柑橘溃疡病致病基因pthA的克隆及序列分析

根据pthA基因和溃疡病病菌大质粒序列设计特异性引物,利用long-PCR方法,获得了包括pthA完整编码区及两端部分非编码区在内的约4 100 bp的DNA片段,再利用net-PCR获得了pthA完整的编码区,经XbaⅠ和SacⅠ双酶切后将其克隆到植物表达载体pBI121中.经双酶切及核酸序列测定鉴定的阳性克隆重组质粒被命名为pBI-pthA.序列分析结果表明,克隆得到的pthA与登录到Genbank上的pthA序列有99.8%的同源性,pthA全长基因编码1 163个氨基酸,具有17.5个102 bp单元的重复序列,每个单元编码34个氨基酸,重复区后有1个亮氨酸拉链结构(LZ),3个核定位信号(NLS)序列和C 末端酸性转录激活(AAD) 保守区.     

产酶溶杆菌OH11菌株几丁质酶基因的克隆与表达

利用PCR方法从产酶溶杆菌OH11菌株中克隆到编码几丁质酶的chiA基因.同源性比较发现,其推测产物与产酶溶杆菌C3菌株和N4-7菌株的ChiA有97%以上的序列一致性.基因经NdeⅠ和XhoⅠ双酶切后连接到含T7启动子的高表达载体pET21a( )上构建重组质粒pChiA,并转化宿主菌BL21(AI)产生BLChiA表达菌株.经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后发现,BLChiA菌株产生相对分子质量约为75×103的蛋白质.生物活性试验表明,该蛋白能水解几丁质,在几丁质培养基上产生一透明的水解圈,并对立枯丝核菌菌丝的生长有抑制作用.因此该蛋白具有一定的生物防治作用.     

蜜蜂螺原体几丁质脱乙酰酶基因的克隆、表达及酶学性质

[目的]通过表达载体p ET-28a(+)在大肠杆菌中克隆表达蜜蜂螺原体Spiroplasma melliferum CH-1中可能与致病相关的几丁质脱乙酰酶(chitin deacetylase,CDA)基因chid,并测定其部分酶学性质,为进一步研究该基因在蜜蜂螺原体致病过程中的作用奠定基础。[方法]利用Overlap Extension PCR(OE-PCR)定点突变技术,在引物设计时插入目的突变,通过3次PCR获得突变后的目的片段,测序验证后构建重组质粒p ETchid,挑取BLchid表达菌株。IPTG诱导表达目的蛋白,NTA-Ni2+柱纯化,Western blotting验证,紫外分光光度法测定其酶活力和酶学性质。[结果]DNA测序结果表明:chid基因中待突变位点已由TGA突变为TGG,成功克隆到chid基因全长,并得到外源表达的完整目的蛋白。该基因编码区为672 bp,编码的氨基酸构成相对分子质量约28×103的蛋白,同源性比较发现其与S.melliferum KC3/BC3/IPMB4A菌株序列相似性为97%。测得外源表达的该酶活力最高可达10.14 U·m L-1,最适温度为50℃左右,最适p H值为7.0~7.5。[结论]首次克隆了螺原体几丁质脱乙酰酶基因chid,并得到具有活性的外源目的蛋白,为后续研究螺原体与宿主蜜蜂的相互作用及其致病机制提供了重要信息。     

SARS病毒核蛋白基因的克隆、序列分析及其在E.coli中的高效表达

对SARS病毒核蛋白(N)基因进行了克隆和序列测定。根据GenBank中已发表的SARS全基因组序列,设计合成了1对特异性引物,对SARS病毒N蛋白基因进行了RT-PCR扩增。将PCR产物纯化后与pGEM-T连接得到重组质粒pGEM-N,进行核苷酸序列测定。结果该基因全长1269bp,编码422个氨基酸。与Tor2、Urbani和TW1株相比,核苷酸和推导的氨基酸序列的同源性均为100%。将pGEM-N双酶切,回收目的基因片段并克隆到大肠杆菌表达载体pET28a中,构建了重组质粒pET-N;将其转化表达菌BL21(DE3)用IPTG进行诱导表达。SDS-PAGE结果表明:重组菌可表达相对分子量约为53kD的蛋白。Western-blotting证实,重组N蛋白可以与SARS免疫血清发生特异性反应。经凝胶薄层扫描分析,重组N蛋白表达量约占菌体蛋白的43%。     

禾谷镰孢菌微管相关蛋白基因(map)克隆及其与多菌灵抗药性关系分析

根据禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum) 测序菌株NRRL31084(PH-1) 的微管相关蛋白基因(map) 核苷酸序列设计4对引物,采用PCR方法测定了禾谷镰孢菌埘多菌灵(MBC) 不同敏感性表型的6个中国菌株的map全序列.DNA序列比对表明,中国的3个敏感菌株和3个抗药菌株的map核苷酸序列相似性没有差异,表明多菌灵抗药性与微管相关蛋白无关.该基因全长1 793 bp,含有6个内含子,编码199个氨基酸;与NRRL31084的map核苷酸序列相似性为99.39%,存在10个差异核甘酸,与其所编码的氨幕酸序列相似性为100%.     

家蚕核型多角体病毒ORF 75基因的克隆及表达

根据GenBank发表的序列(L33180)设计引物,利用PCR技术扩增了编码家蚕核型多角体病毒(Bombyxmori Nucleopolyhedrovirus,BmNPV)ORF75基因的DNA片段,将其连接至pMD18-T载体上,获得了该基因成熟蛋白阅读框序列.利用设计的酶切位点将目的基因从克隆载体上切下.表达质粒pGEX-4T-2经BamHI/XhoI双酶切,与目的片断连接,得到重组表达质粒pGEX/Bm75.将重组表达质粒pGEX/Bm75转化入大肠杆菌BL 21中,经IPTG诱导表达后,12%SDS-PAGE分析表明产生57 kDa左右的特异蛋白质条带.对表达产物进行Westernblotting分析,结果表明,pGEX/Bm75经IPTG诱导产生的57 kDa蛋白条带与抗体发生了很强的交叉反应,融合蛋白得到了表达.     

山桃醇腈酶基因PdHNL1的克隆、序列分析与原核表达

以山桃叶片为材料提取RNA,反转录后得到c DNA,通过PCR扩增得到1个山桃醇腈酶基因全长编码序列,并命名为Pd HNL1。Pd HNL1的开放阅读框为1 737 bp,预测编码蛋白包含539个氨基酸。氨基酸序列比对结果表明,Pd HNL1编码的蛋白具有葡萄糖甲醇胆碱氧化还原酶的序列特征,与黑樱桃醇腈酶Ps HNL4蛋白相似度为92%,与桃假定的HNL蛋白相似度为77%。通过将Pd HNL1基因连接到原核表达载体p ET28(a)上,并转化大肠杆菌BL21(DE3)后,成功构建了原核表达重组菌株。SDS-PAGE电泳结果显示,重组蛋白受IPTG诱导表达,分子量大小约为62.4 ku,与已报道的其他蔷薇科植物的醇腈酶蛋白大小基本一致。     

中介蝮蛇毒纤溶酶基因克隆及生物信息学分析

克隆中介蝮蛇(Gloydius intermedius)纤维溶解酶(Fibrinolytic enzyme,FLE)基因,分析其基因序列并对该基因的功能进行分析.从中介蝮蛇毒腺细胞中提取总RNA,通过RT-PCR法扩增纤溶酶基因,与pMD18-T载体连接进行TA克隆,再进行序列的测定并且对该序列进行分析.扩增得到完整开放读码框在内的长为777 bp的纤溶酶基因序列.成功克隆了编码中介蝮蛇纤溶酶的基因序列,推导其编码的氨基酸序列.开放读码框编码258个氨基酸,含有大量疏水氨基酸.其中,前1～19位氨基酸编码信号肽;根据同源性推测,以His65、Asp110和Ser204组成纤溶酶的活性中心并高度保守;序列内合12个Cys.两两配对结合成的6个二硫键对纤溶酶的高级构型和稳定性至关重要.成功克隆中介蝮蛇毒纤溶酶基因为进一步研究该基因的遗传特征以及为该酶在原核及真核生物中的表达研究提供依据.     

苍白杆菌SY286菌株纤维素酶基因的克隆与表达

由卵菌引起的植物病害大多难以控制,常因再侵染次数多,暴发流行而导致严重损失。卵菌细胞壁的主要成分为纤维素,因此具有产生纤维素酶能力的生防菌能够更好的用于防治卵菌门真菌引起的植物病害。SY286菌株对葡萄霜霉病菌具有较强抑制活性。纤维素酶活性检测试验结果显示,SY286菌株代谢产物中含纤维素酶,菌落周围透明带宽度达5.9mm。根据已报道的纤维素酶基因序列设计引物,经聚合酶链式反应(PCR)扩增得到了561bp纤维素酶基因相关片段,经Blast比对,该与内切β~(-1),4-葡聚糖酶基因序列相似性达99%,即为SY286基因的核心序列。根据此片段的序列设计特异性引物,通过交错式热不对称PCR(TailPCR)得到其上下游序列,经拼接获得完整的纤维素酶基因的开放阅读框(ORF)序列(命名为SY286基因)。该基因序列ORF长度为1494 bp,编码1个含497个氨基酸的蛋白质,预测其蛋白分子量为55.04k Da,理论等电点PI为8.12。经Blast比对,该序列与内切β~(-1),4-葡聚糖酶编码序列相似性达99%,确定SY286基因为内切β~(-1),4-葡聚糖酶基因。并利用SDS-PAGE电泳对该蛋白在E.coli BL21(DE3)中的表达结果进行了检测。经0.5mmol·L~(-1)的IPTG诱导下,重组菌在15℃、22℃、30℃和37℃条件下的表达产物均可在PAGE凝胶上出现特异性条带。经检测重组菌具有纤维素酶活性。试验结果为研究纤维素酶在植物病害生物防治中的应用,以及SY286菌株抑菌分子机理研究和菌株的遗传改良奠定了基础。     

粘质沙雷氏菌几丁质酶(ChiC)基因克隆及其生物信息学分析

从粘质沙雷氏菌(Serratia marcescensATCC14041)中克隆出几丁质酶基因(ChiC),将回收纯化的PCR产物与载体pMD18-T连接,构建成的重组质粒命名为pMD-Ch iC,将重组质粒转化到受体E.coliDH5α中进行克隆,经BamHI和NheI双酶切验证、核酸序列测定证实,重组质粒pMD-Ch iC含有几丁质酶C基因(ChiC)。利用生物信息学的方法,推测该粘质沙雷氏菌ChiC基因编码的蛋白质由480个氨基酸组成。预测该蛋白的等电点为5.63,分子量约为52kD。针对粘质沙雷氏菌中的几个几丁质酶基因做了进化树,进而验证了粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)几丁质酶(ChiC)在沙雷氏菌几丁质酶中的分类;同时对粘质沙雷氏菌几丁质酶C(ChiC)蛋白的高级结构作出了预测,得到其编码的属于18家族的蛋白质高级结构图谱。     

Virus Location and Lymphocyte Apoptosis in Lymph Nodes of Piglets Infected with PCV-2

The present study has been performed to understand the location of the virus, type of apoptotic cells, and their relation to lymph nodes of piglets infected with porcine circovirus type Ⅱ （PCV-2）. Nine 32-day-old conventional piglets free of infection with PCV-2 were used, and distributed into three groups： control group （n = 3）, piglets inoculated with PCV-2 alone （PCV-2, n = 3）, and PCV-2 inoculated and KLH immunostimulated group （PCV-2 ＋ KLH, n = 3）. Superficial inguinal lymph nodes from all piglets were collected for histological examination after 32 days postinoculation, and immunohistochemistry for PCV-2 detection. Location of apoptotic cells was detected with TdT-mediated dUTP nick end labeling （TUNEL） and cell cycle, and the apoptotic rates were measured by flow cytometry. The characteristic histopathological lesions of the piglets in PCV-2 and PCV-2 ＋ KLH were lymphocyte depletions in the cortex and paracortex of the lymph nodes, epithelioid-like macrophage infiltration, and intracytoplasmic inclusion bodies presented in epithelioid-like macrophages. PCV-2 was mainly found in epithelioid-like macrophages by immunohistochemistry. In the lymph nodes, lymphocytes presented higher apoptotic rates in the cortex by TUNEL, special B-cell areas, and similar apoptotic cells were found in this compartment in the control. The apoptotic rates of the lymph nodes were 0.41, 3.34, and 4.88% in the control, PCV-2, and PCV-2 ＋ KLH groups by flow cytometry, respectively. The apoptotic rates of lymph nodes for PCV-2 and PCV-2 ＋ KLH piglets were significantly higher than those for the control group （P〈0.05 and P〈0.01）. The proliferation index （PI） was 0.17_＋0.01, 0.12_＋0.01 and 0.12_＋0.04 in the control, PCV-2, and PCV-2 ＋ KLH group, the PI of the control group was higher than that of the other groups, but without the statistical difference. PCV-2 can induce lymphocyte depletion in lymph nodes of piglets by blocking cell proliferation and promoting apoptosis. This is one o     

不同温度LED光萎凋对铁观音MEP上游关键基因和香气的影响

【目的】萜类化合物是乌龙茶挥发性芳香物质的重要组分,2-C-甲基-D-赤藓醇-4-磷酸途径（MEP）上游关键基因直接参与调控萜类化合物前体物质的合成。而乌龙茶香气的形成与萎凋工序密切相关,光照和温度是影响萎凋的重要因子,探讨LED光与温度在乌龙茶萎凋过程中对香气的影响,为提高乌龙茶萎凋叶香气品质提供参考。【方法】基于转录组数据,根据KEGG筛选出响应光照的MEP上游关键基因（DXS、DXR、HDS、HDR）。对一芽三叶铁观音鲜叶进行LED白光和不同温度（20℃（L20）、25℃（L25）、30℃（L30）、35℃（L35）和40℃（L40））萎凋处理,黑暗下温度（20℃（D20）、25℃（D25）、30℃（D30）、35℃（D35）和40℃（D40））萎凋处理;分别测定铁观音萎凋叶的香气组分和MEP上游关键基因的相对表达量。【结果】L30处理萎凋叶各基因表达量达到最大值,萜类基因（DXS、DXR、HDS、HDR）表达量分别为XY组（对照）的4.31、5.28、11.77、1.59倍,为D30处理的2.24、2.39、1.86和1.60倍。D30组各基因表达量为黑暗处理组最大,依次为XY组的1.92、2.21、6.34和0.99倍。L20处理萎凋叶的α-法呢烯芳樟醇氧化物（I、II）含量最高,较XY依次提高了15.05%、4.92%和15.13%;L30处理萎凋叶的橙花叔醇、芳樟醇和香叶醇含量最高,较XY组依次提高了3.71%、6.14%和15.28%;LED组铁观音萎凋叶主要香气组分含量均高于相对应的温度处理组。通过主成分分析法建立数学模型,对萎凋叶香气组分进行评估,得出L20组萎凋叶得分最高,L30组萎凋叶次之;与香气分析得出结果一致。【结论】铁观音萎凋叶基因表达量与香气含量的变化趋势不存在同步性;L30处理萎凋叶基因表达量、主要萜类香气物质含量和主成分分析得分均较高,这与铁观音生产上的萎凋温度相一致。萎凋温度过高（40℃）不利于萎凋叶萜类关键基因的表达和萜类化合物的形成。     

民勤绿洲荒漠交错带三种沙丘类型的自然植被特征

基于对民勤沙井子地区植被调查数据,研究了固定沙丘、半固定沙丘和流动沙丘3种沙丘类型的自然植被特征.结果表明:从固定沙丘、半固定沙丘到流动沙丘,总盖度、灌木盖度下降,草本盖度增加.物种丰富度减小是物种多样性下降的主要原因.从植物的生活型来看,多年生草本和灌木类植物受沙丘类型的影响最大,而一年生草本和半灌木可存活于不同沙丘类型.白刺的生态优势度(重要值)由小到大依次为固定沙丘、半固定沙丘、流动沙丘.植物多样性与白刺的生态优势度呈负相关.不同沙丘类型白刺地上生物量变化明显,半固定沙丘白刺生物量最大.     

寄生虫引起的草鱼鳃病的组织病理比较研究

本文对草鱼的隐鞭虫病、车轮虫病、小瓜虫病、指环虫病、三代虫病及中华鱼蚤病六种寄生虫性鳃病的组织病理变化进行比较研究，寄生虫性鳃病均可引起鳃组织发生炎症反应，粘液分泌亢进，嗜酸粒细胞和淋巴细胞浸润；但又因病原体的种类不同，危害鱼的方式、方法不同，因此病理变化又有很大差别，对鱼危害较大的均为变质性炎，如隐鞭虫病；对鱼危害较小的则属增生性炎，如中华鱼蚤病．     

葡萄盆栽技术

葡萄盆栽技术,包括择土选种、露地扦插、田间管理、装盆及整形、肥水管理等内容,对葡萄盆栽爱好者有一定的指导意义。     

Yield and quality of maize stover: Variation among cultivars and effects of N fertilization

Biomass yields and concentrations of crude protein(CP), ether extract(EE), neutral detergent fiber(NDF), acid detergent fiber(ADF), and crude fiber(CF) were analyzed for five cultivars of summer-sown maize(Zea mays L.) stover grown in field trials at three rates of N fertilization, and sampled immediately after grain harvest.The results revealed differences in yields and concentrations of nutrients according to stalk height and hence harvest portion among the cultivars.N application greatly increased biomass yield and CP, especially in upper stalks and to a lesser extent, EE.Concentrations of NDF and ADF decreased as N rate increased.The results show that stovers from all local popular maize cultivars are suitable as animal fodder and that moderate N application improves feed quality of stover.     

丙草胺与4种磺酰脲类除草剂混用对稻苗安全性的影响

室内测定了丙草胺分别与磺酰脲类除草剂甲磺隆、苄嘧磺隆、醚磺隆和吡嘧磺隆混用后，一叶一心期稻苗抑制50％株高的使用浓度(IC50)和抑制10％株高的使用浓度(IC50)，并用共害系数(CHC)对混用组合安全性的联合作用进行了评价．结果表明：所有混配处理的CHC10均小于12．0，表现出强烈的解毒效应；不同混用处理的CHC50值差异很大，丙草胺与甲磺隆混用的CHC50均小于25．0，解毒效应显著．丙草胺与苄嘧磺隆混配的CHC50为26．1—167．8，丙草胺与苄嘧磺隆混用的CHC50为52.2—115.5，丙草胺与醚磺隆混用的CHC50为80．0—110．2．     

不同阶段肉仔鸡能量需要模型的建立

试验研究了0~8周龄肉仔鸡胴体与羽毛蛋白、脂肪的生长曲线及0~3、4~6和7~8周龄3个阶段每日摄入不同水平的能量及蛋白对其体蛋白、体脂肪沉积的影响,旨在确定胴体与羽毛蛋白、脂肪动态的沉积规律及日粮能量沉积为体蛋白及体脂肪的效率。试验1,包括3个饲养试验分别选取体重相近的0、21和42日龄爱拔益加(AA)肉仔鸡324只,按性别及日粮随机分为18个处理,每处理3个重复,每重复6只鸡。肉仔鸡每日限量饲喂,饲喂水平分别为正常采食量的90%、70%和50%,每日定量供给肉仔鸡高、中、低3个水平的高蛋白质基础日粮及由饲喂水平决定的定量淀粉,进而使肉仔鸡每日采食能蛋质量比(代谢能/粗蛋白)不同的9种日粮;试验2,选取体重相近的0日龄AA肉仔鸡144只,按性别不同随机分为2个处理,每处理4个重复,每重复18只鸡。试验初和试验末分别进行屠宰,以测定肉仔鸡胴体和羽毛蛋白、脂肪和干物质含量。结果显示:1)Gompertz方程能很好的拟合不同性别肉仔鸡蛋白和脂肪的生长,不同性别间蛋白和脂肪极限重量、羽毛蛋白和脂肪的生长速率差异显著(P<0.05),而胴体蛋白和脂肪的生长速率差异不显著(P>0.05)。2)在0~3、4~6和7~8周...     

ICP-OES法同时测定果蔬中铅、砷、镉、铬、铜、锡含量

果蔬样品经混酸消化后,控制一定的酸度,定容后应用等离子体发射光谱法(ICP-OES)对果蔬中铅、砷、镉、铬、铜、锡六种有害重金属进行测定,研究了分析测定条件,方法简单快速。测定结果表明,五种元素的加标平均回收率在91.0%~107%之间。其RSD均小于3.5%。按该方法进行处理及测定铅、砷、镉、铬、铜、锡,在选择的测定条件下最低检出限分别为0.0006 mg/kg、0.0003 mg/kg、0.00003 mg/kg、0.00005 mg/kg、0.00003 mg/kg、0.0006 mg/kg。     

夹竹桃目植物新资料

本文根据国内外模式标本和文献资料,将亚洲、美洲和大洋洲夹竹桃目植物进行了部分整理和研究,对该目夹竹桃科和萝摩科18属37种作了订正,其中有11种分布新记录,17个新异名,建立15个新名称和1个新组合.