盐角草PsaH基因的克隆及生物信息学分析

【目的】从盐生植物盐角草(Salicornia europaea)中克隆得到一个参与光合反应光系统I(PSI)复合蛋白H亚基的Psa H基因,分析该基因进行生物信息学,为研究该基因的作用奠定基础并为改良作物耐盐性分子育种提供候选基因。【方法】以盐生植物盐角草为实验材料,采用RT-PCR方法克隆Psa H基因,利用NCBI、MEGA、Expasy等生物信息学工具对其核酸序列、编码的氨基酸序列及蛋白质的结构和功能进行分析。【结果】克隆得到一个与耐盐有关的基因,命名为Se Psa H,属于光系统I(PSI)家族H亚基成员,其开放阅读框(ORF)为438 bp,基因编码145个氨基酸,预测蛋白分子量为15.3 k D,等电点9.84,是亲水性蛋白;系统进化树分析表明其与菠菜亲缘关系较近,通过对该蛋白保守性分析发现其含有4个保守性结构域。【结论】获得盐角草Se Psa H基因,为进一步研究该基因耐盐功能及其在盐生植物耐盐机制中的作用提供了基础。     

榅桲4CL基因的克隆与生物信息学分析

【目的】克隆榅桲果肉(Cydonia oblonga Mill)中4-香豆酸辅酶A连接酶(4-coumarate CoA ligase,4CL)基因,研究其序列特征,为该基因在榅桲果实发育过程中的作用和功能奠定基础。【方法】以榅桲果肉为试材,基于GenBank报道的近缘物种4CL基因cDNA序列,应用Primer Premier 5.0软件设计PCR扩增引物。提取榅桲总RNA,经反转录后合成cDNA,应用RT-PCR方法成功扩增出4CL基因片段并克隆到pMD18-T载体。通过DNAstar软件进行同源序列比对,ClustalX结合MEGA4.1软件构建系统进化树,采用Protparam在线程序分析蛋白质的理化性质,用DNAstar的Protean程序预测二级结构。【结果】榅桲4CL基因其开放阅读框(ORF)序列为1 710 bp,编码570个氨基酸,蛋白分子质量为68.4 kD,与其他物种序列同源性最高达91.99%,进化关系上与水密桃较近;榅桲4CL蛋白为亲水性蛋白,二级结构中以无规卷曲(Random coil)为主,占比达到44.27%。【结论】获得了榅桲4CL基因全长编码区序列,探明了该序列的结构特征。     

盐穗木miR167d和预测靶基因ARF8在盐胁迫下的表达与相关性分析

【目的】盐穗木(Halostachys caspica)是一种藜科多年生盐生灌木,对盐分适应性极强。miR167是作用于生长素信号通路上的内源非编码小RNA分子,它通过靶向生长素响应因子ARFs(auxin response factors)来调控生长素响应基因的表达。研究从高盐(600 mmol/L NaCl)处理48 h盐穗木根的小RNA文库中筛选到差异表达的miR167d,并从该物种的转录组数据中预测到其靶基因ARF8。该文开展了高盐胁迫下盐穗木miR167d和预测靶基因ARF8的表达模式和相关性分析。【方法】通过荧光定量PCR试验检测和分析高盐胁迫下盐穗木miR167d和预测靶基因的表达模式和相关性;利用烟草瞬时表达试验间接地鉴定盐穗木miR167d对预测靶基因ARF8的靶向关系;采用同源克隆方法结合RACE技术获得盐穗木miR167d的靶基因ARF8的全长序列,并进行生物信息学分析。【结果】(1) 600 mmol/L NaCl处理盐穗木,其同化枝中miR167d和ARF8的表达均受到诱导,胁迫48 h时,miR167d的表达最高并与靶基因的表达呈现显著的负相关性,HcARF8基因的表达随胁迫处理时间的延长呈现先增加后下降的趋势,推测盐穗木miR167d和ARF8两基因可能在响应盐胁迫过程中发挥作用。(2) 构建融合GFP的含预测靶基因HcARF8的植物表达载体并转化农杆菌,烟草瞬时表达试验的结果表明,拟南芥miR167d对盐穗木ARF8基因具有剪切作用,间接证明盐穗木miR167d对预测的靶基因HcARF8具有靶向切割作用。(3) 克隆获得的盐穗木ARF8基因全长2 861 bp,ORF 2 442 bp,编码813个氨基酸,在编码区与盐穗木miR167d高度互补匹配。生物信息学分析该基因编码的蛋白高度保守,与同科植物甜菜ARF8同源性达到87%,都具有能与生长素相关元件(B3 DNA绑定元件、生长素响应元件,生长素诱导转录IAA超家族的元件)结合的功能域。【结论】盐穗木miR167d和HcARF8基因具有靶向关系,高盐胁迫处理盐穗木,其同化枝中两基因的表达都受到诱导并呈现显著的负相关性。这些结果为后续阐明盐穗木miR167d与其作用的靶基因ARF8的生物学功能奠定基础。     

扁桃AcDHN1基因的克隆及原核表达分析

【目的】 克隆与分析扁桃脱水素基因,为研究脱水素基因在扁桃抗逆机制中发挥的功能提供参考。【方法】 以新疆栽培的扁桃品种‘纸皮’叶片为材料,通过PCR技术克隆扁桃AcDHN1基因并对该基因进行原核表达分析,构建原核表达载体,在大肠杆菌进行表达。【结果】 克隆得到了一个脱水素基因,命名为AcDHN1,GenBank登陆号为KT949395,该基因全长924 bp、编码308个氨基酸的多肽,为稳定的亲水性蛋白,属于Y₂K_n型脱水素,推测蛋白分子质量为32.4 kD,亚细胞定位于细胞核中。将该基因与原核表达载体连接构建重组质粒pET-AcDHN1,然后将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达。SDS-PAGE电泳结果表明,该蛋白分子量的大小约为52.7 kD,与预期长度一致。【结论】 对重组蛋白的诱导条件进行优化后结果显示,该基因在IPTG浓度0.1 mmol/L、诱导3 h表达量最佳。     

小麦叶绿素酸酯a氧化酶(TaCAO)基因的克隆与表达分析

【目的】研究弱光环境下叶绿素酸酯a氧化酶(TaCAO)的表达水平变化,分析叶绿素合成途径对于弱光环境的响应。【方法】利用同源克隆,由小麦品种新冬20号克隆TaCAO并分析其序列。使用半定量PCR方法分析900、1 800、3 600和7 200 lx光照强度下TaCAO表达量。【结果】该基因ORF长度为1 653 bp,编码蛋白大小为62.12 kD,包含550个氨基酸残基,含有叶绿素转运肽和Rieske_RO_Alpha_CAO结构域,还存在一个Rieske铁硫配位中心和铁结合位点,随着光照强度的减弱,TaCAO表达量呈现上升的趋势。【结论】克隆获得的TaCAO长度为1 653 bp,具有完整的CAO活性,TaCAO的相对表达量与光照强度呈反比关系。     

海岛棉GbPR10基因的克隆及其抗枯萎病表达分析

【目的】为棉花抗枯萎病分子育种的基因来源提供依据。【方法】根据前期转录组测序和抗病表达数据,从棉花EST数据库中筛选出抗枯萎病有关的基因(登录号为CD486053)序列,在NCBI搜索与该基因同源性为94%的海岛棉抗病相关PR10基因(登录号为AY588276)并设计引物,从枯萎病接菌的抗病海岛棉材料“06-146”克隆一个海岛棉同源基因,命名为GbPR10基因。进行生物信息学和在枯萎病菌、乙烯、水杨酸处理下基因表达量分析。【结果】GbPR10基因有480 bp的ORF序列,编码159个氨基酸。该蛋白序列中具有PR10蛋白特有的Bet-v1结构域和改变的甘氨酸环P-Loop(GXGGXG)。蛋白质序列同源比对表明该蛋白与其他生物PR10蛋白有较高的一致性。亚细胞定位预测表明GbPR10分布于细胞质。qRT-PCR表达分析表明,GbPR10基因在不同抗病海岛棉品种的不同组织上表达量不均匀而较高于感病海岛棉品种;在乙烯和水杨酸处理的1对抗/感海岛棉根系中,抗病品种出现先上调后下调趋势,感病材料后期诱导表达,抗病品种的表达量几乎高于感病品种。【结论】GbPR10基因在海岛棉抗枯萎病信号途径中起重要作用。     

棉花PsbS基因对烟草光合特性的影响

【目的】分析光系统II PsbS基因在不同光照条件下,光系统II PsbS基因的功能 。【方法】利用转棉花PsbS基因的烟草(Nicotiana tabacum xanthin),T3代株系及非转基因(普通野生型,wt)烟草为材料,比较两者的生物学性状(叶面积、叶绿素含量)及在不同光强(75、240、450 μmol/(m²·s))下的生理(光合作用)性状。【结果】转基因植株前期叶面积增长较快,叶绿素组成成分的含量也存在差异,叶绿素a、b含量显著高于野生型烟草,转基因烟草具有更强的光合能力,并伴随着气孔导度(Gs)、蒸腾速率(Tr)提高。【结论】转PsbS 基因可以提高烟草光合能力。     

海岛棉GbHCT10基因的克隆与表达分析

【目的】研究海岛棉(Gossypium barbadense)GbHCT10基因在棉纤维发育中的作用。【方法】 以海岛棉品种新海21号纤维发育第5 d的样本作为材料,根据海岛棉GbHCT10基因序列设计一对引物,利用RT-PCR技术从中克隆GbHCT10核苷酸序列。利用生物信息学方法分析GbHCT10基因序列。【结果】 采用实时荧光定量PCR技术分析海岛棉GbHCT10基因在新海21号棉花开花后不同时期中表达量差异,该基因具有长度为1 248 bp的开放阅读框,编码415个氨基酸,预测蛋白质分子量为45.13 kD,等电点为6.01。海岛棉GbHCT10基因的表达随棉纤维发育变化而变化,在开花后第5和第10 d时表达量较高,第25 d表达量最低,总体表达量呈现波动状态。【结论】 新海21号GbHCT10基因与树棉HCT基因在同一分支,有较近亲缘关系。     

盐胁迫下盐穗木miR393b与预测靶基因HcTIR1的表达及相关性

【目的】研究盐胁迫下盐穗木生长素通路中miR393b和预测的靶基因TIR1的表达模式和相关性。【方法】采用生物信息学方法预测盐穗木miR393b的靶基因;通过qRT-PCR方法检测盐胁迫下盐穗木miR393b及预测靶基因HcTIR1(transport inhibitor response1)的相对表达模式,并分析其相关性。【结果】miR393b成熟体在不同植物种中高度保守;盐穗木miR393b预测的靶基因为TIR1;盐胁迫处理,盐穗木同化枝中两基因响应高盐胁迫,并具有一定的负相关性。【结论】盐穗木miR393b和预测的靶基因响应高盐胁迫,二者具有一定的负相关。该结果为进一步探讨盐穗木miR393b与预测靶基因TIR1的生物学功能奠定基础。     

薰衣草DXS基因的克隆、表达分析及原核表达

【目的】 研究拟克隆薰衣草DXS基因,并分析其表达,为揭示该基因在调控薰衣草萜类物质合成中的分子机理提供研究基础。【方法】 以薰衣草杂花为试材,同源克隆薰衣草DXS基因,进行基因序列分析、表达量比较和原核表达。【结果】 (1)薰衣草DXS基因开放阅读框长为2 181 bp,编码由726个氨基酸组成的蛋白质序列;薰衣草DXS蛋白等电点为6.57,分子量约为78.39 KDa,具有高度的保守性,与狭叶薰衣草、冬凌草、毛喉鞘蕊花的DXS蛋白亲缘关系相近;(2)DXS基因在杂花花器官的衰败期表达量最高,在法国蓝花器官的盛开期表达量最高,DXS基因在杂花花器官五个不同发育时期的表达量均高于法国蓝;DXS基因在杂花花萼中表达量最高,在法国蓝雄蕊中表达量最高,DXS基因在杂花花器官5个不同组织表达量均高于法国蓝(雌蕊、雄蕊除外);(3)在37℃、IPTG 0.8 mM条件下诱导4 h后,DXS蛋白表达量最大。【结论】 DXS基因表达量与薰衣草精油产量存在正相关关系。     

沙葱萤叶甲气味结合蛋白GdauOBP20的基因克隆、 原核表达及其结合特性

【目的】 沙葱萤叶甲（Galeruca daurica）是近年来在内蒙古草原上暴发成灾的新害虫,本文旨在克隆沙葱萤叶甲气味结合蛋白基因GdauOBP20的cDNA全长序列,明确其重组蛋白与寄主植物挥发物的结合特性,为揭示沙葱萤叶甲嗅觉的分子机理打下基础。【方法】 基于沙葱萤叶甲转录组数据,利用RACE技术对沙葱萤叶甲气味结合蛋白基因GdauOBP20进行cDNA全长克隆;利用生物信息学软件预测分析其编码蛋白的理化特性和结构特征;通过原核表达系统表达目的蛋白,并使用Ni-NTA Agarose亲和层析柱进行重组蛋白纯化。最后采用荧光竞争结合的方法,以N-苯基-1-萘胺（N-phenyl-1-naphthylamine,1-NPN）为荧光探针,检测GdauOBP20重组蛋白与13种主要寄主挥发物的结合情况。【结果】 GdauOBP20的cDNA全长序列为567 bp（GenBank登录号MK250532）,其中5′末端非编码区长24 bp,3′末端非编码区长123 bp,具有ployA尾结构;开放阅读框（ORF）全长为420 bp,编码139个氨基酸。氨基酸序列中含有4个保守的半胱氨酸位点,属于Minus-C OBP亚家族。预测蛋白三级结构中含有6个α螺旋和两对由半胱氨酸形成的二硫键。成功构建了重组表达载体并获得了高纯度的重组蛋白。重组蛋白GdauOBP20与荧光探针1-NPN的结合常数为12.8 μmol·L ^-1,结合能力较好,可作为本试验的荧光报告子。在所测的13种主要寄主植物挥发物中,除与二烯丙基三硫醚无结合能力外,GdauOBP20重组蛋白与其他12种寄主植物挥发物均有不同程度的结合能力,其中与对二甲苯和环庚三烯的结合能力最强,解离常数分别为22.91和26.55 μmol·L ^-1,而与月桂烯结合能力最弱,解离常数为116.29 μmol·L ^-1。【结论】 沙葱萤叶甲GdauOBP20能与寄主植物的多种主要挥发性物质结合,推测其可能在沙葱萤叶甲对寄主植物的定位过程中发挥重要的作用。     

香梨优斑螟脂肪酸Δ9去饱和酶基因序列及不同虫态的表达分析

【目的】研究Δ9去饱和酶基因特性及其在不同虫态下的表达,研究EpFAD9基因功能及潜在应用提供数据,为该香梨优玫玉暝、饱和脂肪酸积累中的作用提供参考。【方法】采用生物信息学软件鉴定、分析和预测Δ9去饱和酶(EpFAD9)的核苷酸和氨基酸序列,研究蛋白质结构和功能,并利用qRT-PCR方法测定△9去饱和酶基因在不同虫态下的表达水平。【结果】EpFAD9基因开放阅读框由1 056 bp组成,含352个氨基酸,起始密码子ATG位于获得序列的第1 280碱基上,终止密码子TAA位于该序列第2 338碱基。推测该蛋白无信号肽,共4个跨膜结构域,整体表现为亲水性蛋白,主要在内质网中发挥生物学作用。EpFAD9基因在幼虫期表达量较高,分别是成虫期和蛹期的17.75和29.58倍。【结论】EpFAD9基因基因在香梨优斑螟不同虫态下存在表达差异,在幼虫体内的表达量最高,成虫和蛹期的表达很低,尤其是虫蛹,其表达量更低于成虫,虫蛹和成虫状态下的香梨优斑螟对低温抵抗能力都低于幼虫。     

‘南通小方柿’赤霉素不敏感基因DkGAI2的克隆与功能分析

【目的】 对DkGAI2的亚细胞定位及表达特性进行分析,并将DkGAI2转化烟草,分析转基因烟草的生理和形态指标,为GAI的深入研究提供理论基础。【方法】 以‘南通小方柿’高通量转录组测序结果中标注的GAI2为原始序列（未发表）,利用RT-PCR,3′ RACE和5′ RACE技术从‘南通小方柿’中克隆得到DkGAI2的序列全长。利用生物信息学分析其序列特征,采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析DkGAI2在‘大方柿’及‘南通小方柿’5个不同物候期的表达特性以及DkGAI2在‘南通小方柿’不同组织中的表达特性,构建瞬时表达载体pCAMBIA-GFP-1302-DkGAI2,并瞬时侵染烟草分析DkGAI2的亚细胞定位,通过构建DkGAI2植物双元表达载体,利用农杆菌介导法转化烟草,经过GUS染色、RT-PCR对转基因烟草株系进行鉴定;并将野生型和转基因烟草移栽,于第一朵花开放时测定转基因植株的株高、节间长度、叶片长宽比以及GA₁和GA₄含量。【结果】 从‘南通小方柿’中克隆得到了1 827 bp的DkGAI2,DkGAI2核苷酸序列与猕猴桃（KF588651.1）、光皮烨（MF149049.1）、砂梨（KX078214.1）、苹果（FJ535245.1）、葡萄（MG738718.1）的相似度达72%-80%,DkGAI2具有DELLA蛋白家族特有的DELLA结构域,属于DELLA蛋白基因家族。DkGAI2编码608个氨基酸,相对分子质量为66.5 kD,理论等电点为5.54,不稳定系数为50.41,无明显疏水区,无跨膜区,无信号肽。序列系统进化分析结果显示,DkGAI2与葡萄亲缘关系最近。qRT-PCR结果显示,DkGAI2在‘南通小方柿’5个不同物候期的表达量都高于‘大方柿’;DkGAI2在‘南通小方柿’不同组织中表现出组织表达特异性,其中,在老叶中表达量最高,其次为茎尖和幼叶,而在幼果中几乎不表达。pCAMBIA-GFP-1302-DkGAI2融合蛋白的绿色荧光信号位于细胞核中,表明DkGAI2编码蛋白位于细胞核。经过GUS染色和RT-PCR检测,共获得5个转DkGAI2烟草株系,转基因烟草叶片GA₁含量增加,GA₄含量降低,GA₁和GA₄总含量降低,且转基因烟草植株出现植株矮化、节间缩短、叶片长宽比降低及花期延迟的表型。【结论】 DkGAI2具有组织表达特异性,定位于细胞核,DkGAI2在‘南通小方柿’5个不同物候期的表达量均高于‘大方柿’。推测DkGAI2可能通过降低GA₄的含量进而引起植株矮化。     

棉铃虫鞣化激素基因克隆及分子特性分析

【目的】获得棉铃虫鞣化激素2个亚基(α亚基和β亚基)基因序列,分析其分子特性和表达模式,研究棉铃虫鞣化激素的作用机制奠定基础。【方法】通过生物信息学和分子生物学技术分别得到棉铃虫鞣化激素α和β亚基cDNA序列,将棉铃虫及NCBI中公布的已知其它昆虫鞣化激素α和β亚基氨基酸序列分别整理分析,利用MEGA7(7.0.14)软件的Jones-Taylor-Thornton(JTT)模型构建系统进化树并进行聚类分析,qRT-PCR分别检测两亚基在棉铃虫不同生长发育阶段的表达模式。【结果】分别获得了棉铃虫鞣化激素 α亚基与β亚基核苷酸序列。其中α亚基(GenBank登录号:AHM0247472.1)cDNA片段长694 bp,开放阅读框480 bp,编码159个氨基酸残基,预测该蛋白质分子量为17.7 kDa。该基因在卵期第3 d、1龄幼虫第1 d、3~5龄幼虫第1 d、2和3龄末蜕皮期(3M和4M)、蛹期第0 d、第3 d和第7 d表达量相对较高。β亚基(GenBank登录号:AHM0247473.1)cDNA片段长779 bp,开放阅读框420 bp,编码139个氨基酸残基,预测该蛋白质分子量为15.9 kDa。该基因在卵期至2龄末蜕皮期(3M)、3龄幼虫第2 d、4~5龄幼虫第1 d、蛹期第1 d至羽化前表达量相对较高。鞣化激素α亚基和β亚基基因均在棉铃虫胸神经节中相对表达量最高,咽下神经节次之,脑部和腹部相对表达量较弱。【结论】鞣化激素在鳞翅目昆虫中具有较高的保守性;α亚基和β亚基基因主要在棉铃虫卵期、初孵幼虫期、蛹期和新羽化成虫期发挥作用;鞣化激素在棉铃虫幼虫体内主要由胸部神经节转录合成。