桉树葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH)的全基因组分析与进化研究

[目的]对桉树基因组中葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PDH）进行全基因组分析与进化研究。[方法]利用巨桉（Eucalyptus grandsis）全基因组数据,采用BLAST等生物信息学软件分析桉树G6PDH的基因特性、蛋白序列、系统进化树以及启动子特征。[结果]桉树基因组内存在6个G6PDH基因,其编码蛋白中,1个为胞质型G6PDH,5个为质体型G6PDH,而且桉树G6PDH均含有保守基序motif 1、motif 2、motif 3、motif 7、motif 9和motif 11。此外,桉树G6PDH启动子序列中均存在TATA框、增强子与涉及光应答、激素应答、胁迫应答等调控元件。[结论]可为下一步研究桉树G6PDH家族基因的分子功能提供参考。     

甜瓜属野生种Cucumis hystrix Chakr.胞质葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因的克隆与启动子结构分析

根据植物葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH,EC1.1.1.49)氨基酸保守区域,设计简并引物,采用RT-PCR技术克隆得到甜瓜属野生种Cucumis hystrix Chakr.(2n=24)G6PDH基因cDNA片段;随后基于该序列设计特异引物,PCR方法筛选野生种BAC文库,获得2个BAC阳性单克隆。测序后获得了G6PDH基因全序列及其上游启动子序列,GenBank登录号:JQ771576。序列分析显示:G6PDH基因全长约6.5 kb,由15个外显子和14个内含子组成;内含子序列均符合5’-gt-ag-3’结构。外显子拼接后获得了G6PDH基因的开放阅读框(ORF)序列,序列全长1 551 bp,编码516个氨基酸,与黄瓜基因组网站公布的G6PDH基因核苷酸序列和氨基酸序列同源性分别为98.71%和99.03%。野生种G6PDH氨基酸序列N端缺少转运肽序列,确定为野生种胞质G6PDH。氨基酸序列与烟草、马铃薯、荷兰芹、猕猴桃、拟南芥、大豆、小麦、玉米、葡萄、杨树等植物胞质G6PDH同源性高达77%以上。系统发育树分析发现,甜瓜属胞质G6PDH与茄科植物最先聚类,植物胞质G6PDH在分子进化水平上与物种进化相符。启动子结构分析表明:序列含有启动子基本元件TATA-box、CAAT-box,还含有丰富的光响应元件,与环境胁迫响应相关的不同顺式作用元件,促进高水平转录的5UTR Py-rich stretch元件和提高表达的CAT-box元件等。     

甜杨葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因的电子克隆及其功能预测

［目的］对甜杨葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PDH）进行克隆及功能预测。［方法］采用电子克隆和RT-PCR相结合的方法首次从甜杨中分离了G6PDH基因,通过Blast和其他生物信息学软件进行功能预测。［结果］甜杨G6PDH基因的cDNA长1697bp,可编码510个氨基酸,cDNA序列及其推导的氨基酸序列均与其他植物G6PDH存在着较高的同源性,说明所获得的cDNA是甜杨G6PDH基因（PsG6PDH,AY445917）。同时,运用PCR扩增技术获得了甜杨G6PDH基因组序列,测序结果表明,基因组DNA长度为5 040bp,含有15个外显子和14个内含子。Southern杂交结果表明,G6PDH基因在甜杨的基因组中可能是单拷贝或者低拷贝。通过网络服务器平台进行PsG6DH的功能预测,结果显示,PsG6PDH为G6PDH的成员之一,含有NADP结合区和G6P结合区2个保守功能域,具有多个磷酸化位点和跨膜区域,但不含有信号肽,表明PsG6DH可能作为膜受体而起作用。另外,G6PDH的电子表达谱分析结果发现,G6PDH在多种组织和不同发育过程均表达,并涉及各种逆境胁迫应答反应,这也说明了G6PDH在植物生长反育中的重要地位。［结论］可为下一步研究PsG6PDH基因的分子功能提供参考。     

苎麻镉响应基因BnG6 PDH1的克隆和表达分析

葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH)是磷酸戊糖代谢途径的关键限速酶,为探讨G6PDH基因在苎麻耐镉机制中的作用,本研究在苎麻镉胁迫转录组的基础上,采用RACE方法从苎麻(Boehmeria nivea L.)品种中苎一号中克隆到BnG6PDH1基因(GenBank登录号为MG941010)的全长cDNA序列,该基因开放读码框为1 554 bp,编码517个氨基酸,蛋白质分子量为59 250,等电点为5.92。BnG6PDH1编码的氨基酸与川桑(XP_010111634.1)、枣(XP_015878928.1)、甜樱桃(XP_021825040.1)、苹果(XP_008362117.1)和梅(XP_008231184.1)的胞质型G6PDH蛋白的相似性较高,相似度分别为92%、91%、89%、88%和88%。组织表达特异性分析结果表明,BnG6PDH1在苎麻叶中的表达量最高,其次为茎,根部的表达量最低。镉胁迫诱导表达分析结果表明,BnG6PDH1的显著表达受镉的诱导,表达量随着镉质量浓度的增加而增加。以上结果表明,BnMYB1是一个镉应答基因,可能在植物对镉胁迫的适应中发挥重要作用。     

重组毛囊特异性表达载体的构建与验证

[目的]构建毛囊特异性表达绵羊毛角蛋白Ⅱ型中间丝9（KIF Ⅱ-9）cDNA的毛囊特异性表达载体,并证明其表达的有效性。[方法]根据绵羊毛角蛋白关联蛋白6-1（KAP6-1）基因已知DNA序列设计合成2个特异性引物,以绵羊基因组DNA为模板,通过PCR扩增得到KAP6-15’调控序列,然后与毛角蛋白Ⅱ型中间丝基因（KIFII-9）cDNA、去除CMV启动子的表达载体pcDNA3.1连接构成皮肤特异性表达载体pcDNA3.1-KK,新生小鼠皮下注射该重组载体证明其表达有效性。[结果]PCR扩增出1042 bp的特异性片段,DNA测序结果证明,该克隆片段与KAP6-1 5’端调控区序列相比具有极高的一致性;构建的毛囊特异性表达载体PCDNA3.1-KK,皮下注射新生小鼠,皮肤内KIF Ⅱ-9得到转录。[结论]该试验构建的载体PCDNA3.1-KK具有表达特异性。     

楸子S6PDH基因启动子活性鉴定

利用同源PCR技术从楸子(Malus prunifolia)基因组DNA中扩增得到6-磷酸山梨醇脱氢酶(Sorbitol-6-phosphate dehydrogenase,S6PDH)基因的启动子并命名为Mp-S-P。对启动子序列的顺式作用元件进行预测分析发现,Mp-S-P序列中除了含有植物启动子的基本结构元件外,还有多个与胁迫和激素诱导相关的元件。以β-葡萄糖苷酸酶(beta-glucuronidase,GUS)作为报告基因,构建含有pMp-S-P-GUS的融合表达载体并通过根癌农杆菌瞬时转化烟草叶片,然后分析该启动子对不同外界条件的响应。结果表明:低温、水杨酸和赤霉素处理可以提高该启动子的活性,而避光、脱落酸和茉莉酸甲酯可以降低该启动子的活性。     

水稻1,3,4-三磷酸肌醇5/6-激酶基因的电子克隆及表达

利用电子克隆的基因克隆策略,以拟南芥1,3,4-三磷酸肌醇5/6-激酶AtITL1的cDNA序列为信息探针,在水稻基因组数据库搜索到高度同源的水稻基因组序列,通过人工序列拼接及RT-PCR方法克隆得到了水稻编码1,3,4-三磷酸肌醇5/6-激酶类似物的基因OsITL1的全长cDNA序列。RNA凝胶印迹分析表明,OsITL1基因的表达在转录水平上受NaCl、干旱及ABA的诱导,OsITL1可能参与了一些非生物胁迫的应答过程,在逆境条件下的基因转录和磷酸肌醇信号转导途径的调控中起重要作用。     

籼稻胚乳特异性启动子Gt1的克隆及其功能验证

从籼稻（Oryzasativa L.ssp.indica）品种谷秆两用稻‘东南201’中克隆获得胚乳特异性启动子Gt1;序列全长为929 bp;含胚乳中特异表达所必需的正调控元件GCN4 motif（TGAGTCA）与Skn-1 motif（GT-CAT）等。与已报道的粳稻品种‘日本晴’的序列相比,籼稻‘东南201’Gt1启动子序列仅在-507 bp处发生一个碱基突变,在-268、-267、-194、-193 bp位置处分别缺失1个碱基;但在已知功能motif,两者没有任何差异。用Gt1替代35SCa MV启动子驱动GUS基因转化水稻‘台粳9号’,结果表明GUS基因仅在胚乳中特异表达,而在其它组织中未表达。克隆的籼稻谷蛋白基因Gt1的启动子序列,可为进一步开展水稻品质分子改良提供必要手段。     

大豆种子特异性启动子的分离及结构分析

 采用PCR技术从大豆品种吉林43基因组DNA中分离到大豆β-伴球蛋白α-亚基基因启动子片段（BCSP666）。序列比较和分析表明，这一启动子片段与其它两个大豆种子特异性启动子--β-伴球蛋白α′-亚基基因启动子片段和β-伴球蛋白β-亚基基因启动子--片段在序列结构上有很大的相似性，并具有多种种子特异性启动子所特有的序列元件，据此推测该启动子片段具有种子特异性启动子活性。Δ6-脂肪酸脱氢酶是亚油酸脱氢形成γ-亚麻酸的限速酶。将启动子片段BCSP666与深黄被孢霉Δ6-脂肪酸脱氢酶基因（MI D6D）连接，构建种子特异性表达载体pBMI666。通过农杆菌介导法转化大豆子叶节，在转基因愈伤组织中表达了脂肪酸脱氢酶基因（MI D6D）,获得γ-亚麻酸，初步验证了启动子片段BCSP666的启动子活性。     

黄瓜CDPK基因家族的鉴定与进化特征分析

【目的】对黄瓜基因组中CDPK基因的鉴定和进化特征的分析,为深入探索黄瓜CDPK蛋白生物学功能提供理论依据。【方法】用生物信息学方法,在黄瓜的全基因组范围内鉴定CDPK基因,并分析该基因的结构、染色体分布、进化关系及功能域。【结果】在黄瓜全基因组库中总共鉴定出17个CsCPKs,被分为4类;所有CsCPKs均含有6～8个内含子且都具有motif1～10,motif12和motif14;所编码氨基酸序列中含有4个EF-手型结构;多数CsCPKs具有棕榈酰化位点。【结论】CsCPKs都具有ATP结合、Ca2+结合和蛋白激酶活性的分子功能,参与蛋白质磷酸化的生物过程,而特有的motif决定了某些CsCPKs特有的生物学功能。     

滇龙胆草7-脱氧番木鳖酸-7-羟化酶基因的克隆与表达分析

克隆滇龙胆7-脱氧番木鳖酸-7-羟化酶基因GrDL7H,并进行表达分析,为龙胆苦苷生物合成途径的解析奠定基础。根据滇龙胆转录组GrDL7H序列,使用RT-PCR(逆转录PCR)和3′RACE(cDNA末端快速扩增)技术从滇龙胆幼叶中克隆该基因及其启动子,并进行序列分析和组织特异性表达分析。结果表明,GrDL7H基因(登录号:KT306971)全长2 154 bp,包含5个外显子和4个内含子,其中GrDL7H基因(登录号:KP340980)开放阅读框长1 542 bp,编码513个氨基酸;GrDL7H蛋白质相对分子质量为59.08 ku,等电点(pI值)为8.88,属于CYP450蛋白超家族成员,可能定位于叶绿体;GrDL7H蛋白质无信号肽,为亲水稳定蛋白质,主要由α-螺旋和环构成;GrDL7H蛋白质具有CYP450蛋白质保守结构域,功能为参与氧化还原反应;滇龙胆GrDL7H蛋白质与黄金鸡纳树CcDL7H蛋白质的亲缘关系最近;GrDL7H基因启动子主要包含6个光应答元件、1个赤霉素应答元件、6个参与茉莉酸甲酯应答的顺式调控元件和1个热胁迫应答元件等;组织特异性表达分析结果表明,GrDL7H基因主要在叶片中表达。     

铁皮石斛热激转录因子(Hsf)基因家族鉴定及生物信息学分析

[目的]鉴定铁皮石斛热激转录因子(Hsf)基因家族成员,并进行生物信息学分析,为深入研究该家族在铁皮石斛热应激响应中的调控机制提供理论参考.[方法]以拟南芥和水稻Hsf蛋白氨基酸序列为参考序列,在铁皮石斛蛋白数据中搜索其同源蛋白序列,利用SMART和Pfam数据库鉴定出其Hsf基因家族成员.利用生物信息学方法对铁皮石斛Hsf基因家族组成、基因结构、启动子区顺式作用元件及其编码蛋白结构域和进化关系等进行分析.[结果]共鉴定获得23个铁皮石斛Hsf基因家族成员,编码氨基酸数量为132~514个,平均343个,多数属于酸性蛋白和亲水性蛋白,可分为HsfA、HsfB和HsfC组,其中HsfA组成员13个、HsfB组成员9个、HsfC组成员1个.除DoHsfA3仅包含motif 1和motif 2外,其他HsfA组蛋白均含有motif 1~motif 5,HsfB和HsfC组蛋白均缺少motif 5.铁皮石斛Hsf蛋白缺少A9、B3、B5和C1亚类成员,与同属于单子叶兰科植物的小兰屿蝴蝶兰Hsf蛋白亲缘关系最近.HsfA组成员包含完整的HSF功能域和卷曲螺旋(CC)功能域,HsfB和HsfC组成员缺少或含不完整的CC功能域.DoHsfA1A蛋白具有保守的丝氨酸—苯丙氨酸—缬氨酸—精氨酸—谷氨酰胺序列.铁皮石斛Hsf基因启动子区含有大量激素响应、胁迫响应和生长相关元件.[结论]铁皮石斛Hsf基因家族成员进化较保守,其生物学功能存在明显物种特异性,进化关系较复杂,推测其在不同的非生物胁迫和植物激素信号途径中发挥潜在"节点"作用.     

松材线虫和拟松材线虫14-3-3蛋白基因全长cDNA克隆与分析

[目的]对松材线虫和拟松材线虫的14-3-3蛋白基因进行全长cDNA克隆,并进行序列分析。[方法]根据GenBank数据库中14-3-3蛋白EST序列BXC56（登录号为FG589472）、BMCl20（登录号为FG589351）,采用RACE技术获取松材线虫和拟松材线虫14-3-3蛋白的全长cDNA克隆Bxl4-3-3a和Bml4-3-3a,并对克隆片段序列进行分析。[结果]Bx14-3-3a全长1039bp,包含一个756bp的开放阅读框,编码蛋白含有251个氨基酸残基,包含2个14-3-3蛋白标签,编码蛋白分子量为61．43kD,等电点为4．88。Bx14-3-3a基因组结构中包含4个外显子和3个内舍子序列。Bm14-3-3a全长992bp。有与Bx14-3-3a编码完全相同的氨基酸序列。序列比对结果表明,14-3-3在真核生物间高度保守,Bx14-3-3A和Bm14-3-3A蛋白在系统进化上与线形动物门（Nematomorpha）的物种近缘关系较近,与植物线虫南方根结线虫（Meloidogyneincognita）系统发育关系上最为亲近。[结论]Bx14-3-3a和Bm14-3-3a的成功克隆,为进一步研究其功能及其调控因子对形态、致病力、繁殖力和环境适应性等方面的分子调控机制奠定了重要基础。     

黑木耳YBS-3菌株ras启动子的克隆与分析

[目的]从黑木耳（Auricuraliaauricular）基因组中克隆内源Ⅻ启动子，为黑木耳利用基因工程培育优良品种提供启动子元件材料。[方法]利用PCR技术，以黑木耳菌株YBS一3基因组DNA为模版，克隆得到4条／ras启动子片段。采用启动子序列分析软件Place、Promoterprediction和TFSEARCHver．1．3对其进行序列结构分析。[结果]4条启动子片段均含有核心启动子序列，除典型的基本作用元件TATAbox和CAATbox外，还有许多其他重要作用元件如GATABOX、GCGCBOX和CCAATBOXl等，同时每条片段中均至少具有1个转录起始位点，且检测到HSF、AP-1、GCN4等多个转录因子结合位点。[结论]4条目的序列在理论上具有较强的启动子活性功能。     

大豆LIM转录因子家族鉴定及盐胁迫响应分析

为探究大豆LIM转录因子家族基因在应答盐胁迫中的功能,利用生物信息学方法,根据大豆全基因组数据,共鉴定出21个LIM基因,命名为GmLIM01～GmLIM21,分析大豆LIM基因家族的染色体位置、蛋白质的理化性质、进化关系、保守基序以及对非生物逆境胁迫的响应。结果表明,这些GmLIM基因在大豆20条染色体中的14条染色体上分布不均,片段重复是大豆LIM家族扩大的主要原因。根据系统发育进化分析,大豆21个LIM基因可分为5个亚家族,与其他9个物种的LIM基因一起构建进化树,也可分为5个亚家族。大豆的21个GmLIM基因共包含10个基序,大部分LIM蛋白含有motif 1、motif 2和motif 4这3个保守基序。此外,顺式调控元件的分析表明,在GmLIM基因的启动子序列中,与光响应、生长发育、植物激素和非生物逆境胁迫应答相关的调控元件非常丰富。定量PCR结果表明,在盐胁迫处理后大豆叶和根中GmLIM07、GmLIM17基因的表达量分别在3和6 h达到峰值,后随着处理时间的加长表达量下降。综上GmLIM基因在大豆的盐胁迫应答过程中具有重要的调控作用。     

西葫芦果径主基因-多基因混合遗传分析

[目的]为西葫芦果径育种提供依据。[方法]选用西葫芦自交系配制q-1×23-4G（组合1）和q-1×A-7（组合2）2个组合,构建了P1、F1、P2、BC1、BC2和F2 6个家系世代群体,应用植物数量性状主基因-多基因混合遗传模型对6个世代群体果径进行了多世代联合分析。[结果]2个组合的西葫芦的果径性状遗传为加性-显性-上位性2对主基因（B-1）遗传模型;2个组合F2的主基因遗传率较高,环境影响相对较小。[结论]西葫芦果径育种宜早代选择。     

正响应盐胁迫的甘蔗 6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因的克隆

从甘蔗中克隆获得1个6PGDH基因的eDNA序列,记为Se6PGDH（登录号：KD21299）．该基因序列含有1个1467bp的完整开放阅读框,推导编码488个氨基酸残基．生物信息学分析可知,Sc6PGDH基因编码的蛋白分子质量为53．6561ku,为酸性稳定的亲水蛋白,含有信号肽,可能定位于内质网膜上,具有该类蛋白典型的保守结构域6PGD,且与分离自谷子、玉米和水稻的6-磷酸葡萄糖脱氢酶的氨基酸序列同源性分别高达96．11％、95．70％和93．24％,表明该基因在进化过程中比较保守．原核生物生长试验结果显示,甘蔗S-6PGDH基因的表达蛋白可以显著增强大肠杆菌Rosetta菌株的耐盐性,推测该基因可能参与了生物体对盐胁迫的应答过程．