工增殖放流措施来扩大自然种群数量, 增强种群的自然调节能力, 恢复种群数量。本研究旨在了解秦岭细鳞鲑的生长规律, 为秦岭细鳞鲑的资源保护与合理利用提供理论指导。

     

浒苔对刺参幼参生长影响的初步研究

对浒苔(Entero­morpha prolifera)的一般营养成分、氨基酸及脂肪酸含量进行测定, 并以浒苔为原料投喂体质量(5.26±0.14) g的刺参(Apostichopus japonicas Selenka)幼参, 与幼参常用饵料如鼠尾藻(Sargassum thunbergii)、马尾藻(Sargassum muticum)、海带(Laminaria japonica)进行效果对比。营养成分检测结果显示, 浒苔蛋白质含量为15.7%, 其中含量较高的氨基酸有天门冬氨酸、谷氨酸、丙氨酸、亮氨酸等; 脂肪含量低(1%), 多不饱和脂肪酸比例较高(0.24%); 浒苔中各重金属(无机砷、镉、铅、甲基汞)含量均低于国家相关限量标准。以4种海藻为饵料投喂幼参70 d后, 各组刺参幼参生长良好, 成活率无明显差异(P>0.05), 幼参体质量均显著增长(P<0.05); 各组刺参的特定生长率(SGR)由高到低依次为鼠尾藻组、浒苔组、马尾藻组、海带组; 摄食率(IR)由高到低依次为海带、马尾藻、浒苔、鼠尾藻, 饵料转化率(FE)由高到低依次为鼠尾藻组、浒苔组、马尾藻组、海带组。浒苔、鼠尾藻、马尾藻3个投喂组刺参幼参特定生长(SGR)无显著差异(P>0.05), 但显著高于海带组(P<0.05)。本研究说明, 浒苔蛋白含量高、脂肪含量低, 可全部或部分替代鼠尾藻添加到幼参饵料。

     

Foxl2基因在栉孔扇贝发育过程中的表达图式

Foxl2基因在哺乳动物中是雌性相关基因,参与卵巢发育和功能维持。本研究利用荧光定量PCR和原位杂交技术,对栉孔扇贝(Chlamys farreri)foxl2(Cf-foxl2)在发育过程中的表达图式进行了分析。研究发现Cf-foxl2在受精卵中呈低水平表达,随着发育进行表达量增高,D形幼虫期表达量最高,之后表达量迅速下降。原位杂交结果显示Cf-foxl2表达量在担轮幼虫之前在体内均匀分布;强阳性信号在担轮幼虫口凹附近呈对称分布;至D形幼虫期强阳性信号主要集中在内脏团和外套膜边缘处;之后信号消失,直到性别分化后在卵巢中再次出现。本实验结果暗示Cf-foxl2与卵巢发育相关,鉴于该基因在发育早期的持续性表达特征,暗示其可能参与栉孔扇贝的早期发育过程。     

人工隐蔽物及投喂频率对许氏平鲉幼鱼生长和行为的影响

室内水槽实验条件下研究了许氏平鲉(Sebastes schlegelii)幼鱼(15.24 g±2.9 g)在不同光照条件下对3种人工遮蔽物的行为反应。在此基础上,通过7周的养殖实验研究了不同放养密度下(800 ind/m3,1 200 ind/m3,1 600 ind/m3),隐蔽物、投喂频率(1次/d、2次/d、3次/d、4次/d)对许氏平鲉幼鱼(0.50 g±0.02 g)生长、摄食和行为的影响。结果表明:1)实验采用的3种隐蔽物对许氏平鲉幼鱼均有明显的诱集作用,其中扇贝笼改造的隐蔽物S1诱集效果最好。2)遮光条件可以提高隐蔽物区域幼鱼的分布率,但与自然光处理组差异不显著(P0.05)。3)在实验设定的密度范围内,许氏平鲉幼鱼的终末体重、日增重率、特定生长率随密度的增大而升高。无隐蔽物条件下,低密度组的日增重率和特定生长率与中高密度组差异显著(P0.05),终末体重则显著低于高密度组(P0.05);隐蔽物的设置显著提高了中、低密度组许氏平鲉幼鱼的终末体重(P0.05),高密度组幼鱼的特定生长率和饲料转换率也有显著提高(P0.05)。4)放养密度和隐蔽物对于许氏平鲉幼鱼的生长离散影响显著(P0.05),随着放养密度的增大,幼鱼的体重变异系数呈逐渐增大趋势;相同放养密度下,放置隐蔽物的各组幼鱼生长离散均小于未放置组,其中低密度组间差异极显著(P0.01),中密度组间差异显著(P0.05)。5)3种放养密度下饱食投喂频率为1次/d处理组幼鱼的体重变异系数显著大于其他各组(P0.05),饱食投喂频率大于2次/d时,各处理组幼鱼生长离散无显著差异(P0.05)。研究结果表明,对于体重0.5~5.8 g的许氏平鲉幼鱼,当放养密度为1 200 ind/m3条件时,通过投放人工隐蔽物,选取2次/d的饱食投喂频率,可显著降低生长离散水平,并使幼鱼获得较好的生长。本研究旨在为许氏平鲉健康苗种培育及规模化生产提供科学指导和技术支撑。     

合浦珠母贝幼贝生长性状的遗传参数估计

以广东徐闻和海南三亚2个地理群体合浦珠母贝(Pinctada fucata)为亲本, 采用人工授精方法构建了33个全同胞家系。在162日龄时从每个家系随机抽取50个个体, 共1 650个, 测量其壳长、壳高、壳宽和体质量4个生长性状, 利用动物模型对4个性状进行遗传参数分析。结果表明, 合浦珠母贝4个生长性状的总平均值分别为(16.28 ± 4.46) mm、(14.85 ± 4.39) mm、(4.58 ± 1.52) mm、(0.66 ± 0.67) g。4个性状的遗传力分别为0.202 ± 0.020、0.203 ± 0.020、0.200 ± 0.021和0.204 ± 0.020, 均属中等遗传力, 因此可以用选择育种进行遗传改良。4个性状间表型相关系数和遗传相关系数的范围分别为0.667~0.698和0.685~0.959, 其中壳长、壳高和壳宽之间的遗传相关系数均低于0.7, 与表型相关一致, 而三者与体重间的遗传相关系数较高(0.868~0.959), 其中壳宽与体质量间的遗传相关系数最高(0.959)。本研究中合浦珠母贝的4个性状为中等遗传力, 并可通过对壳宽的选育来改良体质量性状。上述结果为进一步开展合浦珠母贝选择育种研究奠定了基础。

     

一个与大鲵蛙病毒 (ADRV) 感染相关基因 —6R的克隆、原核表达及其产物分离

在新近报道大鲵蛙病毒(Andriasda vidianus ranaviurs,ADRV)基因组的基础上,我们对ADRV 6R进行了克隆、原核表达及其产物的分离,这是一个经生物信息分析表明与病毒感染相关的功能基因。先经PCR扩增长到711 bp的ADRV6R,构建含扩增片段的克隆质粒p MD18-T-6R。再构建原核表达质粒p ET-32a-6R,进行测序,并与水生动物蛙病毒相关基因同源序列进行比对,该扩增片段与预期一致,其编码分子量约为27 k D、含236个氨基酸的蛋白,与水产动物病毒US22蛋白家族(US22 family protein)成员有很高的同源性。然后对p ET-32a-6R进行转化、诱导表达,并利用Ni-NTA His-Bind亲和层析及不同浓度咪唑洗脱液对表达产物进行分离、电泳分析,结果显示,获得与预测分子量相符的45 k D融合蛋白(27 k D目的蛋白与18 k D His标签)。这为后续制备抗体、并开展大鲵蛙病毒与宿主的相互作用研究提供了有用的实验材料。     

鳜传染性脾肾坏死病毒ORF093基因的克隆、表达及其重组蛋白的免疫原性分析

从患传染性脾肾坏死病毒(infectious spleen and kidney necrosis virus,ISKNV)病的鳜体内获得ORF093基因。采用PCR方法扩增ISKNV ORF093基因全长,克隆入原核表达载体pET32a(+),IPTG诱导表达,Ni柱纯化后,免疫新西兰大白兔制备兔抗重组093蛋白血清,免疫印记分析兔抗血清的特异性,中和实验和免疫保护实验分析重组093蛋白的免疫原性。结果显示:ISKNV重组093蛋白可以在大肠杆菌中以包涵体形式存在;制备的兔抗血清可以特异性识别重组093蛋白,对ISKNV具有中和作用,可给鱼体提供至少10 d的100%预防保护;重组093蛋白对ISKNV的攻击具有保护作用,攻毒后15 d,093免疫组平均相对保护率为45.3%。结果说明重组093蛋白具有一定的免疫原性,可作为ISKNV候选疫苗抗原和治疗血清制备抗原。本研究通过中和实验及免疫保护实验对重组093蛋白的免疫原性进行分析,旨在为鳜ISKNV重组亚单位疫苗的研制奠定基础。