油茶雌蕊蛋白双向电泳分离体系的建立

通过比较不同的蛋白提取方法、裂解液成分、离心速率、等电聚焦程序,以及不同浓度的SDS-PAGE凝胶,建立最适于油茶雌蕊总蛋白的双向电泳体系。结果显示:TCA/丙酮+SDS/酚抽法提取蛋白,裂解液[7 mol/L尿素,2 mol/L硫脲,80 mmol/L DTT,4%(W/V)CHAPS,2%(V/V),IPG buffer(p H 3-10L)]复溶蛋白干粉,20 000 r/min离心;等电聚焦程序为:100 V 1 h,200 V 2 h,500 V 3 h,1 000 V 2 h,8 000 V 2 h,8 000 V62 000 Vh,500 V 10 h;10%SDS-PAGE凝胶浓度,为适合油茶雌蕊蛋白的双向电泳体系。这些结果为油茶雌蕊蛋白组学的研究奠定了技术基础。     

适用于大豆叶片蛋白质组分析的双向电泳最佳条件研究

针对大豆叶片中蛋白含量较低,含有大量色素、酚类、醌类等次生代谢产物干扰蛋白质双向电泳分离效果的问题,以大豆叶片为材料,对样品制备、蛋白质裂解液组分、等电聚焦(IEF)参数等条件进行研究.结果表明:采用TCA/丙酮法提取大豆叶片总蛋白,裂解缓冲液为9 mol·L-1尿素,2 mol·L-1硫脲,4%CHAPS.100 mmol·L-1DTT,0.5%Bio-Lyte,IEF等电聚焦条件为24 000Vh时,2-DE图谱分离到的蛋白点效果最好.初步建立了一套适用于大豆叶片蛋白质组分析的双向电泳(2-DE)体系.     

野生大豆叶片蛋白质组双向电泳技术体系的优化研究

为给野生大豆蛋白质组学分析提供技术支撑,以耐盐碱野生大豆叶片为材料,对Tris-饱和酚法、Tris-HCl法和TCA-丙酮法3种蛋白质提取方法进行了比较,并对蛋白上样量、等电聚焦参数及凝胶浓度进行了优化。结果表明:使用Tris-饱和酚法提取蛋白质,上样量为2 000μg,等电聚焦90 000 V·h,凝胶浓度为10%时,可获得背景清晰、蛋白点数较多、重复性较好的蛋白双向电泳图谱。     

大豆种子萌发中蛋白质组成的双向电泳分析

采用双向电泳技术分析了大豆种子萌发时期蛋白质的差异表达.研究发现,在考染胶上,通过PDQuest分析,在成熟干种子和萌发种子的2-DE图谱上分别获得341和376个蛋白斑点,两个时期的2-DE图谱非常相近,说明绝大部分大豆种子贮藏蛋白在萌发期尚未开始降解.有21个蛋白点在萌发的大豆种子中表达量上调,9个表达量下调.对这些蛋白的进一步鉴定将有助于深入理解大豆种子萌发过程的生理及分子机制.     

大豆茎秆蛋白质双向电泳技术体系优化

为建立一套完整、可行的适合大豆茎秆蛋白的双向电泳技术,对大豆茎秆蛋白的提取方法、双向电泳的固相化p H梯度凝胶(IPG)、上样量、SDS-PAGE胶浓度、染色方法等进行了优化。结果表明,将传统的TCA/丙酮法与酚法相结合,提取的大豆茎秆蛋白经双向电泳分离后,可获得较多的蛋白点,且背景清晰,便以识别。双向电泳优化后的主要技术参数为p H3-10非线性IPG胶条、上样量800μg、12%SDS-PAGE胶、考马斯亮蓝染色。本研究形成的大豆茎秆蛋白提取方法和双向电泳技术方案,有利于进一步采用蛋白质组学分析大豆茎秆的生物学功能。     

茶树雌蕊总蛋白质双向电泳分离体系的建立

为建立一套适合茶树雌蕊总蛋白质分离的双向电泳体系,对茶树雌蕊总蛋白的提取方法、SDS-PAGE凝胶浓度、聚焦条件和IPG胶条pH范围等进行了比较优化。结果表明,TCA/丙酮-clean up kit法提取总蛋白,用17 cm pH 5~8 IPG胶条,13%SDS-聚丙烯酰胺凝胶进行分离,用考马斯亮蓝R250染色,可以获得清晰、分辨率高、重复性好的双向电泳图谱,共检测到约1 200个蛋白点,主要分布在pH 5~8,相对分子量14~117 kD范围内,碱性蛋白得到有效分离,可以满足茶树雌蕊的蛋白组学分析和研究。     

适于蛋白质组研究的大豆种子蛋白双向电泳技术的改进

以大豆种子为材料,通过对样品制备、电泳条件以及染色方法等关键步骤进行改进,在大豆种子蛋白分析研究中获得了质量较高的双向电泳图谱,为大豆种子蛋白质组研究提供一较好的实验方法.     

茶树蛋白质双向电泳样品制备技术研究

为探索一种适用于茶树蛋白质双向电泳的样品制备方法,研究比较了TCA/丙酮沉淀法、改良的Tris-HCl抽提法,以及酚-甲醇/醋酸铵沉淀法3种植物蛋白质样品制备方法。结果表明,改良的Tris-HCl抽提法较适合于茶树蛋白质双向电泳的样品制备。该改良方法制备的茶树蛋白质样品经双向电泳分离,可获得1117±9.89个蛋白质点,其中大部分蛋白质的等电点集中在pI5~7之间,相对分子质量集中在15.00~95.00kD之间,背景清晰且蛋白质得率较高,能满足茶树蛋白质组学研究的需要。     

大豆异黄酮提取条件和大豆蛋白质分离工艺研究

以豆粕为原料,以总大豆异黄酮为目标产物,用正交试验设计研究了用乙醇提取大豆异黄酮的较优条件,70%(V/V)乙醇,固液比(豆粕:溶剂)1:10(W/V),70℃下提取3次,每次回流时间1.5h.在室温下,采用盐析和等电点沉淀工艺分离除去提取液中的大豆蛋白质.试验表明,pH值在4.1±0.1下,加入3.0%(m/v)的ZnCl2,大豆蛋白质的分离除去率最高.     

茶树雌蕊总蛋白质双向电泳分离体系的建立

为建立一套适合茶树雌蕊总蛋白质分离的双向电泳体系,对茶树雌蕊总蛋白的提取方法、SDS-PAGE凝胶浓度、聚焦条件和IPG胶条pH范围等进行了比较优化。结果表明,TCA/丙酮-clean up kit法提取总蛋白,用17 cm pH 5~8 IPG胶条,13%SDS-聚丙烯酰胺凝胶进行分离,用考马斯亮蓝R250染色,可以获得清晰、分辨率高、重复性好的双向电泳图谱,共检测到约1200个蛋白点,主要分布在pH 5~8,相对分子量14~117 kD范围内,碱性蛋白得到有效分离,可以满足茶树雌蕊的蛋白组学分析和研究。     

龙眼种子蛋白质组双向电泳技术的优化

为建立适用于龙眼（Dimdcarpus longanaLour.）种子蛋白质组研究的双向电泳技术,对龙眼种子蛋白质的IEF、平衡时间及染色方法等关键步骤进行了优化。结果显示,龙眼种子蛋白质主要分布在pH4-7范围内,采用酚抽法,在聚焦达到50000 W.h的情况下能充分地聚焦,等电聚焦后经平衡缓冲液Ⅰ还原15 min,再经平衡缓冲液Ⅱ二次平衡20 min,考马斯亮蓝染色,24 cm IPG胶条上样量为1.2 mg时,在龙眼种子双向电泳图谱上检测到1000个多个蛋白点,蛋白点清晰,分辨率较好。本研究所建立的一套适用于龙眼种子蛋白质组分析的双向电泳方法分辨率和重复性较高,重复样品图谱间的相关系数在0.88-0.945之间。     

The Role of Seed Structure and Oxygen Responsiveness in Pre-Germination Flooding Tolerance of Soybean Cultivars

Abstract

Flooding during germination often inhibits the germination and emergence of soybean [Glycine max (L.) Merr.], but little is known about the mechanisms involved in the tolerance of soybean cultivars to the damage caused by the flooding. The objectives of this study were to characterize the germination responses of soybean cultivars to pre-germination flooding and low oxygen conditions, and to identify possible seed traits responsible for the tolerance. A comparison of germination percentages among 18 cultivars under optimal and flooding conditions for 3 d enabled the identification of two tolerant cultivars (Williams and Peking), and two susceptible cultivars (Nakasennari and Enrei), which were used for further analyses. A comparison of the water absorption speed (WAS) in the following seed forms: embryo only (E), embryo with aleurone layer (E + AL), and intact seed with aleurone layer and seed coat (E + AL + SC) revealed that the aleurone layer provides a barrier to water penetration during the first hour of inundation regardless of cultivar. The intact seeds of a tolerant cultivar, Peking absorbed water more slowly than the other cultivars in the first hour of flooding. When the oxygen concentration in the seed container was reduced to 70 mL L-¹ for 3 d, the germination percentage of susceptible cultivars was reduced to approximately 70 % whereas that of tolerant cultivars remained high, indicating that responsiveness to low oxygen could also be responsible for pre-germination flooding tolerance of soybean cultivars.     

仿生包衣装置对大豆发芽与苗期植株性状的影响

为了提高大豆种子的包衣质量,促进包衣种子的发芽与苗期生长,实现苗齐苗壮,增加产量。以黑农48大豆种子为供试材料,对仿生包衣装置处理和现有包衣装置处理的大豆种子进行单因素田间试验,以未包衣大豆种子为对照组CK,仿生包衣装置处理的大豆种子为处理1,现有包衣装置处理的大豆种子为处理2,测定大豆种子发芽情况和苗期植株性状,比较2种包衣装置的包衣效果。结果表明:处理1和处理2的大豆种子发芽指标和苗期植株性状指标均高于对照组CK,处理1较处理2的发芽指数增长20.21%,根鲜重增长11.26%,主根长增长11.15%,且处理1和处理2的发芽指数、根鲜重、主根长差异显著。仿生装置处理较正常包衣处理种子生长状况更好的原因为仿生搅拌叶片更能减少搅拌叶片对大豆种子种皮和胚的损伤,增加大豆包衣的均匀性,进而提高了种子的包衣质量。通过田间试验验证了仿生包衣装置较现有包衣装置在包衣效果上的优越性,研究结果可为包衣设备改进优化提供数据支持和实用参考。     

大豆种子抗老化鉴定的方法研究

选用遗传差异相对较大的皖豆24、皖豆25(杂交品种)及合豆3号的种子,在温度为40℃、湿度为85%的条件下老化处理4、8和12 d,研究加速老化过程中不同基因型大豆种子成苗率、发芽率、电导率及单株幼苗干重的变化规律。结果表明:随着加速老化时间的延长种子活力下降;加速老化处理8 d,3个品种的各项鉴定指标均发生改变:品种的成苗率、发芽率及单株幼苗干重显著降低,电导率明显升高,且品种间有显著差异;发芽率和成苗率的变化在品种间具有一致性,电导率、单株幼苗干重的变化和成苗率品种间一致性较差;成苗率和发芽率的相关性最高(r=0.972**)。利用国家大豆微核心种质中的91份资源对老化鉴定方法进行验证,结果在温度为40℃,湿度为85%条件下老化8 d的种子发芽率及老化指数与在自然条件下老化15个月的发芽率及老化指数极显著相关(r=0.943**,0.716**)。综合分析认为,温度为40℃,湿度为85%条件下老化处理8 d,以种子发芽率为活力鉴定指标可作为大豆种子抗老化性的鉴定方法。     

大豆耐盐碱种质资源鉴定

盐碱胁迫伴随作物生长各个阶段,筛选获得全生育期耐盐碱大豆资源意义重大。试验通过测定大庆地区盐碱土含盐碱种类、含盐量及pH值等指标,确定筛选用盐碱种类、浓度。在培养皿、发芽袋和盆栽试验筛选中,通过大豆芽期发芽率、芽苗期物质生长量、成熟期物质生长量鉴定耐盐碱大豆种质。结果显示大庆地区盐碱土壤为硫酸盐苏打盐碱土,确定盐碱溶液为NaCl、Na₂CO₃、NaHCO₃和Na₂SO₄（摩尔比为1∶1∶9∶9）的混合盐碱溶液,以Na离子含量计算总盐浓度为80 mmol·L^-1,溶液pH值为8.9,盆栽筛选用土壤盐含量为3.3‰,pH值为8.9。鉴定的887份种质资源中种皮颜色有黑、褐、红、绿、黄及双色等,相关性分析发现大豆耐盐碱性与大豆种皮颜色极显著正相关。通过芽期耐盐碱鉴定,887份大豆资源中筛选获得296份耐以上资源,进一步芽苗期筛选有123份显示高耐,再经过全生育期筛选获得7份高耐资源,5份来源于南方,2份来源于黄淮,62份耐资源,盆栽筛选比例为56.10%。本研究建立了从芽期、芽苗期到全生育期的逐级筛选方法,从887份大豆种质资源中筛选获得69份耐盐碱资源,为耐盐碱育种与耐盐碱基因资源利用提供基础材料。     

吸附树脂提取的大豆根分泌物种类的GC-MS分析

采用GC—MS分析法，鉴定了XAD—4吸附树脂连续提取所获得的大豆根分泌物的种类，并研究了化感物质(邻苯二甲酸)对大豆幼苗生长的化感作用。结果表明：根分泌物连续捕获系统(XAD—4吸附树脂)获得的根分泌物种类丰富，主要是长链脂肪酸、苯甲酸及其衍生物，直链醇、烯醇、酚、酮、苯胺、酯和一些烃类及其衍生物等有机化合物，其中很多都被报道是化感物质。在一定浓度范围内，邻苯二甲酸对大豆幼苗生长具有显著的化感抑制作用。表明大豆根分泌物中存在抑制大豆幼苗生长的化感物质，由此可引发大豆连作障碍。     

不同方法从大豆不同组织中提取基因组DNA效果的比较

从大豆组织中获得高质量和足够产量的基因组DNA,是进行大豆分子生物学研究的基础.为进行大豆基因组的PCR,RAPD,SSR等分子生物学研究,分别以大豆种子和其叶片为实验材料,采用改良的SDS法和CTAB法对大豆基因组DNA进行了提取.对DNA的提取效果,采用紫外分光光度检测、琼脂糖凝胶电泳分析及DNA的限制性内切酶图谱分析进行了综合比较.结果表明,在以叶片为材料时,SDS法和CTAB法的大豆基因组DNA的提取效果差别不大,SDS法稍好于CTAB法.在以大豆种子为材料时,SDS法的提取效果明显优于CTAB法,SDS法可从大豆种子中提取到能够充分满足各种分子操作的高质量和数量的大豆基因组DNA.     

Development and validation of a GC–MS method for soybean organ-specific metabolomics

Field mold (FM) can easily deteriorate the preharvest soybean in the field, and Fusarium moniliforme is demonstrated as the dominant pathogenic fungi. Metabolomics is a powerful tool to reveal the resistance mechanism in response to microbial infection. Therefore, in this research, the Design of Experiment (DOE) model was developed to optimize the extraction solvent combinations for metabolomic study of soybean seed and pod based on gas chromatography–mass spectrometry (GC–MS). Combined with the number of extracted peaks and the peak area of common substances, the extraction efficiency of different solvent was analyzed by multivariate statistical analysis. The result showed that isopropanol/water/methanol (1:1:1 and 1:1:4, v/v/v) mixture was highly efficient for metabolites extractions of soybean seed and pod, respectively. Additionally, the potential metabolites and pathways concerned in FM resistance were explored by the optimized extraction solvent system based on metabolomics analysis. Amino acid metabolism in soybean seed was disturbed by F. moniliforme and metabolic pathways related to energy conversion in soybean pod strongly responded to fungal infection. This study constructs a GC–MS-based metabonomic method for soybean metabolites; comparative analysis of organ-specific metabolomics for soybean fruit could be further applied in soybean metabolomics researches.