墨兰 CsAP1-A 基因克隆及表达分析

【目的】AP1 基因在植物的花器官发育和开花调控中发挥重要作用，对墨兰 AP1 基因进行克隆与表达分析可为研究其在墨兰花发育和开花调控中的作用提供前期基础。【方法】以墨兰品种‘小香’为材料，克隆到 1 个 AP1 基因，命名为 CsAP1-A。通过生物信息学分析其基因结构、蛋白结构域和进化关系，利用 RT-qPCR 方法分别检测 CsAP1-A 在墨兰不同器官、不同花发育阶段和不同花组织部位的表达情况；通过转录组测序分析 CsAP1-A 在 5 个不同花型墨兰品种花组织部位的表达情况；通过蛋白互作预测软件分析 CsAP1-A 与其他蛋白的互作关系。【结果】CsAP1-A 基因编码区为 744 bp，编码 248 个氨基酸，含有高度保守的 MADS-box 和K-box 结构域，符合 MADS-box 转录因子家族特征。CsAP1-A 与其他兰科植物 AP1 蛋白相似性较高，其中与春兰 AP1/FUL3（APY18447.1）和蕙兰 MADS1（AGE15496.1）的同源性最高。RT-qPCR 分析结果表明，CsAP1-A在墨兰不同器官中均有表达，在花中表达量最高，且集中在花芽分化初期（S1）高表达。在不同花型的墨兰品种中，CsAP1-A 在 WT（普通型）、MPV（重瓣花型）、LaPV（花瓣唇瓣化花型）和 NLV（唇瓣萼片化花型）4 种花型的合蕊柱中表达量均最高，而在萼片中表达量最低；在合蕊柱异常发育的 MPV 中，CsAP1-A 在合蕊柱的表达量显著提高，而在花瓣蕊柱化的梅瓣花型（GPV）中整体表达量最高，且表达区域从合蕊柱扩展到花瓣。蛋白互作预测 CsAP1-A 蛋白可与 MADS1、MADS6、MADS47、MADS8 等 10 个蛋白存在互作关系。【结论】墨兰 CsAP1-A 的基因结构、进化关系、时空表达情况和蛋白互作预测可为墨兰花发育的研究提供理论依据，对进一步揭示 CsAP1-A 基因在墨兰成花过程中的作用奠定基础。     

荷花B类MADS-box基因家族NnDEF基因的克隆及表达分析

以荷花品种'重瓣一丈青'(Nelumbo nucifera‘chongban yizhangqing')为试材,采用同源克隆方法获得2个AP3/DEF同源基因NnDEF1和NnDEF2。NnDEF1基因CDS序列全长678 bp,编码225个氨基酸;NnDEF2基因CDS序列全长693 bp,编码230个氨基酸;2个蛋白的C-末端序列均包含典型的PI衍生基序和PaleoAP3基序。序列比对和系统进化分析表明:NnDEF1和NnDEF2基因属于B功能基因家族AP3/DEF亚家族,2个基因序列的同源性远高于其他物种同源基因,表明荷花进化中可能存在基因加倍事件。表达模式分析显示:NnDEF1和NnDEF2基因表达具有品种间相似性和个体内差异性,NnDEF1倾向于在花瓣和雄蕊组织中表达,在内侧花瓣表达量最高;而NnDEF2则表达较广泛,在茎、叶、萼片、花瓣组织中均有表达,在外轮花瓣组织中表达量最高。基因表达差异表明,NnDEF1基因可能在荷花瓣化现象中发挥作用。上述研究结果可为研究荷花花发育及瓣化现象分子机制奠定基础。     

羽衣甘蓝MADS–box基因BoaAGL6的克隆及表达分析

以羽衣甘蓝(Brassica oleracea var.acephala)野生型及其在选育过程中发现的2种花瓣数量变化的突变体品种为试材,通过RACE方法克隆了AGL6基因的同源基因,命名为BoaAGL6,并用半定量RT–PCR和实时荧光定量PCR分析了BoaAGL6在3种不同花型的羽衣甘蓝各类花器官的表达模式。结果表明:克隆的BoaAGL6基因长999 bp(GenBank登录号为KC984301),开放阅读框长759 bp,编码252个氨基酸;系统发育分析表明,BoaAGL6基因属于AGL6–like进化系;半定量RT–PCR和实时定量RT–PCR结果表明,BoaAGL6基因具有较宽泛的表达区域,在不同花型的花瓣中的表达有所区别,在多瓣花型的花瓣中高丰度表达,有别于在其他2种花型中的中等水平。说明该基因在调控羽衣甘蓝花器官特征属性及形成过程中发挥重要作用。     

梅花PmERF4基因的克隆及其表达分析

为阐明梅花(Prunus mume)ERF基因的功能,采用RT-PCR技术从梅花品种‘雪梅’中克隆获得1个PmERF4基因。生物信息学分析表明该基因cDNA全长序列为842 bp,完整开放阅读框(ORF)为690 bp,编码229个氨基酸。氨基酸序列比对发现,PmERF4蛋白包含1个AP2/ERF保守结构域。系统进化分析结果显示,梅花PmERF4蛋白与李亚科李属植物的ERF蛋白高度同源。利用荧光定量PCR(qRT-PCR)检测PmERF4基因在非生物胁迫和激素处理下的表达,结果表明:PmERF4基因受低温、氧化胁迫的诱导,但响应程度不同,它能够持续且强烈地响应低温胁迫,对甘露醇、MeJA、SA处理不敏感,而高盐和ABA则抑制其表达;PmERF4基因可能在梅花低温胁迫应答中发挥重要作用。     

草莓AP1同源基因的克隆、表达及启动子分析

【目的】从草莓（Fragaria×ananassa）中克隆APETALA1(AP1)同源基因,并分析其在不同组织、器官及不同花发育阶段的表达水平,探讨其在草莓植株成花进程中的作用。【方法】根据其它物种AP1同源基因的保守序列设计简并引物,以草莓幼叶和花芽为试材,克隆得到AP1的基因片段,在此基础上利用RACE的方法分离获得其cDNA全长。利用实时定量RT-PCR分析草莓不同组织、器官及不同花发育阶段中AP1同源基因的表达水平。利用染色体步移的方法分离启动子序列。【结果】从草莓品种‘花姬’中克隆出AP1同源基因的cDNA全长序列,命名为FaAP1;其CDS长度为735 bp,编码245个氨基酸,与玫瑰AP1-1的氨基酸序列同源性最高,达到92%,与拟南芥AtAP1的氨基酸序列同源性为64.00%。FaAP1编码的氨基酸全长序列符合MADS-box基因家族特征,包含MADS-box、I-间插域、K-box域和C-末端几个结构域,是MIKC类型的MADS-box基因家族的成员。实时定量RT-PCR结果表明,在不同组织、不同花器官及不同花发育阶段中FaAP1的表达量存在差异。其启动子除了具有TATA/CAAT-box外还包含一些特异作用元件。【结论】从草莓中分离出的FaAP1基因,在花分生组织形成和花器官发育中有一定的调控作用。     

桂花OfAP1基因的克隆及表达分析

AP1（APETALA1）基因在植物花分生组织及花器官形成过程中发挥着重要作用。以桂花品种‘堰虹桂’Osmanthus fragrans‘Yanhonggui’为材料,根据前期获得的转录组数据中AP1的序列设计引物,利用PCR技术,克隆得到约750 bp桂花AP1 cDNA序列,即OfAP1基因,其中开放阅读框长为720 bp（注册号为MH593222）。氨基酸序列比对发现,与其他物种的AP1基因的同源性高达69%~88%。荧光定量PCR结果表明:在不同组织中,桂花的OfAP1基因在花芽中的表达量显著高于其他组织,根中几乎不表达;在花芽分化过程中,OfAP1在成花转变及花芽分化初期（花瓣、花萼分化期）表达量较高,随后呈下降趋势。这说明OfAP1具有组织表达特异性,同时在桂花成花转变、花芽分化和发育中有重要作用。     

莲NnFUL基因克隆、亚细胞定位及表达分析

为了研究MADS—box A类基因在莲花器官发育中的作用,以莲品种‘大洒锦'(Nelumbo nucifera‘Da sajin')的花蕾为试验材料,利用RT-PCR方法克隆了莲FUL-like基因cDNA序列,命名为NnFUL。NnFUL的cDNA长度为763 bp,其开放阅读框(Open reading frame,ORF)共编码250个氨基酸。该蛋白属于亲水性蛋白,二级结构主要由α-螺旋、无规则卷曲和延伸链组成。系统进化分析表明:NnFUL编码的蛋白与AP1/SQUA亚家族中的FUL-like蛋白聚为一类,与二球悬铃木(Platanus×acerifolia)的FUL-like蛋白具有较高的亲缘关系。亚细胞定位显示该基因位于细胞核中。荧光定量Real-time PCR结果表明:NnFUL在花器官中表达量最高,主要集中在花萼和花瓣中,同时在营养器官中也有表达;因此,NnFUL在花器官发育尤其花萼和花瓣形成中有一定的调控作用。     

山核桃APETALA1同源基因的克隆与序列分析

根据植物花分生组织及花器官形成过程中起重要作用的APETALA1（AP1）基因的高度保守区序列,设计合成一对长度为23bp的聚合酶链式反应（PCR）引物,以山核桃Carya cathayensis因组DNA为模板,采用PCR方法扩增出长为486bp的DNA片段,克隆到pMD18-T载体。测序和序列分析结果表明,获得了山核桃AP1同源基因中的1个片段,该片段序列包含2个内含子,长度分别为86bp和291bp,编码区共编码36个氨基酸。其序列已在Gen荷Bank中注册（注册号为EU155118）,在Gen Bank中进行同源性检索结果表明,其氨基酸序列与其他植物AP1同源基因的氨基酸序列同源性高达69％～88％,推测它们在功能上也是相似的。     

葡萄风信子FLS1基因克隆及其表达与花色性状之间的关联性分析

黄酮醇合成酶(flavonol synthase,FLS)是类黄酮合成分支路口重要的节点酶。FLS基因的表达不仅影响着黄酮醇合成,也影响着花青素苷积累和花色呈现。本研究采用PCR技术从葡萄风信子‘白丽人’中克隆到一条FLS基因(MaFLS1)。序列分析表明,MaFLS1cDNA全长1 152bp,编码383个氨基酸。同源比对及进化分析表明,MaFLS1属于2-酮戊二酸与Fe+2依赖型双加氧酶蛋白,具有典型的FLS蛋白功能域、DHQ底物特异结合位点、Fe2+和2-酮戊二酸绑定位点;MaFLS1与海枣、油棕的FLS同源性最高,可达74%~75%,与拟南芥、矮牵牛等模式植物亲缘关系较远。荧光定量PCR分析发现,MaFLS1基因在葡萄风信子中为非组织特异性表达模式,其根中表达量最高,鳞茎及花中的表达量其次,叶片中表达量最低;MaFLS1在3个不同花色的葡萄风信子品种5个不同花发育时期表达差异显著,在白色品种‘白丽人’花发育的早期(S1和S2)时期表达较高,粉色品种‘粉日出’和蓝色品种‘亚美尼亚’晚期(S3和S4)表达量最高。本研究为进一步探讨葡萄风信子FLS基因在花色呈现中的功能及黄酮醇支路的分流竞争对花色的影响提供基因资源和依据。     

‘凤丹’牡丹PoERF113基因的克隆及表达分析

为克隆‘凤丹’(Paeonia ostii)花瓣衰老相关基因PoERF113的序列,分析其编码蛋白性质,探索其在不同发育时期花瓣、不同组织和不同品种的表达模式及对乙烯的响应,采用RT–PCR技术,从‘凤丹’牡丹中克隆到花瓣衰老相关基因PoERF113。该基因属于AP2/ERF家族,其开放阅读框(ORF)为636 bp,编码1个由211个氨基酸残基组成的蛋白,含有1个AP2保守结构域,不包含跨膜结构,蛋白相对分子质量约为53 000,理论等电点(pI)为5.13,为不稳定蛋白,具有亲水性;qRT–PCR分析结果表明,PoERF113基因在露色期、初开期、半开期、盛开期、始衰期、衰败期均有表达,主要在‘凤丹’露色期的花瓣和叶片中表达;在早花‘凤丹’突变株系中表达量最高;PoERF113基因在早花‘凤丹’突变株系与‘凤丹’中的序列相同,不存在碱基差异;PoERF113基因对乙烯有响应,其表达量随处理时间和生育进程的延长呈逐渐升高的趋势,推测该基因可能与乙烯诱导后导致花衰老进程相关。     

AP2基因在高等植物花器官发育中的作用概述

以植物花发育调控的分子模型为基础,介绍了花发育相关基因AP2在高等植物花器官和营养组织中的时空表达特点,以及参与花分生特性建立、花器官特性特化和形成调节、花同源异型基因活性时空调节等花发育过程;阐述了模式植物中与AP2基因一起参与花发育调控的其他基因,及其在基因调控网络中的关系。     

梅花PmCBFa基因的克隆与序列分析

为了找到梅花抗寒关键基因,进一步了解梅花的抗寒分子机理,在分析了NCBI核苷酸数据库中已公布的CBF/DREB1同源基因序列基础上,通过基因同源克隆结合RACE技术,在‘雪梅’花蕾cDNA文库以及‘雪梅’gDNA中均成功扩增得到梅花的1个CBF/DREB1类基因,命名为PmCBFa。该基因CDS区全长845bp,编码231个氨基酸。经核苷酸序列分析、预测编码氨基酸序列比对分析以及编码蛋白系统进化树分析表明,该基因编码的蛋白具有CBF/DREB1类转录因子保守的AP2结构域及其两翼结构序列,且与桃的DREB1同源蛋白同源性最高。该研究结果为后续PmCBFa基因在梅花抗寒分子机理的研究中提供了理论依据,为梅花抗寒育种开辟了新的途径。     

荔枝‘妃子笑’AP2同源基因的克隆及表达

根据笔者课题组荔枝基因组数据库,从‘妃子笑’荔枝中克隆了1个AP2同源基因LcANT,其cDNA全长2 087 bp,编码695个氨基酸,含有2个保守的AP2/EREBP结构域。生物信息学分析结果表明,LcANT含有7个内含子,亚细胞定位预测于细胞核,LcANT蛋白为疏水性蛋白,二级结构多为无规则卷曲。通过BLAST比对发现,LcANT与许多植物的ANT转录因子具有高度同源性,与开心果相似度最高,高达82%。利用q?PCR,对LcANT在‘妃子笑’荔枝中的表达模式进行了表征,发现其在春梢、秋梢和花序中表达量较高,暗示其可能参与调控花器官及其他植物营养器官的发育。LcANT基因的获得为后续研究其对荔枝营养器官生长发育的调控作用奠定了基础。     

日本晚樱同源异型基因PrseAP3的克隆及其在单瓣与重瓣花中的表达分析

用同源克隆的方法和3′RACE技术,从日本晚樱(Prunus lannesiana)中分离得到了1个AP3同源基因PrseAP3的cDNA全长,GenBank登录号为JF710371。其cDNA全长977bp,包括1个编码235个氨基酸共708bp的开放阅读框。序列比对和分子系统发生分析表明,PrseAP3是拟南芥的AP3同源基因,其蛋白质的C末端具有2个保守基元:PI-derived模体和paleoAP3模体,属B类转录因子中paleoAP3进化系。半定量RT-PCR分析表明,PrseAP3主要在单瓣日本晚樱品种大岛的萼片、花瓣和雄蕊中表达;在重瓣品种一叶的花瓣、雄蕊和叶化心皮中表达。其表达组织特异性在2个品种间表现出明显的差异,并与拟南芥的AP3基因有一定的差别。     

果梅PmKNAT2基因全长cDNA克隆及表达分析

【目的】从‘大嵌蒂’果梅中克隆PmKNAT2,并对其结构特征及表达模式进行分析,为研究果梅雌蕊败育的分子机理和分子育种奠定基础。【方法】在NCBI中查找与果梅相似性很高的桃KNOPE2（KNAT2的同源基因）序列（EF093491）,根据桃的KNOPE2序列设计特异引物;采用改良CTAB法提取‘大嵌蒂’果梅花芽总RNA;通过RT-PCR和RACE技术获得基因cDNA序列全长;使用DNAMAN软件进行序列拼接;利用NCBI数据库中的BLASTn和BLASTp程序进行相似性分析;通过生物信息学方法分析结构特征;用DNAMAN软件分析基因的ORF和氨基酸序列;MEGA4.0软件进行系统进化树的构建;利用Bioxm2.6推测分析蛋白分子量和等电点;根据NCBI中Conserved Domains程序进行蛋白质保守域结构预测;用ExPaSy提供的在线SOPMA程序进行蛋白质二级结构预测;构建PJIT166-PmKNAT2-GFP的融合亚细胞定位表达载体,采用基因枪法转化洋葱表皮细胞,经暗培养后在激光共聚焦显微镜下观察;利用实时荧光定量RT-PCR研究其表达模式,分析其在‘大嵌蒂’花芽发育不同时期、不同器官中的表达特性。【结果】在‘大嵌蒂’果梅中获得一个KNAT2的同源基因,命名为PmKNAT2,其cDNA全长为1 402 bp,5'UTR 47 bp,3'UTR 293 bp,编码区全长为1 062 bp,编码353个氨基酸,预测蛋白质分子量为40.41 kD,理论等电点为4.85。蛋白结构分析表明该基因编码的氨基酸具有2个结构域,MEINOX结构域（KNOXⅠ和KNOXⅡ 2个亚结构域）和HD（homomeodomain）结构域,属于KNOX蛋白;相似性分析发现该基因与GenBank中其它来源的KNOX蛋白序列的相似性为50%-100%;系统进化树分析显示果梅PmKNAT2与桃KNOX聚为一类,表明与其亲缘关系最近。二级结构预测结果表明PmKNAT2所编码蛋白由47.14%的α-螺旋（Alpha helix）、3.43%的β-转角（Beta turn）、3.14的β-折叠（Extended strand ）和46.29%的随机卷曲（Random coil）组成。亚细胞定位结果显示该基因编码的蛋白定位于细胞核和细胞膜中。实时荧光定量RT-PCR分析表明,在‘大嵌蒂’果梅不同时期花芽中PmKNAT2的表达量存在一定差异,PmKNAT2在11月份的表达量最高,9月、10月和11月的表达量差异不明显,但与12月和1月花芽中的表达量差异明显;生长素在1月份含量最高,9、10、11月份差异不明显,其含量变化趋势与PmKNAT2表达趋势相反。对该基因表达量最高的11月份的花芽进行实时荧光定量分析发现：PmKNAT2在各种花芽中均有表达,在不完全花（雌蕊褐色、雌蕊畸形和无雌蕊）中的表达量高于完全花（雌蕊正常）。进一步分析PmKNAT2在完全花与不完全花的不同花器官中的表达量,结果表明PmKNAT2在完全花与不完全花的各部位的表达量趋势相似均为：萼片>雄蕊>花瓣,在完全花雌蕊中的表达量最低。【结论】推测PmKNAT2在雌蕊发育阶段的异常表达可能与‘大嵌蒂’果梅雌蕊败育有关。     

自然背景下的梅花图像分割算法研究

针对梅花数据的特点,提出一种基于自然背景下的梅花花朵分割算法TC(Texture Color)。该算法综合运用了分形纹理和颜色2种特征,有效分割背景图像中的干扰物,实现梅花图像分割。首先,采用双毯子方法计算图像的局部分形维数图,并对分形维数图采用大津阈值分割去除背景中大部分的干扰物;然后,利用颜色特征对剩余的干扰物进行有效分割。在采用颜色特征进行分割时,改进了色度直方图累加算法,并融合了饱和度特征,取得了很好的分割效果。在分割过程中,算法还采取了形态学操作、去噪和填充等处理技术,得到最终的分割结果。对9种梅花图像（每种20幅,共180幅）进行了分割实验,采用误分率对实验结果进行评价,并分别和2RGB模型分割方法、GrabCut算法进行了实验对比。实验结果表明:TC算法平均误分率控制在3%之内,比2RGB模型分割方法更加有效,并且该算法所耗费的时间比GrabCut算法要少很多而且无需人工交互。因此,本文提出的TC算法针对梅花图像的分割是非常有效的。      

不同类型梅花品种及近缘种山桃挥发性成分分析

[目的]研究不同类型梅花品种及山桃花朵挥发性成分的差异。[方法]采用顶空-固相微萃取与气相色谱-质谱联用技术对梅花品种青岛朱砂、黑美人、丰后、淡丰后、燕杏梅和山桃花朵挥发性成分进行分析。[结果]从几种植物中共鉴定出20种挥发物。不同类型梅花品种及山桃植物花朵挥发物数量和含量有很大的变化,苯基/苯丙烷类芳香族的化合物含量占有绝对的优势,其中苯甲醛、苯甲醇和乙酸苯甲酯等是梅花及山桃花朵挥发物的主要成分,出现的频率高达100%。[结论]为开发利用梅花香气资源和花香育种提供了科学依据。     

青花菜BoBURP1基因的克隆与表达分析

BURP是一类存在于植物中的特有蛋白,在生长发育和逆境响应等方面起重要作用。试验从青花菜中克隆到一个BURP基因,命名为BoBURP1,在生物信息学分析的基础上,用RT-PCR研究了它在不同器官中的表达模式。研究结果表明,BoBURP1的基因组DNA全长2 030 bp,具2个内含子;编码区全长为1 872 bp,编码623个氨基酸;推导的蛋白质分子量为70.795 6 ku,等电点为8.65。系统发育分析结果表明,BoBURP1与12种不同植物的同源蛋白可分为3组,BoBURP1与十字花科植物同源序列的相似性最高,在进化树上聚为一组。RT-PCR结果表明,BoBURP1在根、茎、叶、花蕾、花和角果中均有表达,叶、花蕾和花的表达量最高,而根和茎中的表达量最低。     

洋葱花器官B类MADS-box基因AcPI的克隆及表达分析

【目的】克隆洋葱花器官B类PI/GLO家族MADS-box基因,分析其序列特征及时空表达模式,为探讨其在洋葱花发育过程中的分子遗传机制奠定基础。【方法】以洋葱花蕾总RNA为模板,根据同源克隆策略设计简并引物,利用RT-PCR结合RACE技术,获得AcPI的全长cDNA序列。用生物信息学方法对其基因序列特征进行分析;利用RT-PCR和Real-time PCR分析AcPI在花蕾整个生长过程中的时空表达模式。【结果】克隆获得洋葱AcPI基因（GenBank登录号：JX679083）的cDNA全长931 bp,包含615 bp的完整开放阅读框,编码205个氨基酸。蛋白分析表明,AcPI蛋白具有植物MADS-box蛋白典型的MADS和K结构域;与水仙的NTPI、风信子的HoMADS2有78%、75%的相似性,与金鱼草的GLO也有52%的相似性。系统进化树分析表明,AcPI属于B类MADS-box蛋白家族的PI亚家族。RT-PCR表达分析表明,AcPI只在生殖器官花蕾中表达,但主要在花的第一、二、三轮花器官中表达,而在营养组织根、茎和叶中不表达。Real-time PCR进一步分析表明,AcPI在花芽整个生长过程中,在心皮中微弱表达,但表达丰度呈递增趋势;而在外轮被片、内轮被片和雄蕊中强烈表达,其表达丰度除了在外轮被片中呈先增后减的趋势外,在内轮被片和雄蕊中都呈递增趋势。【结论】AcPI在洋葱第一轮花器官中的表达支持了van Tunen提出的修正的ABC模型;但AcPI在洋葱第四轮花器官中也有表达,这表明AcPI除了调控外轮被片、内轮被片和雄蕊发育外,还可能在心皮的形成发育过程中起着重要作用。