产L-丝氨酸的甲醇利用菌MB119的筛选与鉴定

经过富集培养,从沼气池残渣中筛选到一株可利用甲醇为唯一碳源生长的细菌(MB119),该菌革兰氏染色为阴性,短杆状。经过培养条件的优化发现,该菌的最佳培养温度为28~32°C,最佳生长的甲醇浓度为0.5%,最适pH值为7.0。16S rDNA序列比对分析发现,与Methylobacterium sp.的部分16S rDNA同源性达99%。结合其一些生理特性,将该菌初步鉴定为Methylobacterium属。利用不同碳源对MB119进行培养,发现,该菌同其他甲基菌一样,能利用甲醇以及一些多碳化合物进行生长,但MB119不能利用其他甲基化合物(如甲醛、甲酸等)作为唯一碳源。利用静息细胞反应,发现该菌能产2.6 mg/mL的L-丝氨酸。     

青枯病生防菌蜡状芽孢杆菌（ANTI-8098A）的绿色荧光蛋白基因（gfp）转导及其生物学特性的变化

采用质粒pCM20进行青枯病生防菌蜡状芽孢杆菌(Bacillus ceFeus,ANTI-8098A)的电击转化,对电击转化条件的优化结果表明,当电击条件为2.5 kV,200Ω,25μF时,转化的最佳条件为质粒DNA含量118 ng,感受态细胞浓度为1.14×108CFU/mL.转化子ANTI-8098A:pCM20在无红霉素选择压力的LB培养基转接16次后,绿色荧光的表达仍为100%.对其生长曲线的测定结果表明,青枯病生防菌ANTI-8098A的生长速度和ANTI-8098A:pCM20基本一致.不同培养温度和培养转速对ANTI-8098A:pCM20生长的影响较大,当培养温度为35℃时,ANTI-8098A:pCM20的含量为60.0×108 CFU/mL,当培养转速为250 r/min时,ANTI-8098A:pCM20的含菌量为50.33×108CFU/mL.青枯病生防菌ANT18098A:pCM20和ANT18098A对不同作物分离的青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)具有明显的抑制作用,抑菌效果无显著差异.     

重组大肠杆菌表达降氰酶的诱导条件优化

采用积分光密度法对产碱杆菌（Alcaligenes sp.）降氰酶基因在大肠杆菌中的高效表达进行了诱导条件优化,以工程菌BL21（DE3）-pET28a-cdE的诱导表达条件进行优化,以提高目的蛋白的产量和活性。结果显示,重组菌表达降氰酶的最佳诱导条件为温度28℃,初始菌体浓度OD600值为0.6,IPTG浓度为0.8mmol/L,诱导时间12h。研究发现,诱导剂的添加浓度对外源蛋白的表达水平具有显著影响,使用终浓度为0.8mmol/L的IPTG,诱导表达12h,降氰酶蛋白收率达到143.27mg/L,比活力达到11560 U/mg。与不添加诱导剂相比,重组蛋白的收率和比活力分别提高了64倍和9倍。     

响应面法优化重组枯草芽孢杆菌产脂肪氧合酶条件

采用Plackett-Burman设计法,对影响重组枯草芽孢杆菌发酵产脂肪氧合酶的7个相关因子进行筛选,并建立枯草芽孢杆菌产脂肪氧合酶的最佳工艺。结果表明对重组菌发酵产酶具有显著影响的因子是乳糖、发酵时间和发酵温度。依据Plackett-Burman设计法的筛选结果,进一步采用响应面中心组合设计(Central Composite Design)对显著影响因子的最佳水平和交互作用进行研究,通过模型方程的3-D图和等高线图发现,当乳糖浓度为16.9g/L、发酵时间为88.49 h、发酵温度为29.71℃和装液量为61.31ml时,出现酶活最大预测值164.90 U/ml,验证试验证实了在上述条件下得出的酶活为167.32U/ml,与预测值高度吻合。优化后的培养基和培养条件使得重组脂肪氧合酶产量较优化前提高了2.37倍。     

弹性蛋白酶基因的克隆及在毕赤酵母中的表达

本研究以一株产弹性蛋白酶的铜绿假单胞菌基因组DNA为模板,经PCR扩增得到的弹性蛋白基因,与GenBank中的序列对比发现同源性为99%。将弹性蛋白酶基因连入到表达载体pPIC3.5K中,经过酶切和测序鉴定证实弹性蛋白酶基因已插入到载体启动子下游,成功构建了质粒pPIC3.5K/PAE。将pPIC3.5K/PAE线性化,通过电转化将目的基因转入毕赤酵母KM71中,利用MD培养基筛选到近400个转化子,再经G418抗性的筛选,获得48株含高拷贝的重组毕赤酵母转化子并用PCR和弹性蛋白平板验证。经过甲醇诱导表达得到高表达的重组酵母菌株,酶活为1060U/mL是出发菌株的26倍。本研究成功克隆到铜绿假单胞菌弹性蛋白酶基因,为实现活性弹性蛋白酶的高效表达奠定了基础。     

黑胸散白蚁体内产纤维素酶细菌的筛选及其纤维素酶基因的鉴定与原核表达

白蚁(Isoptera)常以富含纤维素的木材为食,体内存在纤维素酶产生菌。从源于陕西佛坪的白蚁(经鉴定为黑胸散白蚁(Reticulitermes chinensis))体内筛选出了4株产纤维素酶菌株,采用单因素实验设计对酶活最高的菌株进行了产酶条件优化,并对其所产纤维素酶进行了酶学性质研究;同时,依据NCBI数据库设计的引物扩增出了该菌株的内切-β-1,4-葡聚糖酶基因Cbs和β-葡萄糖苷酶基因Ba G,之后在大肠杆菌(Escherichia coli)中进行了表达实验。结果表明:从黑胸散白蚁体内筛选出4株菌分别是阿氏肠杆菌(Enterobacter asburiae)、炭疽芽胞杆菌(Bacillus cereus)、枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)、解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens),其中枯草芽胞杆菌所产纤维素酶的活力最高,该菌发酵产酶的最适温度和pH分别是42℃、6.5,酶促反应的最适温度和pH分别是70℃、4.5,在此条件下该菌株酶活力为2.36 U/mL。该菌株所产的纤维素酶在50℃、pH 6.5的条件下热稳定性和pH稳定性最佳,使用该菌株所产的粗酶液发酵粗饲料,结果发现其对玉米(Zea mays)秸秆、小麦(Triticum aestivum)秸秆、苜蓿(Medicago polymorpha)干草和青贮饲料的粗纤维降解率分别为12.21%、1.3%、3.24%和17.42%。基因克隆结果表明该菌株具有Ba G、Cbs 2个纤维素酶基因,且大肠杆菌表达结果显示Ba G基因的粗酶液pro Ba G无纤维素酶活性,而Cbs基因的粗酶液pro Cbs在60℃、pH 5.0时酶活可达4.14 U/mL,将Ba G和Cbs基因进行原核融合表达,产生的蛋白约35 k D,其在最适条件70℃、pH 4.5时的酶活为4.57 U/mL,说明无纤维素酶活性的Ba G基因与Cbs基因融合后可能表达出了一个活性更高的纤维素酶蛋白。本研究对后期构建可降解木质纤维素的人工重组菌具有重要的理论价值。     

高产琥珀酸产生菌的60Co γ射线诱变选育

 产琥珀酸放线杆菌的主要副产物是乙酸,为了有效降低乙酸的生成,采用60Co γ射线为诱变源,反复筛选氟乙酸抗性突变株。结果表明,当60Co γ射线诱变剂量为 500 Gy 以及氟乙酸浓度为 20 g/l 时,与出发菌株相比,所获突变株HF417的乙酸浓度由25.7 g/l降低到4.5g/l,琥珀酸由45g/l增加到67g/l,磷乙酰转移酶最高酶活由528U/mg 降低到112U/mg ,进一步的基因序列分析表明,pta 基因（磷乙酰转移酶基因）片段保守序列中发生的 4 处突变,是导致磷乙酰转移酶酶活降低的根本原因。因此,针对副产物代谢途径的定向阻断选育能够有效提高琥珀酸产量。     

弹性蛋白酶基因(PAE)的克隆及在毕赤酵母中的表达

以1株产弹性蛋白酶的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)基因组DNA为模板,经PCR扩增得到的铜绿假单胞菌弹性蛋白酶(P.acruginosa elastase,PAE)基因,与GenBank中的序列对比发现同源性为99%.成功地构建了重组表达载体pPIC3.5K/PAE,莺组质粒Sac Ⅰ线性化后转化毕赤酵母(Pichia pastoris)菌株KM71中,通过PCR和表型鉴定表明,PAE基因已经整合到毕赤酵母染色体上.经大量筛选获得48株含高拷贝的重组毕赤酵母转化子.在甲醇诱导下,经过毕赤酵母高密度发酵进行PAE的表达,经SDS-PAGE分析.结果表明,在培养基上清中含有一明显特异性蛋白条带,大小为34kD.活性检测结果,酶活为1 060 U/mL,是出发菌株的26倍.     

泡菜中乳酸菌活菌的EMA结合定量PCR检测方法的建立

泡菜中乳酸菌(Lactobacillus plantarum)活菌的数量是评价其营养价值的重要指标.DNA染料(Ethidium bromide monoazide,EMA)结合定量PCR(EMA-qPCR)是一种定量活细胞快速有效的方法.本研究建立了快速精准的检测泡菜中乳酸菌活菌的EMA-qPCR方法.对于乳酸菌死菌,EMA浓度为10μg/mL时,△Ct值(经EMA处理-未经EMA处理)最大,而乳酸菌的△Ct值在不同EMA浓度下(10,25,50和l00 μg/mL)没有显著差异(P＞0.05).并且,随着10 μg/mL EMA的光活化时间由0 min增加到20 min,△Ct信也随之增加,但是这种现象没有在活细胞中产生,所以EMA处理不会影响活细胞计数.因此最适宜的EMA处理条件(10 μg/mL,光照20min)可以有效的区分乳酸菌活细胞和死细胞.在此条件下EMA-qPCR方法(活乳酸菌数量分别为109、108、107、106、105和104 CFU/mL)与平板计数法的检测结果相关性良好(R2=0.999),PCR效率为104％.由于泡菜中乳酸菌随着发酵时间延长会出现亚致死性损伤,EMA-qPCR方法会低估活菌的数量,在检测前将菌体在MRS培养基中孵育30 min会完全消除这种偏差.本实验建立的EMA-qPCR方法,可成功地检测不同发酵时间泡菜中乳酸菌活菌的数量.通过摸索适宜条件,这种检测死活菌的方法可应用到更多的食品与环境检测中.     

耐碱锰超氧化物歧化酶基因(Mn-sodA)工程菌的构建及其表达条件

从Bacillus sp.110-2基因组上分离得到的耐碱锰超氧化物歧化酶基因(Mn-sodA),将其连接到原核表达载体pET-30a(+),得到重组载体pET-sodA,重组载体在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导得到表达.SDS-PAGE分析显示,融合表达产物的分子量大小为26.5 kD.对含有sodA基因工程菌的表达情况研究表明,重组蛋白全部以可溶性形式存在;重组酶的比活力252 U/mg,为原始菌株的2.1倍,目的基因在大肠杆菌中实现了高效表达;而且,重组酶还保留了野生型酶强的耐碱能力.BL21(pET-sodA)基因工程菌的构建提供了一种可利用的耐碱蛋白资源,同时探索了一种极端酶的生产方法.     

产β-甘露聚糖酶内生菌的诱变育种及产酶条件优化

以刺槐豆内生菌Paenibacillus sp.CH-3为出发菌株,采用紫外-硫酸二乙酯-亚硝酸盐对其进行复合诱变,并对菌株的发酵条件进行了优化。结果表明：经过紫外线-硫酸二乙酯-亚硝酸盐复合诱变,获得一株高产β-甘露聚糖酶的突变菌株Paenibacillus sp.CH3-05,其酶活力为160.2U/mL,较出发菌株（42U/mL）提高了281.4%。其最佳发酵培养基为：酵母膏0.25%,魔芋粉3%,磷酸氢二铵0.25%,氯化钠0.1%,硫酸镁0.3%,磷酸氢二钾0.2%,CaCl22 mmol/L。最佳发酵条件为：初始pH 6.5,接种量2%,培养温度35℃,转速200 r/min,培养时间78 h,在该条件下测得酶活为233.5 U/mL,较出发菌株提高456%。     

麻疯树对镉胁迫的生理耐性及富集特征研究

研究了不同Cd浓度（0、10、25、50、100、200mg.kg-1）对麻疯树的生理指标和Cd积累特征的影响。结果表明,在土壤中的Cd≤50mg.kg-1时,麻疯树的生长未受到明显影响（P〉0.05）,当Cd≥100mg.kg-1时,其生长受到明显抑制（P〈0.05）;同时,麻疯树叶中叶绿素含量随土壤中Cd浓度的增加而下降,而其体内Cd含量则呈增加趋势,且表现根〉茎〉叶的富集特征;麻疯树叶中的SOD、POD活性随Cd浓度的增加呈先升高后降低趋势,而CAT活性仅在Cd为200mg.kg-1时显著增加,麻疯树叶中的MDA、脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白、酸溶性巯基和谷胱甘肽含量随Cd浓度的增大呈增加趋势,这可在一定程度上缓解金属Cd对麻疯树的毒害。因此,麻疯树在重金属镉污染土壤修复方面具有一定的应用潜能。     

大蒜废弃物对农作物病原菌的抑制效果

我国大蒜废弃物资源丰富,为引导其合理化、资源化利用,测定了大蒜提取物对大豆尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum fsp.tracheiphilum）、油菜菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum（Lib.）d eBary）、大豆细菌性斑点病菌（Pseudomonas.s yringae pv.glycinea）和水稻白叶枯病菌（Xanthomonas oryzae pv.oryzae〔Ishiyama〕Dye,Xoo）4种植物病原菌的抑制作用,并通过大蒜提取物、大蒜渣、大蒜肥对土壤中大豆尖孢镰刀菌的抑制试验,测定了其在土壤中对土传病原菌的抑制效果。结果表明,高浓度的大蒜提取物对这4种植物病原菌有抑制作用,随着提取物浓度的升高,抑菌效果也更为明显。质量浓度为500mg.mL-1时对大豆尖孢镰刀菌、大豆细菌性斑点病菌和水稻白叶枯病菌的抑菌效果最好。培养基中提取物浓度达100mg.mL-1时对两种真菌的抑制达100%。同时,含大蒜提取物0.05mL.g-1、大蒜渣5%或大蒜肥25%的土壤能抑制土传病原菌大豆尖孢镰刀菌在土壤中的定殖。     

商陆根部多糖的分离、纯化及其体外抗氧化活性

本研究从商陆根部提取分离出商陆多糖,并对该多糖含量进行测定及体外抗氧化活性研究。商陆根部经石油醚回流脱脂、热水抽提、脱色、乙醇沉淀等处理可从中提取出粗多糖。多糖经三氯乙酸脱蛋白纯化,再分别以考马斯亮蓝法和蒽酮-硫酸法测定其蛋白质含量和糖含量,并通过采用清除羟自由基和超氧自由基能力测定法、β-胡萝卜素-亚油酸法,以抗坏血酸（Vc）为对照,来分析粗多糖和纯多糖的体外抗氧化能力。采用水提法提取的粗多糖,含有10.69%的蛋白质和60.91%的多糖;纯化后的多糖糖含量达到91.04%。商陆粗多糖、纯多糖及Vc对羟自由基（·OH）清除率的IC50分别是1.26mg/mL、4.78mg/mL和0.224mg/mL;对超氧自由基（O2-·）清除率的IC50分别为1.91mg/mL、2.28mg/mL和0.123mg/mL;对β-胡萝卜素-亚油酸体系的抑制作用的IC50分别为0.471mg/mL、0.692mg/mL和0.379mg/mL。实验结果表明商陆多糖是一种较好的抗氧化剂,可作为潜在天然抗氧化剂应用于食品和医药工业中。     

磷、硒配施对冬小麦硒吸收及土壤硒形态转化的影响

为研究磷硒配施对冬小麦根土界面硒有效性及形态分级的影响,并探究磷硒配施提高土壤硒有效性的可能机制,以冬小麦为试验材料进行根箱培养试验,设置0(P0)、80(P80)、160 mg·kg^-1(P160)3个磷水平和0(Se0)、1 mg·kg^-1(Se1)2个硒水平,分析冬小麦植株磷硒含量、累积量、迁移系数及根际和非根际土5种硒形态含量。结果表明,无论施硒与否,随着磷含量的增加,冬小麦生物量、地上部和根系磷含量均增大。施硒1 mg·kg^-1显著降低了P80和P160水平下冬小麦生物量、P160水平下根系磷含量及各部位磷累积量。在Se1条件下,施磷增加了各部位硒累积量,但显著降低了地上部硒含量和硒从根系向地上部的迁移系数。在Se0条件下,P160处理增加了根际土壤和非根际土壤中的可交换态硒含量。在Se1条件下,P160处理根际土壤中可交换态硒含量显著高于非根际土壤,但铁锰氧化物结合态硒和残渣态硒含量低于非根际土壤。综上所述,适宜的磷硒配施可影响土壤中各种硒形态的转化过程,可能是由于磷的施入和根系活动共同作用促进了土壤中铁锰氧...     

离子液体[C_2mim][Val]对小麦幼苗生长及生理特性的影响

采用实验室营养液水培方法,主要研究了离子液体1-甲基-3-乙基-咪唑缬氨酸盐（[C2mim][Val]）对小麦幼苗生长及叶片保护酶活性的影响。结果表明,就小麦种子发芽这一生态毒理指标而言,[C2mim][Val]浓度为200～500mg·L-1时其发芽率显著降低;从生长角度来看,小麦幼苗对100～200mg·L-1浓度的处理不敏感,生长指标没有显著变化,在300～500mg·L-1处理下,小麦幼苗地上部及地下部生物量、株高、根长发生显著变化,均受到明显的抑制,且抑制效应具有典型的剂量依赖型特点。不同浓度[C2mim][Val]处理均致使超氧化物歧化酶（SOD）活性下降,且浓度越高抑制作用越明显;100～200mg·L-1浓度处理在8～13d过氧化物酶（POD）活性高于对照,后期不显著,300～500mg·L-1浓度胁迫后期（18d）,其活性均发生显著的变化,分别为对照的84%、83%、74%,并造成膜脂过氧化产物丙二醛（MDA）含量升高,表明300～500mg·L-1浓度胁迫使植物生长受到抑制。[C2mim][Val]的亲水性及亲脂特性可能是其对植物存在潜在毒性的2个主要原因。     

水分和铅交互胁迫对国槐幼苗生理生化特性的影响

为了探讨在水分和铅交互胁迫条件下,国槐（SophorajaponicaL．）幼苗抗氧化酶系统活性及渗透调节物质含量的变化,采用盆栽实验,研究不同水分处理（土壤相对含水率为40％、60％、80％、100％）及5个铅胁迫水平（0、300、500、1000、2000mg‘kg。）交互作用对抗氧化酶活性、MDA含量、可溶性糖含量和脯氨酸含量的影响。结果表明：在水分和铅的交互胁迫下,国槐幼苗叶片POD、SOD酶活性表现先升后降的趋势,与单一的水分胁迫、铅胁迫相比,交互作用对SOD、POD活性的影响规律性不明显,在一定程度上表现出协同或拮抗效应;随着水分胁迫的加剧和铅胁迫的增大,国槐幼苗叶片的MDA含量变化呈现升高的趋势。在铅含量〈2000mg·k^-1条件下,交互胁迫的国槐幼苗叶片MDA含量低于单一水分胁迫处理,表明国槐在交互胁迫下受到的膜伤害比单一水分胁迫下受到的膜伤害小;国槐幼苗叶片可溶性糖含量对水分胁迫较不敏感,且随着水分胁迫的加剧和铅胁迫的增加,叶片可溶性糖含量的变化比较复杂,但总体上呈先升后降的趋势;在铅含量500mg·kg。和40％水分胁迫处理下,可溶性糖含量显著高于对照（P〈0．01）,MDA含量与对照无明显差异;随着水分胁迫的加剧和铅胁迫的增大,脯氨酸含量逐渐升高;在40％水分胁迫下,重金属铅和水分胁迫对叶片中脯氨酸的积累有协同促进作用。适当的交互胁迫（铅含量300、500mg·kg。和40％水分处理）有利于提高国槐的抗逆性。     

N、P、K肥对玉米幼苗吸收和积累重金属的影响

采用室内盆栽试验,研究复合污染土壤中施加氮肥（NH4Cl）、磷肥（Na2HPO4）和钾肥（KCl）对高生物量经济作物玉米（Zeamays L.）幼苗生长以及吸收和积累重金属的影响。结果表明,不同施肥方式和浓度处理对玉米生物量变化以及吸收重金属有不同影响,NH4Cl能显著提高玉米地上部生物量、土壤Pb、Cd有效态含量,增加玉米对重金属Pb、Cd、As的提取量,最大分别可提高1.7、2.0倍和1.2倍。不同施肥方式和处理浓度均显著影响土壤有效态Pb含量,Na2HPO4在中浓度处理时显著降低土壤Pb的有效性,高浓度时则显著增加土壤有效态As含量,使玉米地上部对As的积累量有明显提高。在不同的浓度水平下,钾肥处理使玉米提取Pb含量显著高于氮肥和磷肥,其中低浓度KCl处理使玉米提取Pb量比对照增加2.4倍。对Pb-Cd-As复合污染农田土壤来说,施用氮肥（NH4Cl）处理对强化玉米的修复效果最好。     

农业废弃物核桃壳粉对Cr（Ⅵ）的吸附特征研究

以核桃壳粉为吸附剂，通过批试验探讨了体系初始pH值、吸附剂用量、温度等因素对水溶液中Cr（Ⅵ）吸附的影响，并讨论了吸附过程中Cr的化学形态变化和吸附过程的热力学特征。结果表明，核桃壳粉对Cr（Ⅵ）的吸附最佳pH为1．0。向50mL50mg·L^-1的Cr（Ⅵ）溶液中加入0．5g核桃壳粉，对溶液中Cr（Ⅵ）的去除可达95．39％，吸附过程伴随着氧化还原反应的发生；随着体系温度的升高，核桃壳粉对Cr（Ⅵ）的吸附量增加，吸附过程符合二级动力学过程，Langmuir模型能较好地反映吸附过程特征。对吸附热力学参数ΔG^0,ΔH°和△S°计算表明，吸附过程是吸热的自发过程，升高温度有利核桃壳粉对Cr（Ⅵ）的吸附，在301、308和318K条件下的最大吸附量分别为20．54、26．00和29．53g·kg^-1。试验结合FTIR和SEM手段，对核桃壳粉进行了分析，发现核桃壳粉对Cr（Ⅵ）的吸附是一个包含氧化还原的极其复杂的反应过程，核桃壳粉是具有吸附污水中铬的能力和潜在利用价值的生物质吸附剂。     

ICSI介导生产转基因牛胚胎影响因素的研究

采用牛体外成熟卵母细胞和冷冻解冻的精子为材料,以pEGFP-N1为模式基因,探讨DNA浓度、精子质膜破损方法、注射台温度对牛精子胞质内注射（ICSI）介导转基因效果的影响。结果表明：线性pEGFPN1质粒DNA浓度为5μg/mL、10μg/mL两组的早期胚胎发育率显著高于50μg/mL组（19.8%,16.7%VS 7.9%,p〈0.05）。以冻融、TritonX100、超声波断尾三种方法破损精子质膜,冻融组的囊胚发育率（24.7%）最高,且冻融组的早期胚胎基因表达率极显著高于超声断尾组（41%VS 20.5%,p〈0.01）;当分别在25℃、38℃的注射台进行显微注射时,两组之间胚胎的囊胚率无显著差异（p〉0.05）,但二者之间胚胎的基因表达率差异显著（46.83%VS 28.57%,p〈0.05）。以上结果表明：（1）牛精子转染外源GFP基因的浓度不宜过高,转染高浓度的DNA会影响胚胎发育;（2）精子质膜是阻碍外源DNA与牛精子相结合的主要因素,将精子冻融处理可有效破损其质膜,利于精子与外源DNA的结合,从而提高ICSI介导转基因效率;（3）25℃和38℃热台温度对牛ICSI胚胎的早期发育无影响,但25℃热台温度可提高牛ICSI介导转基因的效果。