茶树总蛋白质提取方法及双向电泳体系的建立

为探索适用于茶树叶片蛋白质组学研究的双向电泳技术体系(2-DE),比较三氯乙酸(TCA)/丙酮沉淀法和改良酚抽法2种不同总蛋白质提取方法、不同蛋白上样量对2-DE的影响。结果表明:改良酚抽法更适合茶树总蛋白质的提取;采用1.5 mg的蛋白质上样量,最终可获得蛋白质点较多、背景清晰、分辨率较高的双向电泳图谱,为进一步深入开展茶树蛋白质组学的研究奠定了基础。     

茶树蛋白质提取及双向电泳的改良方法

研究了茶树芽叶蛋白质提取纯化及双向电泳技术,在样品制备、电泳及染色等方面进行了技术改进,解决了茶树芽叶中富含色素、多酚类化合物及其氧化产物等对双向电泳严重干扰的问题,探索出一种可获得重复性好,清晰度高的蛋白质双向电泳图谱技术;同时发现一种辨别茶树蛋白质样品质量好坏的简便方法。电泳图谱可分辨出茶树芽叶蛋白质斑点数500个左右,蛋白质相对分子量约在14.0 kD～100.0 kD范围内,主要分布在14.0 kD～67.0 kD之间;等电点约在4～9.5范围内,主要分布在4～6.5。     

三种甘蔗叶片蛋白质分离纯化方法比较及双向电泳体系优化

为了优化适用于甘蔗叶片蛋白质的分离纯化方法与双向凝胶电泳体系,比较了3种蛋白质分离纯化方法对甘蔗叶片蛋白质的SDS-PAGE电泳图谱、蛋白质提取率以及双向凝胶电泳的影响,同时优化了双向电泳条件。结果显示,SDS提取法的SDS-PAGE电泳图谱中条带较少,蛋白质沉淀杂质多,效果差;三氯乙酸/丙酮沉淀法蛋白质沉淀得率高,但沉淀复溶性差,蛋白质溶液浓度低,难于满足双向电泳大胶的高上样量要求;酚抽提法蛋白质沉淀得率虽低,但沉淀纯度高、复溶性好,蛋白质溶液浓度高,是适合双向电泳分离纯化甘蔗叶片蛋白质的理想方法。酚抽提法蛋白质双向凝胶电泳合适的胶条p H范围为4~7,17 cm大胶合适的上样量为800μg,平均可分离出954个蛋白点。     

龙眼胚性愈伤组织γ-ECS基因的克隆及表达分析

为探讨红麻细胞质雄性不育形成的分子遗传机理，以红麻细胞质不育系L23A和保持系L23B开花期叶片为材料，对其红麻蛋白质双向电泳体系进行研究，比较TCA/丙酮和酚抽提法提取红麻叶片总蛋白，同时优化上样量和样品制备方法，建立了红麻蛋白质的双向电泳技术体系和凝胶成像染色法，利用PDquest软件分析双向电泳凝胶的相关差异蛋白。结果表明：（1）TCA/丙酮法比酚抽提法更适合于ISO-DALT电泳系统；（2）TCA/丙酮提取的红麻叶片粗蛋白平均产量为31.67 mg/g，是酚抽提法的1.77倍, 但裂解效率为160 mg/g，是酚抽提法的36％；（3）每根胶条最佳上样量为300 μg；（4）考马斯亮蓝G-250比R-250以及银染色法效果更佳，在17 cm×17 cm的凝胶上平均可获得708个蛋白质点。本研究建立的红麻细胞质雄性不育系与保持系总蛋白提取方法及双向电泳体系，可为揭示红麻雄性不育分子机理奠定基础。     

油菜种子蛋白质提取方法研究

通过对比改进的Tris-HCl法、酚提取-甲醇/醋酸铵沉淀法、TCA/丙酮沉淀法和DTT/丙酮法4种方法提取油菜未成熟种子蛋白质,以期找到合适的蛋白质提取方法。结果表明,TCA/丙酮沉淀法和DTT/丙酮法所得蛋白质沉淀较多,颜色亮白,效果较好。进一步通过定量分析及双向电泳图谱的比较分析表明,TCA/丙酮沉淀法在2-DE图谱上蛋白质点较多,分布均匀,图像清晰,而DTT/丙酮法相对于本实验中TCA/丙酮法检测到较少的蛋白质点外,2-DE图谱上有明显的纵条纹。因此TCA/丙酮沉淀法为提取油菜种子中蛋白质的最优方法。     

橡胶草胶乳蛋白双向电泳方法的建立

采用Tris饱和酚法和TCA/丙酮沉淀法提取橡胶草(Taraxacum Kok-saghyz Rodin)胶乳蛋白质,并建立蛋白双向电泳方法.结果表明,TCA/丙酮沉淀法得到的双向电泳图谱横条纹较多,背景模糊,得到约446个蛋白质点;Tris饱和酚法提取样品双向电泳的聚焦效果较好,图谱显示约630个蛋白点,其中包括较丰富的低分子量蛋白.     

茶树鲜叶中维生素B6代谢酶PNPO的活性分析

采用液氮研磨、Tris-HCl+KPO₄缓冲液(pH8.5)浸提法和硫酸铵沉淀法从茶树鲜叶中提取磷酸吡哆醇氧化酶（PNPO）粗酶液,并通过苯肼法研究其酶学性质。结果表明,以磷酸吡哆胺（PMP）为底物,PNPO催化反应的最佳时间为30 min,最适温度为50℃,最适pH6.5。在pH6.0~9.0,温度10~40℃的条件下,此酶稳定。在最适条件下测得反应底物PMP的Km值为2.34 mmol/L。     

茶树雌蕊总蛋白质双向电泳分离体系的建立

为建立一套适合茶树雌蕊总蛋白质分离的双向电泳体系,对茶树雌蕊总蛋白的提取方法、SDS-PAGE凝胶浓度、聚焦条件和IPG胶条pH范围等进行了比较优化。结果表明,TCA/丙酮-clean up kit法提取总蛋白,用17 cm pH 5~8 IPG胶条,13%SDS-聚丙烯酰胺凝胶进行分离,用考马斯亮蓝R250染色,可以获得清晰、分辨率高、重复性好的双向电泳图谱,共检测到约1200个蛋白点,主要分布在pH 5~8,相对分子量14~117 kD范围内,碱性蛋白得到有效分离,可以满足茶树雌蕊的蛋白组学分析和研究。     

茶树雌蕊总蛋白质双向电泳分离体系的建立

为建立一套适合茶树雌蕊总蛋白质分离的双向电泳体系,对茶树雌蕊总蛋白的提取方法、SDS-PAGE凝胶浓度、聚焦条件和IPG胶条pH范围等进行了比较优化。结果表明,TCA/丙酮-clean up kit法提取总蛋白,用17 cm pH 5~8 IPG胶条,13%SDS-聚丙烯酰胺凝胶进行分离,用考马斯亮蓝R250染色,可以获得清晰、分辨率高、重复性好的双向电泳图谱,共检测到约1 200个蛋白点,主要分布在pH 5~8,相对分子量14~117 kD范围内,碱性蛋白得到有效分离,可以满足茶树雌蕊的蛋白组学分析和研究。     

‘四季蜜’龙眼花芽总蛋白质提取方法及双向电泳体系的优化

利用TCA丙酮法、丙酮法、TCA酚抽提法和改良酚抽法等4种方法,提取‘四季蜜’龙眼花芽的总蛋白质,在蛋白产量、单向SDS-PAGE和2-DE图谱等方面进行比较,并对IPG胶条种类、蛋白质上样量及等电聚焦条件等进行优化。结果表明:采用改良酚抽法,选用24 cm、pH3~10的胶条,按120μg上样,在适宜的等电聚焦条件下,可获得背景清晰、重复性好、分辨率高的2-DE图谱,本研究为‘四季蜜’龙眼花芽蛋白质组学后续研究奠定了基础。     

槟榔叶片总蛋白质提取及双向电泳条件初探

采用3种提取植物组织蛋白的方法(TCA/丙酮沉淀法、E-TCA法、酚法)提取槟榔叶片总蛋白,在蛋白产量,一维和二维电泳图谱等方面对3种方法的提取效果进行比较.结果表明,TCA/丙酮沉淀法效果较好,是槟榔叶片总蛋白提取的可选方法,同时优化了双向电泳的条件和上样量.     

冬小麦叶片抗旱蛋白质组双向电泳技术体系的优化

为给小麦抗旱蛋白质组学研究提供技术支撑,以两个抗旱性不同的冬小麦品种周麦18和晋麦47三叶期幼苗为材料,比较分析了PEG胁迫处理后两种不同蛋白质提取方法TCA/丙酮法和磷酸钠缓冲液研磨法对IEF/SDSPAGE双向电泳的影响,并在IPG胶条pH范围、蛋白质上样量和SDSPAGE胶浓度等方面进行了探索与优化。结果表明,采用TCA/丙酮法提取叶片全蛋白,选用17 cm、pH 4~7的IPG线性胶条,在上样量为150 μg·胶条_-1,以及12%SDSPAGE胶浓度下进行双向凝胶电泳,蛋白质能够更好地被分离,2DE图谱上可分辨出约400个蛋白点。利用该体系比较了PEG胁迫后两个品种双向电泳图谱的差异,周麦18有9个蛋白点存在差异,其中5个下调表达,4个上调表达(3个新诱导表达);晋麦47有5个蛋白点存在差异,均上调表达(1个新诱导表达)。     

不同沉淀剂对酚抽法提取植物蛋白质效果比较分析

酚抽法已经逐渐成为植物蛋白质组研究中通用的蛋白质提取方法,但在各种改进酚抽法中,应用到的沉淀试剂各不相同,致使蛋白沉淀得率、纯度和沉淀时间也各异,本研究以热带植物橡胶树叶片、胶乳和海马齿叶片为研究材料,在过饱和硫酸铵甲醇溶液、醋酸氨甲醇溶液和丙酮溶液沉淀剂下对比蛋白提取的效果,通过单向电泳检测、胶图质量分析、质谱鉴定、蛋白沉淀时间和得率比较,发现3种沉淀剂提取的蛋白样品1-DE图谱显示的蛋白条带数量均较多,但醋酸铵沉淀法提取蛋白图谱有条纹不清晰现象。得出结论：丙酮沉淀法对橡胶树叶片和胶乳蛋白质的提取率较高,硫酸铵沉淀法对海马齿叶片蛋白质提取率较高。过饱和硫酸铵甲醇溶液和丙酮沉淀剂提取的蛋白质质量较高,所得蛋白图谱背景清晰,质谱鉴定蛋白质信息量大。研究结果可优化提取高质量植物蛋白质的方法,并有望为顽拗类植物蛋白质组学研究提供参考。     

萌发期大豆总蛋白提取及双向电泳体系的优化

蛋白质样品的制备和双向电泳条件是蛋白组学研究中很关键同时也是很棘手的问题。本文比较了TCA/丙酮法、酚抽提、苯酚/SDS法3种不同的蛋白提取方法,并对双向电泳的一些条件进行了优化,建立了适合萌发期大豆总蛋白的双向电泳体系,即采用17cm、p H4-7的IPG胶条,凝胶浓度为12%,蛋白质上样量为0.2mg。IEF程序为:250V 1h,500V 1h,3 000V 3h,8 000V 1h,10 000V 1h,10 000V 60 000Vh。本研究为萌发期大豆的蛋白组学研究提供了实验方法。     

几种不同提取方法对小麦叶片总蛋白双向电泳的影响

为探索小麦叶片蛋白质提取的最优方法,以普通小麦品种石4185的叶片为材料,研究了三氯乙酸/丙酮法、裂解液法、尿素/硫脲法、KCl-醋酸铵甲醇法等四种不同蛋白质提取方法对小麦叶片蛋白双向电泳图谱的影响.结果表明,三氯乙酸/丙酮法获得的蛋白点形状规则、清晰,且重复性好;裂解液法拖尾现象较轻,但蛋白点数少且欠清晰,重复性也不如前者;尿素/硫脲法的蛋白点数很少,也较为弥散,且有明显的拖尾现象;KCl-醋酸铵甲醇法使大量蛋白丢失,蛋白点数非常少,且上部竖纹干扰较重.因此,三氯乙酸/丙酮法是提取小麦叶片蛋白的较优方法.     

适于水稻根、叶、悬浮细胞总蛋白质分析的高分辨率双向电泳方法

提取了水稻根、叶、悬浮细胞的总蛋白质,用双向电泳进行分离,得到了高分辨率和高重复性的双向电泳图谱。在根、叶、悬浮细胞的双向电泳图谱上能分别检测到至少1190、1320、1080个蛋白点,重复样品图谱间的相关系数在0.87～094。还对水稻蛋白质的提取过程和电泳条件进行了改进和优化,对其他植物蛋白的双向电泳分析有一定的借鉴作用。     

适用于大豆叶片蛋白质组分析的双向电泳最佳条件研究

针对大豆叶片中蛋白含量较低,含有大量色素、酚类、醌类等次生代谢产物干扰蛋白质双向电泳分离效果的问题,以大豆叶片为材料,对样品制备、蛋白质裂解液组分、等电聚焦(IEF)参数等条件进行研究.结果表明:采用TCA/丙酮法提取大豆叶片总蛋白,裂解缓冲液为9 mol·L-1尿素,2 mol·L-1硫脲,4%CHAPS.100 mmol·L-1DTT,0.5%Bio-Lyte,IEF等电聚焦条件为24 000Vh时,2-DE图谱分离到的蛋白点效果最好.初步建立了一套适用于大豆叶片蛋白质组分析的双向电泳(2-DE)体系.     

外源诱导提高茶树EGCG含量过程的蛋白质组差异分析

通过无公害化学诱导子的诱导可使茶树芽叶的EGCG含量提高20.15%～25.00%。为了探明诱导的分子机制,用固相pH梯度双向凝胶电泳分离诱导芽叶与正常芽叶的总蛋白质,结果获得了分辨率和重复性较好的双向电泳图谱,差异表达分析发现,诱导出现的特异蛋白有14种,诱导消失的特异蛋白有8种,诱导表达上调相差10倍的特异蛋白有11种,诱导表达下调相差10倍的特异蛋白有6种。选取两个差异蛋白质点进行基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)测定其酶解后的肽质指纹图谱,通过http:/www.matrixscience.com网站,利用Mascot软件检索NCBInr数据库。查询结果:一种为光合系统Ⅰ的铁硫蛋白,另一种为未知蛋白。这些结果表明,茶树诱导芽叶与正常芽叶的蛋白质组存在差异,这些特异蛋白可能在诱导过程中起着重要的作用。     

大豆叶片蛋白质双向电泳技术的改良

以大豆叶片为材料,比较分析了3种蛋白质的提取方法,讨论了等电聚焦时间和染色方法等关键因素对双向电泳的影响,同时选择不同的IPG胶条,设定了第1向等电聚焦和第2向SDS-PAGE电泳的电泳程序及参数.结果表明:采用TCA-丙酮沉淀法提取蛋白质,选择pH 4 ～7( 17 cm) IPG胶条,适当延长和改变等电聚焦的第2步...