半滑舌鳎养殖群体中自然性逆转伪雄鱼的发现

利用雌性特异标记遗传性别鉴定技术,对71尾4龄半滑舌鳎的生理和遗传性别进行鉴定,结果显示32尾生理型雌鱼均能扩增出205bp的雌性特异条带;39尾生理型雄鱼,仅一尾鱼体重显著高于其他雄鱼并扩增出了雌性特异条带,因此这尾鱼遗传上为雌性,是一尾伪雄鱼。对养殖的600尾半滑舌鳎生理雄鱼大规模检测发现,养殖群体自然性逆转伪雄鱼比例为1.66%。对正常雌、雄鱼和1龄自然性逆转伪雄鱼的性腺组织学观察显示,与正常雄鱼相比,伪雄鱼性腺中也有大量的精母细胞,但数量比正常雄鱼的要略少;且未在伪雄鱼的性腺组织中观察到卵母细胞,说明半滑舌鳎性逆转发生在性腺分化期。半滑舌鳎自然性逆转现象的发现有助于解释当前半滑舌鳎养殖群体中雄性率偏高的现象,为半滑舌鳎全雌苗种生产提供了一条新的技术途径,并丰富了鱼类性别分化理论。     

半滑舌鳎快速生长及高雌性家系的筛选

为查明半滑舌鳎不同家系雌、雄鱼遗传和生理性别比例及其与生长速率的关系,并试图筛选出生理雌鱼比例高且生长快的家系,实验首先建立了22个半滑舌鳎家系,并进行同池养殖以比较生长性能,再选取5个正常雄鱼家系和5个伪雄鱼家系进行遗传性别和生理性别测定.结果发现,不同家系鱼苗不仅生长速度差异显著,而且雌雄比例差异也很显著.筛选出生长快速的家系2个(家系16号和61号),其相对增重率分别为0.81和0.56 g/d;筛选出生长较快的家系4个(家系21、28、57和63号),其相对增重率为0.48 ～0.53 g/d;筛选出生长速度一般的家系12个,生长慢速家系4个.所检测的5个正常雄鱼(ZZ类型)家系的遗传雌鱼比例平均为51.87％,生理雌鱼比例平均为42.94％,遗传雌鱼转化为生理雄鱼的比例平均为14.08％.相反,检测的5个伪雄鱼(ZW类型)家系的遗传雌鱼比例平均为49.34％,生理雌鱼比例平均为4.45％,遗传雌鱼转化为生理雄鱼的比例平均为91.41％.实验发现半滑舌鳎不同家系在雌、雄生理性别比例上存在明显差异;伪雄鱼后代中的遗传雌鱼更容易转化为伪雄鱼,增加养殖群体中生理雄鱼的数量.研究表明,通过家系选育可以筛选出雌性比例高、生长速度快的半滑舌鳎家系.     

半滑舌鰨养殖群体雌雄比例与自然性逆转率

利用半滑舌鳎（Cynoglossus semilaevis Günther）性别连锁微卫星标记scaffold1128₃43和性腺组织切片的方法,研究半滑舌鳎8个普通家系和养殖场雄性亲鱼遗传性别与性逆转情况。首先,8个普通家系（28、30、38、39、40、44、57、69）遗传性别检测结果显示,遗传雌性比例最低为39家系（37.93%）,最高为38家系和40家系（55.00%）。对其中4个家系（28、39、44、57）的两次遗传性别比例检测结果对比发现,家系间遗传雌性比例存在差异。其次,对4个家系（28、39、44、57）和养殖场雄性亲鱼的遗传与表型性别鉴定结果表明,不同家系表型雌鱼比例为18.75%⁴6.88%,低于各家系的遗传雌性比例,不同家系间自然性逆转率存在显著性差异（P<0.05）。研究还发现,繁育场所用的普通雄性亲鱼中平均有28.42%的伪雄鱼。本研究结果表明,自然性逆转现象在半滑舌鳎养殖群体中普遍存在,半滑舌鳎不同家系的表型雌鱼比例存在显著差异,这为培育半滑舌鳎高雌性苗种提供了理论依据。     

半滑舌鳎早期不同性别的形态差异及判别分析

为检验半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)鱼苗70日龄时不同性别间的形态差异,对采集的349尾半滑舌鳎幼苗准确鉴定性别,并测量形态性状,进行数据分布检验、方差分析、主成分分析和判别分析等。结果显示,所测各性别群组的形态指标数据均符合正态分布、方差齐性(P0.05)。对半滑舌鳎形态学性状的方差分析和主成分分析表明,雌、雄性别间差异主要集中在全长和体高等方面,且雌鱼全长、体高平均值都大于雄鱼和伪雄鱼。利用各项标准化指标进行判别分析,雌性个体判别准确率为37%,雄性个体判别准确率为85%,伪雄鱼极不易判别且更接近雄性。研究表明,对雄鱼的判别方法可满足生产中半滑舌鳎早期苗种性别观测鉴定的要求,从而达到提高苗种雌性率的目的。     

黄海所在鱼类性反转的表观遗传调控机制研究上取得重要进展

<正>中国水产科学研究院黄海水产研究所与深圳华大基因研究院合作在鱼类性反转的表观遗传调控机制研究上取得重要进展,研究成果最近在国际著名期刊Genome Research(IF=14.4,2014.24:604-615)上发表(http://genome.cshlp.org/content/24/4/604.short)。这是黄海所继在Nature Genetics发表半滑舌鳎全基因组文章之后取得的又一重大研究成果。黄海所陈松林带领其团队先后完成了半滑舌鳎全基因组精细图谱的绘制以及高密度遗传连锁图谱的构建。在此基础上,他们瞄准半滑舌鳎雌雄生长差异巨大以及雌雄比例严重失调的生产实际,开展了半滑舌鳎正常雄鱼(ZZ♂)、伪雄鱼(p-ZW♂)、正常雌鱼(p-ZW♀),以及伪雄鱼和正常雌鱼交配产生的F1伪雄鱼(f-ZW♂)和雌鱼(f-ZW♀)性腺的全基因组DNA甲基化测序,绘制了半滑舌鳎     

半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)真、伪雄鱼群体表型和遗传性状分析

半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)养殖群体中存在真雄鱼(ZZ)和伪雄鱼(ZW)现象,进行表型和遗传特征研究对其育种及优良苗种培育具有重要的意义。本研究以半滑舌鳎真、伪雄鱼群体及母系半同胞家系为研究对象,首先测定了性成熟半滑舌鳎的真、伪雄鱼群体的表型性状,对其性状进行了比较分析。结果显示,性成熟半滑舌鳎真、伪雄鱼的体重、全长、体长、体宽、头长、眼间距和眼径7个表型性状都存在极显著差异(P0.01),伪雄鱼的生长速度比真雄鱼快。利用半滑舌鳎22对多态性微卫星标记,对2组半滑舌鳎真、伪雄鱼半同胞家系群体进行了遗传多样性分析。筛选出的22对引物扩增产物均具有多态性,4个半同胞家系群体中共检测到232个等位基因,群体平均等位基因数(N_a)均大于平均有效等位基因数(N_e);平均观测杂合度(H_o)均小于平均期望杂合度(H_e);平均多态信息含量(PIC)分别为0.4566、0.4254、0.5069、0.4795。22个多态性位点在4个半同胞家系群体中分别有3、3、4和5个位点显著偏离Hardy-Weinberg平衡。4个半同胞家系群体间的Nei￠s遗传距离为0.2101–0.5840,遗传相似性系数为0.5577–0.8105。本研究表明,半滑舌鳎真、伪雄鱼在生长性状上存在明显差异,同母系的真、伪雄鱼半同胞家系群体间的遗传相似系数较高,遗传距离较小,遗传多样性指标相近。     

半滑舌鳎的性腺分化和温度对性别决定的影响

半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevisGünther)是近年来新开发的一种理想的增养殖对象,雌性个体生长速度比雄性快2～3倍。由于温度可影响多种鱼类的性腺分化,因而探索温度对该鱼的性别决定和性腺分化的影响,获得性逆转雄性亲本,用于培育全雌后代,具有重要的应用前景和经济效益。通过石蜡组织切片,对半滑舌鳎早期性腺分化进行组织学观察。发现在24℃饲养条件下,孵化后30 d半滑舌鳎性腺开始分化,其中具有裂隙的性腺原基未来发育为卵巢,而不具裂隙的原基未来发育为精巢。在孵化后25～100 d对半滑舌鳎进行不同温度(16℃、20℃、24℃、28℃、32℃)处理,在9月龄时利用石蜡组织切片鉴定表型性别,观察温度对性腺分化的影响,结果表明,28℃和32℃高温能显著提高群体中的雄性比例,使其分别达到69.2%和66.7%;而低温16℃和20℃对性腺分化影响不大,群体中雄性比例分别为56.5%和57.1%;24℃处理群体中雌雄个体比例接近1∶1。半滑舌鳎雌性特异的遗传性别鉴定技术也检测到高温和低温处理组出现了由基因型雌性向表型雄性逆转的雄性个体。这些结果表明温度影响了半滑舌鳎性腺分化方向。     

半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)真、伪雄鱼群体表型和遗传性状分析

半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)养殖群体中存在真雄鱼(ZZ)和伪雄鱼(ZW)现象,进行表型和遗传特征研究对其育种及优良苗种培育具有重要的意义。本研究以半滑舌鳎真、伪雄鱼群体及母系半同胞家系为研究对象,首先测定了性成熟半滑舌鳎的真、伪雄鱼群体的表型性状,对其性状进行了比较分析。结果显示,性成熟半滑舌鳎真、伪雄鱼的体重、全长、体长、体宽、头长、眼间距和眼径7个表型性状都存在极显著差异(P<0.01),伪雄鱼的生长速度比真雄鱼快。利用半滑舌鳎22对多态性微卫星标记,对2组半滑舌鳎真、伪雄鱼半同胞家系群体进行了遗传多样性分析。筛选出的22对引物扩增产物均具有多态性,4个半同胞家系群体中共检测到232个等位基因,群体平均等位基因数(Na)均大于平均有效等位基因数(Ne);平均观测杂合度(Ho)均小于平均期望杂合度(He);平均多态信息含量(PIC)分别为0.4566、0.4254、0.5069、0.4795。22个多态性位点在4个半同胞家系群体中分别有3、3、4和5个位点显著偏离Hardy-Weinberg平衡。4个半同胞家系群体间的Nei¢s遗传距离为0.2101–0.5840,遗传相似性系数为0.5577–0.8105。本研究表明,半滑舌鳎真、伪雄鱼在生长性状上存在明显差异,同母系的真、伪雄鱼半同胞家系群体间的遗传相似系数较高,遗传距离较小,遗传多样性指标相近。     

半滑舌鳎“鳎优1号”新品种选育及高雌苗种生产填补国内空白

正近年来半滑舌鳎省级良种场—唐山市维卓水产养殖公司与中国水产科学研究院黄海水产研究所水产生物技术与基因组研究室合作,开展了半滑舌鳎高雌苗种制种与示范推广,已形成伪雄鱼检测、亲鱼培育催产、精子质量分析和冷冻保存等一系列受精卵生产技术,创新半滑舌鳎工厂化高效养殖模式,实现了高雌受精卵全年生产,商品苗种雌鱼比例达到40%。年产高雌性比例受精卵200kg以上,连续五年鱼卵供应量占国内总量的70%以上;     

半滑舌鳎Shh基因的克隆与表达及甲基化分析

通过RACE方法获得半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)Hh基因家族的Shh基因,该基因全长1 922 bp,其中5′UTR 266 bp,3′UTR 360 bp,ORF1 296 bp,编码431个氨基酸,经预测该多肽的相对分子质量为47.28 k D,理论等电点6.95,具有Hh基因家族特有的保守结构域。氨基酸序列分析表明,半滑舌鳎Shh与牙鲆的同源性最高,为82%,与其他鱼类同源性为74%~81%,与非洲爪蟾的同源性为61%,与人和鼠的同源性为63%~64%。甲基化结果显示,Shh基因在1龄卵巢中的甲基化程度普遍低于雄鱼与伪雄鱼精巢。基因表达分析显示,Shh基因在胚胎期的囊胚期表达显著高于其它时期(P0.05),在雌雄成鱼8个组织器官均表达,在雌性性腺分化的关键期孵化后50 d,雌性性腺中表达量较前期升高,且显著高于同时期雄性性腺中的表达(P0.05),在雄性性腺分化的关键期80~95 d,Shh基因在雄性中的表达水平显著升高(P0.05),在8月龄、1龄及2龄雌鱼性腺中表达显著高于雄鱼与伪雄鱼。本研究表明,半滑舌鳎Shh基因在进化中高度保守,与胚胎分化、组织器官形成、雌雄性腺分化及性腺发育密切相关。     

半滑舌鳎抗缪勒氏管激素(AMH)基因的克隆及组织表达分析

本研究克隆了半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)AMH基因并对其进行表达分析。该基因cDNA序列开放阅读框长为1 563 bp,编码蛋白含520个氨基酸。该蛋白含有TGF-β超家族的特征序列,包含1个AMH-N区域和TGF-β结构域,并在C端生物活性区含有9个保守的半胱氨酸残基。系统进化分析表明,半滑舌鳎AMH和所有鱼类AMH聚为一簇,与鲽形目相似性最高。实时定量结果表明,AMH基因在半滑舌鳎不同组织中有差异表达,在正常雄鱼和伪雄鱼性腺中表达量最高。胚后不同时期性腺的实时定量结果表明,性腺分化之前AMH在精巢中相对表达量较低,70 dph(days post hatching)达到最高峰,而在卵巢中呈现先升高后下降的趋势,预示AMH基因可能在半滑舌鳎性腺发育中起重要作用。较正常雄鱼后代而言,AMH基因在伪雄鱼后代的雄鱼和伪雄鱼性腺中的表达都有升高的趋势,而在雌鱼中无明显差异,也预示其可能参与半滑舌鳎的性反转过程。     

半滑舌鳎有效群体大小估计

为了解半滑舌鳎当前的群体遗传结构,探究半滑舌鳎有效群体大小(N_e)发展趋势及现状,实验通过性别特异性分子标记随机鉴定了800尾半滑舌鳎的遗传性别,选取297个遗传雌性半滑舌鳎样本进行简化基因组测序(2b-RAD),获得了64 416个可用SNP标记,利用这些标记进行全基因组范围的连锁不平衡分析得到各染色体上连锁不平衡分布;根据标记间不同物理间距进行半滑舌鳎有效群体大小的估计,初步了解各历史世代下有效群体规模;通过选择0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 Mb等7个不同染色体片段大小反映出半滑舌鳎群体遗传结构经过自然与人工共同选择的历史发展趋势。结果显示,半滑舌鳎有效群体大小随其连锁不平衡程度衰减而呈连续下降趋势,至2世代前其有效群体大小仅为29尾左右。     

雌雄半滑舌鳎脑垂体基因表达差异研究

为研究半滑舌鳎雌雄个体大小和生长速度差异悬殊的分子机理,采集来自同一亲本、同一发育阶段的半滑舌鳎雄鱼和雌鱼脑垂体,分别与Affymetrix的斑马鱼基因芯片杂交,筛选差异表达基因。芯片杂交结果显示二者共有1 051个基因检测到明显的杂交信号,其中上调基因486个,下调基因561个。进一步比较雄鱼和雌鱼杂交信号的比值(Ratio值),有39个基因的Ratio值小于0.6或大于1.5,其中sh3gl1b、meis2.1、acta1、Noxa、slc25a5这5种上调基因和col1a2、klf7、acta2这3种下调基因可能与半滑舌鳎雌雄生长差异相关。这一结果为深入研究半滑舌鳎雌雄性别分化与生长调控机制提供了新思路。     

半滑舌鳎四倍体鱼苗的诱导与鉴定

采用静水压法处理半滑舌鳎(Cynoglossus semiliaevis)受精卵以抑制其卵裂并进行染色体加倍,筛选出有效的静水压处理起始时间、处理强度及其持续时间。结果表明,孵化水温(23±0.2)℃时,授精后21.5 min,采用40 MPa的静水压压力,休克处理4.5 min,四倍体诱导效果最好,鱼苗四倍体率达到68.3%。采用流式细胞仪分析了四倍体鱼苗细胞DNA含量,表明四倍体鱼苗细胞DNA含量为二倍体对照鱼苗的2倍。通过染色体制作分析表明四倍体鱼苗的染色体数为84条,而二倍体对照鱼苗的染色体数为42条。本研究采用静水压方法,在国内外首次建立了半滑舌鳎四倍体诱导方法。本项技术的建立旨在为大量生产半滑舌鳎三倍体不育群体奠定基础。     

半滑舌鳎微卫星标记的开发及其在F1家系中分离方式分析

利用富集文库-菌落原位杂交的方法筛选半滑舌鳎( Cynoglossus semilaevis)微卫星标记,构建富含(AC)和(AG)序列重复的半滑舌鳎微卫星富集文库,随机从文库中挑选1060个克隆,筛选得到883个(83.3％)阳性信号,菌落PCR检测742个阳性克隆片段的长度在500～1 200 bp范围内,随机挑选其中50个克隆进行测序,共设计引物33对,进行退火温度优化、多态性检测后,共得到20个多态的半滑舌鳎微卫星标记.对其进行分离方式分析,其中有17个位点符合孟德尔分离定律,共表现5种分离方式,可用于半滑舌鳎遗传连锁图谱的构建;另外有3个位点偏离孟德尔分离定律(P＜0.05).结果同时证明富集文库-菌落原位杂交是半滑舌鳎微卫星标记大量筛选和高密度遗传连锁图谱构建的一种行之有效的方法.     

半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis) c-Jun基因的克隆及免疫应答分析

半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)AP-1家族转录因子c-Jun基因(Jun proto-oncogene)及其在免疫应答中的作用尚无报道.本研究根据半滑舌鳎转录组数据库中预测的c-Jun序列,通过RACE技术和PCR扩增方法获得了半滑舌鳎c-Jun基因cDNA全长2093 bp,CDS区域共981 bp,编码326个氨基酸,5'UTR区域377 bp,3'UTR区域735 bp.SMART分析显示,C-JUN蛋白具有2个结构域:AP-1家族典型结构域Jun,以及高度保守的亮氨酸拉链结构域(BRLZ).经蛋白多序列同源比对、系统进化树分析,发现半滑舌鳎c-Jun与虹鳟(Oncorhynchus mykiss)c-Jun亲缘关系最近.实时荧光定量PCR分析显示,c-Jun基因在半滑舌鳎不同组织中普遍表达,在卵巢中表达量最高.鳗弧菌(Vibrio anguillarum)人工感染半滑舌鳎后,c-Jun基因在肝脏、脾脏、头肾、小肠、鳃、血液中表达量都出现不同程度上调,其中,鳃中变化最明显:感染12h后表达量达到0h时的13.20倍.使用LPS、PGN、PolyI:C和WGP病原模拟物刺激半滑舌鳎外周血淋巴细胞,结果显示,WGP诱导c-Jun基因上调表达,而LPS与PolyI:C均下调基因表达.以上实验结果表明,c-Jun基因在半滑舌鳎的免疫防御中发挥重要作用.     

半滑舌鳎多聚免疫球蛋白受体(pIgR)基因的克隆和表达分析

本研究根据半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)基因组数据库中预测的多聚免疫球蛋白受体(Polymeric immunoglobulin receptor, pIgR)序列,通过PCR和RACE技术获得了半滑舌鳎pIgR基因cDNA,全长为1419 bp,开放阅读框(ORF)为1020 bp,编码339个氨基酸,5′UTR区域为109 bp,3′UTR区域为290bp。保守结构域分析显示,半滑舌鳎pIgR蛋白包含1个信号肽,2个免疫球蛋白功能域(Ig-like domain, ILD)和1个跨膜结构域。经蛋白序列同源比对和系统进化树分析,发现半滑舌鳎pIgR与大菱鲆(Scophthalmus maximus)和牙鲆(Paralichthy solivaceus)的pIgR亲缘关系最近。实时荧光定量PCR分析显示,pIgR基因在健康半滑舌鳎的不同组织中均有表达,在鳃中表达较高,在肌肉中表达最低。经哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)病原感染刺激后,pIgR基因在半滑舌鳎的5个组织(肝脏、脾脏、肾脏、肠和鳃)中均呈先上升后下降的趋势,其中,在脾脏和鳃中48 h达到最高值,在肝脏、肾脏和肠中72 h达到峰值。与内脏组织不同的是,pIgR基因在皮肤中呈一直上升的趋势。上述结果表明,pIgR基因在半滑舌鳎抵御哈维氏弧菌的免疫应答中发挥重要作用。     

引起半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis Günther)鱼苗大规模死亡的神经坏死病毒病

2012和2013年,山东某育苗场15–20日龄的半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis Günther)鱼苗出现暴发性大规模死亡,7 d内死亡率高达90%–100%。本研究调查了疾病的发生情况和临床特征,采集病鱼样品进行了组织病理学检查,并运用RT-PCR方法进行了病原的检测和基因序列分析。结果发现,半滑舌鳎鱼苗一般在7月和8月发病,发病时养殖水温为22–24℃。病鱼游泳行为异常,表现为上下翻游、螺旋性游动、全身大幅度波浪状浮动症状,但病鱼体表无出血和溃疡症状。组织病理检查发现,病鱼脑和视网膜组织出现严重的空泡化及坏死。病鱼样品的RT-PCR检测结果全部呈鱼类神经坏死病毒阳性。对得到的RT-PCR产物测序,进行BLAST比对,发现该病毒与鱼类神经坏死病毒的赤点石斑鱼神经坏死病毒(Red-spotted grouper nervous necrosis virus, RGNNV)基因型的相似性达98%以上,而与鱼类神经坏死病毒的其他3个基因型：黄带拟鲹神经坏死病毒(Striped jack nervous necrosis virus,SJNNV)、红鳍东方鲀神经坏死病毒(Tiger puffer nervous necrosis virus, TPNNV)和条斑星鲽神经坏死病毒(Barfin flounder nervous necrosis virus,BFNNV)的相似性仅为71%–78%。由此可以判定,本研究发现的引起半滑舌鳎鱼苗大规模死亡的神经坏死病毒为RGNNV基因型,半滑舌鳎也是鱼类神经坏死病毒的天然宿主。该发现在半滑舌鳎疾病防治和鱼类神经坏死病毒的流行机制研究方面都具有重要意义。