日本血吸虫新基因SjPP的筛选、克隆及对小鼠的免疫效果

【目的】筛选克隆东方田鼠血清识别的日本血吸虫靶抗原基因，并研究其免疫保护效果。【方法】利用东方田鼠感染血清免疫筛选日本血吸虫（中国大陆株）成虫cDNA表达文库获得阳性克隆，以5′ RACE技术扩增获基因全长序列，构建含目的基因的核酸疫苗并研究在小鼠中的免疫保护效果。【结果】（1）获得4个日本血吸虫新的EST序列，即mfs-1（GenBank登录号BE974942）、mfs-3（GenBank登录号BE974944）、mfs-4（GenBank登录号BE974945）和mfs-5（GenBank登录号BE974946）。（2）mfs-5进行全长序列克隆，获得的日本血吸虫新基因SjPP(GenBank登录号AY902477)长1311 bp, 编码302个氨基酸，理论分子量为34.7 kD，等电点为5.51；其氨基酸序列具有丝/苏氨酸蛋白磷酸酶（serine/threonine specific protein phosphatase，简称PP）的保守序列LRGNHE，并且含有该酶特异性抑制剂冈田酸的作用位点SAPNYC，与人的PP6、鼠PP6、果蝇PPⅤ等蛋白的氨基酸序列具有高度同源性，分别达72%、70%和70%。（3）成功构建核酸疫苗pCMV-Script／SjPP，免疫BALB/c小鼠诱导产生肝组织减卵率为23.91%，粪便减卵率为31.91%。【结论】（1）获得日本血吸虫新的抗原基因SjPP。（2）含SjPP基因的核酸疫苗在小鼠中诱导了部分免疫保护效果。     

日本血吸虫SjPRMT1基因的克隆、表达及表达产物的免疫保护效果分析

【目的】克隆和表达日本血吸虫精氨酸甲基转移酶1(SjPRMT1)编码基因cDNA,分析其在日本血吸虫不同发育阶段虫体的表达情况,评估该重组抗原在小鼠体内诱导的抗血吸虫免疫保护效果。【方法】从实验室构建的7d童虫消减cDNA文库中,获得一个EST序列,经序列测定和生物信息学分析命名为SjPRMT1,以SjcDNA为模板,获得其全长cDNA。荧光实时定量PCR分析该基因在童虫和成虫的表达情况。以pET28a(+)为载体构建重组表达质粒,Western blotting检测重组蛋白的抗原性与免疫原性,利用重组抗原免疫小鼠评估其免疫保护效果。【结果】获得了SjPRMT1编码基因的全长cDNA,开放阅读框为660bp,编码219个氨基酸。荧光实时定量PCR分析该基因在18d童虫高表达,13和23d次之。获得了SjPRMT1重组蛋白,其具有良好的抗原性和免疫原性。在小鼠免疫试验中,与空白对照组比较,免疫组小鼠获得35.07%的减虫率和48.66%的肝脏减卵率。【结论】获得了日本血吸虫童虫期高表达的SjPRMT1基因的全长cDNA,成功构建了pET28a(+)-SjPRMT1重组质粒,该重组抗原在小鼠体内诱导产生了部分免疫保护效果。     

日本血吸虫Sj CyclophilinA基因的克隆、表达及其生物学功能研究

【目的】克隆和表达了日本血吸虫CyclophilinA(Sj CyPA)编码基因cDNA,分析其在日本血吸虫不同发育阶段虫体的表达情况,评估该重组抗原在小鼠体内诱导的抗血吸虫免疫保护效果。【方法】从实验室构建的7天童虫消减cDNA文库中,PCR扩增一EST序列的基因全长cDNA,提交到NCBI,登录号为GQ403666。应用荧光实时定量PCR分析该基因在日本血吸虫不同发育阶段虫体的表达情况,以pET28a(+)为载体构建重组表达质粒,并在大肠杆菌中表达。诱导、表达、纯化和复性重组蛋白,测定其PPIase活性。利用Western blot检测重组蛋白的抗原性。以重组抗原免疫小鼠,评估其对小鼠诱导的免疫保护效果。【结果】PCR获得了Sj CyPA编码基因的全长cDNA,其开放阅读框为519bp。荧光实时定量PCR分析表明,该基因在13d童虫表达量最高,为童虫期高表达基因。构建了重组表达质粒pET28a(+)-Sj CyPA,并在大肠杆菌中成功表达。复性重组蛋白具有PPIase活性。Western blot试验显示该重组蛋白具有良好的抗原性,在小鼠免疫试验中,与空白对照组比较,免疫组小鼠获得18.72%的减虫率和44.6%的肝脏减卵率。【结论】获得了日本血吸虫童虫期高表达的Sj CyPA基因的全长cDNA,成功构建了Sj CyPA原核重组表达质粒,在大肠杆菌中成功表达,纯化复性得到有PPIase活性的Sj CyPA重组蛋白,并证实该重组抗原在小鼠体内诱导产生了部分免疫保护效果。     

抗日本血吸虫单克隆抗体的建立及特性测定

 用感染日本血吸虫尾蚴的小鼠脾脏，制备单克隆抗体（McAb），获得24株抗日本血吸虫单抗，选择12株进行Ig亚型测定，对血吸虫抗原敏感性和特异性的测定，组织定位，免疫印迹，体外ADCC对血吸虫童虫的杀伤效应和体内被动免疫转移试验等方面的研究。其中一株IgM单抗在Balb/c小鼠体内诱导了38.41%的减虫率；另一株IgG#-1单抗在昆明系小鼠体内诱导了32.23%的减虫率，并观察到有抑制宿主肝脏肉芽肿形成的现象。     

三肽囊素(Bursin)模拟肽阳性噬菌体对新城疫疫苗免疫效果的影响

研究了两个噬菌体展示三肽囊素模拟肽阳性噬菌体的活性。将100羽1日龄罗曼鸡随机分成5组(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组),每组20羽,在2日龄时,Ⅰ组注射4号阳性噬菌体(滴度为211),Ⅱ组注射6号阳性噬菌体(滴度为211),Ⅲ组注射6号阳性噬菌体(滴度为29),Ⅳ组注射一定剂量的Bursin,Ⅴ组为TBS对照组,在8日龄时接种新城疫(ND)Ⅳ系苗,以后每隔1周采用微量血凝抑制试验和MTT法测定各组的免疫效应。结果表明:阳性克隆(4号和6号)与Bursin在动物试验上具有相似的免疫增强作用,能提高体液免疫水平,对细胞免疫也有提高,且这种促进作用的大小与所用噬菌体滴度有关。     

生姜液预防日本血吸虫尾蚴感染的实验研究

目的：探讨生姜液预防日本血吸虫尾蚴感染的效果以及对皮肤的毒副作用。方法：A组（n=24）小鼠皮肤涂抹生姜液后直接用日本血吸虫尾蚴感染,B组（n=24）小鼠皮肤涂抹生姜液用泥浆水洗擦后感染日本血吸虫尾蚴,观察防护作用。另以生姜液涂于小鼠腹部,观察对皮肤的毒副作用。结果：A组小鼠日本血吸虫尾蚴的感染率为18．18％,减虫率达95．99％;B组小鼠感染率为80．95％,减虫率为4．55％。小鼠皮肤未见异常反应。结论：生姜液涂肤未洗擦时有防御日本血吸虫感染的作用,且对皮肤无明显毒副作用。     

生鲜蔬菜消毒方法的比较

利用大肠杆菌(Escherichia coli)构建生鲜蔬菜消毒过程中水污染模型和蔬菜污染模型,使用传统消毒方法单独处理被污染的水或蔬菜,分别比较其灭菌效率,并探究在传统消毒方法的基础上加入噬菌体进行辅助处理,分析其灭菌效率。结果表明,水污染模型中,0.004%硝酸银的消毒效果最理想,灭菌率超过90%;6种不同杀菌方式对菠菜的杀菌效果最好,其次是生菜、香菜。蔬菜污染模型中,0.10%硝酸银的消毒效果最理想,灭菌率超过85%,对生菜的杀菌效果最好,其次是香菜、菠菜。两种不同的模型中,加入噬菌体M13KO7辅助作用,均可以提高硝酸银、次氯酸钠和紫外照射单独作用的灭菌率。     

日本血吸虫合成表位肽疫苗对小鼠的保护性免疫

为观察日本血吸虫合成表位多肽疫苗诱导的保护性免疫,将用日本血吸虫抗原免疫血清筛选噬菌体随机12肽库得到的、具有较好免疫保护性的4个模拟抗原表位短肽进行人工合成,用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测它们的抗原性.将合成多肽分别与钥孔戚血蓝蛋白(KLH)连接后免疫昆明小鼠,第3次免疫后收集血清,检测其针对各个多肽和可溶性成虫抗原(AWA)的IgG抗体滴度,以及补体介导的小鼠体外杀日本血吸虫童虫作用.结果显示,4个合成多肽均能被相应的抗体识别,具有良好的抗原性;能诱导产生特异性IgG抗体.这些抗体在补体参与下能在体外有效毒杀血吸虫童虫.与正常小鼠血清比较,4个合成多肽免疫血清的杀童虫率分别为31.7%,41.3%,21.1%和17.3%,均具有显著性;与KLH免疫血清相比时,杀童虫率分别为23.7%,34.4%,11.8%(P=0.077,无显著性)和7.5%(P=0.102,无显著性).这些结果表明,这4个合成表位多肽具有良好的抗原性和免疫原性,与KLH连接后能诱导明显的抗体反应和显著的细胞毒作用.     

基于磁珠和时间分辨荧光免疫分析的微囊藻毒素LR单链抗体筛选与鉴定

【目的】从鼠源合成噬菌体抗体库中,快速分离获得微囊藻毒素LR单链抗体。【方法】采用磁珠筛选和负筛选方法,设计两轮微囊藻毒素LR单链抗体的筛选方案。用噬菌体产出投入比和多克隆噬菌体免疫分析,对每轮筛选后微囊藻毒素LR特异性噬菌体的富集效果进行鉴定。再将第2轮筛选获得的次级库提取单链抗体基因,转入可溶性表达载体;诱导表达后,采用时间分辨荧光免疫法,对单个噬菌体克隆鉴定并测序。【结果】两轮筛选的噬菌体产出投入比分别为4.8×10-8和2.88×10-6。第2轮筛选后的次级库,经多克隆噬菌体免疫分析得到的荧光信噪比,比原始抗体库提高了22.8倍。最终鉴定得到5株不同的阳性噬菌体克隆,其中最佳的克隆对微囊藻毒素LR的检测灵敏度（IC10）为13 ng•mL-1,抑制中浓度（IC50）为435 ng•mL-1,线性范围在31—5 952 ng•mL-1。【结论】本研究筛选到的单链抗体,有潜力应用于微囊藻毒素LR的免疫学检测或免疫亲和柱的制备,同时也探索了一种高效的微囊藻毒素LR单链抗体的库筛选、鉴定方法。     

大蒜籽浸液预防日本血吸虫尾蚴感染的实验研究

目的:探讨大蒜籽浸液预防日本血吸虫尾蚴感染的效果以及对皮肤的毒副作用。方法:将实验鼠随机分成3组:涂抹蒜液未清洗感染组(A组,n=24)、涂抹蒜液清洗感染组(B组,n=24)、涂抹脱氯清水感染对照组(C组,n=24),A组小鼠皮肤涂抹大蒜籽浸液后直接用日本血吸虫尾蚴感染;B组小鼠皮肤涂抹大蒜籽浸液用泥浆水洗擦后感染日本血吸虫尾蚴,观察防护作用,另以大蒜籽浸液涂于小鼠腹部,观察对皮肤的毒副作用;C组小鼠腹部皮肤涂抹脱氯蒸馏水。结果:A组小鼠日本血吸虫尾蚴的感染率为零,减虫率达100.00%;B组小鼠感染率为52.38%,减虫率为80.02%,小鼠皮肤未见异常反应。结论:大蒜籽浸液涂肤有防御日本血吸虫感染的作用,对皮肤无明显毒副作用。     

Hycanthone resistance: development in Schistosoma mansoni

Following the administration of relatively high doses of the antischistosomal drug hycanthone to mice and hamsters infected with Schistosoma mansoni, a number of the worms survived. After a period of 6 to 12 months these parasites resumed production of viable eggs that gave rise to schistosomes that proved resistant to hycanthone and to two other related antischistosomal compounds. This drug resistance has remained stable for three subsequent generations of worms.     

New approach to immunization against Schistosoma japonicum

Previous inoculation of rhesus monkeys with cercariae of the nonhuman strain of Schistosoma japonicum proved to give a rather strong protection against a subsequent challenge with its human strain.     

Vaccination against Schistosoma mansoni with purified surface antigens

Two surface antigens were isolated from young or adult schistosomes by affinity chromatography with monoclonal antibodies. Vaccination with an antigen having a molecular weight of 155,000 gave partial protection against challenge in some batches of mice and in a group of cynomolgus monkeys. Vaccination with an antigen having a molecular weight of 53,000 gave similar levels of protection in mice. The results demonstrate that protection can be obtained with single antigens, but the precise requirements for reproducible vaccination are as yet unknown.     

日本血吸虫SjEA基因的克隆和分析

为获得新的可表达保护性抗原分子的编码基因,以日本血吸虫虫卵抗原免疫血清筛选日本血吸虫虫卵cDNA文库,对获得的阳性克隆进行PCR鉴定并测序后,通过互联网将测序结果进行同源性分析和功能预测．结果发现,筛选到3个与GenBank中SjEA基因(登录号为AB017096)具有100％同源性的阳性克隆．序列分析表明,该基因全长774bp,编码257个氨基酸,编码蛋白的等电点为8．76,相对分子质量为28900;为一非跨膜蛋白,二级结构预测具有2个α-螺旋区,3个β-折叠区,4个无规卷曲区,具有一个称为TonB的PS00430保守区．     

血吸虫疫苗研究现状和发展方向

血吸虫疫苗的研究工作已经进行了很长一段时间,发现了一批有价值的候选疫苗分子。同时通过改进和优化免疫途径,血吸虫疫苗的免疫保护力正在逐步提高。随着研究的日益深入,对血吸虫疫苗的免疫机制等了解更加透彻,距离研制出能诱导高的、稳定的免疫保护力的疫苗分子的目标将越来越近。     

血吸虫疫苗研究现状和发展方向

血吸虫疫苗的研究工作已经进行了很长一段时间,发现了一批有价值的候选疫苗分子。同时通过改进和优化免疫途径,血吸虫疫苗的免疫保护力正在逐步提高。随着研究的日益深入,对血吸虫疫苗的免疫机制等了解更加透彻,距离研制出能诱导高的、稳定的免疫保护力的疫苗分子的目标将越来越近。     

抗曼氏血吸虫童虫单克隆抗体的制备

采用曼氏血吸虫童虫代谢分泌物免疫 Balb/ c小鼠 ,制备了 2株单克隆抗体 ,经鉴定均为 Ig G1.免疫沉淀分析结果显示 ,两株单抗都识别曼氏血吸虫童虫抗原中的 2 0 k D分子 .间接荧光抗体分析表明 ,两株单抗都与曼氏血吸虫 3h龄和 48h龄童虫及成虫表膜呈强阳性反应 ,而不与毛蚴、肺期童虫及虫卵肉芽肿中的虫卵反应 ,并且也不与日本血吸虫、埃及血吸虫和牛血吸虫童虫反应 .结果显示两株单抗具有阶段和种的特异性 .     

日本血吸虫内源性siRNAs的研究

为鉴定日本血吸虫体内是否存在内源性siRNA,采用生物信息学方法对成虫和14d童虫Solexa测序后得到的序列进行了分析,发现成虫和童虫中确实存在内源性siRNAs,而且所占比例和m iRNAs相当,说明内源性siRNAs可能对日本血吸虫基因转录起着重要调控作用。     

植物狼毒大戟对钉螺及血吸虫毛蚴的影响

为了探讨植物狼毒大戟对钉螺及血吸虫毛蚴的影响,分别用大戟科大戟属狼毒大戟根的提取物1与提取物2液萃取物配制成的5.0,2.5,1.25,0.625,0.3125g/L的药液浸杀钉螺及血吸虫毛蚴,并测定了被浸杀钉螺体内糖原与蛋白质的含量,同时检测了该药对水生动物鱼的毒副作用。试验结果显示,狼毒大戟根水煮液在浓度为2.5g/L时经过24h,48h,72h浸杀钉螺的死亡率分别为：36.7%,66.7%,93.3%。而以70%乙醇提取液经过相同时间浸杀钉螺的死亡率分别为：43.3%,86.7%,96.7%。同时被狼毒大戟水煮液浸杀的钉螺体内糖原含量明显下降,减少幅度从9.61%到33.60%,表明狼毒大戟通过影响钉螺的能量代谢而抑制其生长。蛋白质的含量减少不显著。     

日本血吸虫SjELAV-like 1的克隆、表达及功能分析

【目的】克隆和表达日本血吸虫胚胎致死异常视觉基因1（SjELAV-like 1）,分析其在日本血吸虫体内的表达情况及定位,探究该基因对日本血吸虫形态和生殖发育的影响。【方法】利用RACE技术扩增5′/3′末端,获得SjELAV-like 1基因序列提交至NCBI,Gene Bank登录号：MG515727,构建该序列的重组表达质粒 pET28-SjELAV-like 1,并在大肠杆菌BL21中利用IPTG诱导表达,收集不同诱导时间的菌体,SDS-PAGE法进行蛋白电泳。利用His镍柱亲和层析法纯化大量表达所得重组蛋白,用纯化重组蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体,用于Western blotting 分析虫体内该天然蛋白的免疫原性,以及间接免疫荧光检测该蛋白在虫体内的分布情况。小鼠腹部贴片法感染日本血虫尾蚴,收集虫体不同发育阶段混合和合抱分开的雌、雄虫体,以单钉螺逸出的尾蚴感染小鼠获得25 d单性雌、雄虫体,通过实时定量 PCR分析该基因的表达情况。通过尾静脉注射小干扰RNA（siRNA）于感染小鼠体内,使该基因表达沉默,筛选最佳干扰效果的siRNA,用于长期RNA干扰（RNAi）试验,分析其对日本血吸虫雌虫产卵及卵胚孵化的影响。利用扫描电镜和透射电镜观察RNAi对虫体体被结构及雌、雄虫生殖器官的影响。【结果】获得的1 797 bp的SjELAV-like 1基因序列含有poly A尾,其中编码序列为1 533 bp,编码510个氨基酸。重组质粒pET28-SjELAV-like 1在诱导4 h时表达量最高,主要以包涵体的形式存在,利用纯化蛋白获得了优质多抗,获得的重组蛋白具有良好的免疫原性,经分析发现SjELAV-like 1蛋白主要分布在虫体体被。RT-qPCR 发现SjELAV-like 1在不同时期雌、雄虫体内均有表达,在雄虫体内表达稳定,但在雌虫体内随着发育成熟其表达水平呈下降趋势;在不同感染状态的雌、雄虫体内,与正常发育雌虫相比,该基因在发育阻遏雌虫体内高表达,而在雄虫体内无明显差异。RNAi试验中,与NC组相比,长期干扰组小鼠肝减卵率、雌虫对肝卵贡献减少率和卵胚减孵化率分别为58.27%（P＜0.05）、40.59%（P＜0.01）和74.58%（P＜0.01）;电镜观察发现,干扰组虫体体被结构改变,雄虫体表粘附的泡状物消失,立体的褶脊结构塌陷,整齐排列的条索状皮脊变的疏松,网状结构消失,雌虫体壁表面组织间隙增宽,分布于其上的体棘减少、变钝,雄虫精母细胞数目减少,其内的染色质减少,细胞肿大,细胞间质增宽,雌虫卵黄细胞中卵黄球减少,其中包含的卵黄滴也减少,内质网肿大,皮质颗粒排列散乱。【结论】成功克隆和表达了在日本血吸虫发育阻遏雌虫中高表达的部分SjELAV-like 1基因序列,且发现该基因主要在虫体体被表达。该基因沉默使肝脏荷卵数、雌虫对肝卵贡献率和卵胚孵化率均显著降低,并改变虫体体被结构,抑制生殖腺的正常发育,提示该基因对日本血吸虫的生殖发育有重要的作用。