结球甘蓝叶片卷曲相关7 个同源异型盒基因的克隆与表达分析

 以结球甘蓝（Brassica oleracea L.）‘519’品系为试材,通过结球期茎尖和叶片以及莲座期 茎尖和叶片的转录组对比分析,筛选出4 个显著差异表达HB 类基因,分别为BoHAT2、BoHB12、BoHB7 和BoHB27。进一步对上述4 个基因以及调控拟南芥（Arabidopsis thaliana）叶片卷曲但在结球甘蓝转录 组中未检测到表达差异的基因BoPHB、BoPHV 和BoREV 进行了同源克隆。序列分析表明上述7 个基因 都含有同源异型域（homeodomain,HD）,具有同源异型盒（homeobox,HB）蛋白家族的典型结构特征。 BlastP（蛋白序列与蛋白库做比对）表明它们与拟南芥的同源蛋白相似性高,来自结球甘蓝的BoHAT2、 BoHB12、BoHB7、BoHB27、BoPHB、BoPHV、BoREV 与拟南芥中的HAT2、ATHB12 、ATHB 7、ATHB27、 PHB、PHV、REV 蛋白同源,同源性分别为86%、80%、79%、60%、94%、95%和96%。BlastP 比对和 进化树分析结果表明,BoHAT2 属于HD-ZipⅡ类,BoHB12 和BoHB7 属于HD-ZipⅠ类,BoHB27 属于 ZF-HD,BoPHB、BoPHV 和BoREV 属于HD-Zip Ⅲ类。BoHAT2、BoHB12、BoHB7、BoHB27、BoPHB、 BoPHV、BoREV 在结球甘蓝莲座期到结球期的茎尖和叶片中均有表达,BoHB12 和BoHB7 在结球期叶片 中表达量显著增高,分别是莲座期叶片的38.1 倍和6.2 倍,其余基因表达量差异不明显,表明BoHB12 和 BoHB7 可能是结球甘蓝球叶自然卷曲过程中的主效调控基因。     

本期导读

<正>《中国蔬菜》网络实时互动视频直播节目"种业会客厅"于2015年10月12日晚7:30首播,这是在李克强总理"互联网+"号召下的大胆创新。黄瓜虽然不是重庆、上海地区的主栽蔬菜作物,但一直居于重要地位,且品种特点突出。生长素在结球甘蓝球叶向上、向内卷曲过程中发挥着重要的调控作用,蒲全明等筛选出6个生长素相关基因,其中3个基因可能与结球甘蓝叶片的卷曲发育密切相关。     

桃生长素反应因子和生长素/吲哚乙酸蛋白家族基因的克隆及表达分析

生长素对果实发育起着重要的调控作用。生长素反应因子（auxin response factor,ARF）和生长素/吲哚乙酸蛋白（auxin/indoleacetic acids protein,Aux/IAA）是生长素信号转导系统中的两个关键因子,在转录水平上对生长素参与的生理活动进行调控。为探索生长素调控桃果实发育的机制,选取ARF家族的1 个基因PpARF1,Aux/IAA 家族的5 个基因PpIAA3、PpIAA9、PpIAA17、PpIAA26 和PpIAA29,克隆其全长cDNA 序列并进行生物信息学分析,对它们在桃果实不同发育时期中果皮和种子的表达进行qRT-PCR 检测。序列分析表明：这6 个基因的编码区全长分别为2 037、594、1 194、618、384 和723 bp,分别编码678、197、397、205、127 和240 个氨基酸;氨基酸序列比对分析显示桃PpARF1 蛋白序列和草莓的FvARF1（XP_004300014.1）同源性最高,达到90.56%,PpIAA 家族的5 个蛋白同源性很低,只有23.77%;荧光定量PCR 结果显示,在花后52 d（果实发育硬核期）,PpIAA3 和PpIAA17 在中果皮中的表达量显著升高;PpIAA26、PpIAA29 和PpARF1 在种子中的表达量显著升高。预示生长素可能在桃果实发育硬核期发挥着重要的调控作用。     

四倍体大白菜叶球形成中内源激素变化及相关基因表达分析

以叠抱类型和舒心类型四倍体大白菜为试材,采用实时荧光定量(qRT-PCR)方法对中脱落酸相关基因Bra018800和生长素相关基因Bra018750进行表达量分析,并利用酶联免疫法对其内源激素进行测定,研究了四倍体大白菜叶球形成内源激素变化及相关基因表达变化,以期为后继研究四倍体大白菜不同叶球类型形成的机理提供参考依据。结果表明:Bra018800和Bra018750基因分别在叠抱类型四倍体大白菜的包心期和莲座期表达量达到最高,比舒心类型同时期表达量高2.56~2.80倍和5.18~6.59倍。内源激素测定结果表明,脱落酸(ABA)和生长素(IAA)2种激素在叠抱和舒心四倍体大白菜2类材料中表现为差异显著。其中ABA在叠抱类型四倍体大白菜的包心期含量达最高,比舒心类型四倍体大白菜同一时期的含量高2.05~2.12倍,与脱落酸相关基因Bra018800在2种类型材料中的表达趋势相一致;在叠抱类型四倍体大白菜莲座期IAA含量显著高于舒心类型同时期的2.58~2.60倍,与生长素相关基因Bra018750在2种类型材料中的表达趋势相一致。综上所述,Bra018750和Bra0188002个基因调控内源激素IAA和ABA的合成,分别在四倍体大白菜包心期和莲座期对叶球类型的形成起着关键性作用。     

大白菜杂交种和亲本之间基因表达差异分析

利用cDNA-AFLP技术研究大白菜白引2号杂交种及其亲本在幼苗期、莲座期、结球期的基因差异表达。结果表明：在3个发育期,发现有29条差异片段,其中5个差异片段出现在幼苗期,14个差异片段出现在莲座期,10个差异片段出现在结球期|19个差异片段在杂种中表达,3个差异片段在双亲中同时表达,2个差异片段仅在母本中表达,5个差异片段仅在父本中表达。将29个差异片段的序列在白菜基因组序列数据库网站（http://brassicadb.org/brad/）进行BLAST分析,均找到了对应的染色体位置。其中17个差异片段分别有明确的基因及编码蛋白与其相对应。其中有两个基因片段分别含有AP2/EREBP结构域和PPR结构域,这两个结构域在控制植物生长发育方面具有重要作用。     

桃生长素酰胺水解酶基因家族序列特征及其表达分析

生长素酰胺水解酶（IAA-Leucine Resistant1-like Hydrolase,ILL）可催化生长素结合态释放游离态生长素（IAA）。为了深入研究桃ILL基因家族的功能,对桃基因组中ILL基因家族成员的数量、在染色体骨架的分布、编码蛋白质的结构、基因表达模式和编码氨基酸的进化树分类等方面进行了研究。桃基因组中共鉴定出了9个ILL基因,它们分布在4个染色体骨架上（scaffold 1、2、3和7）。在桃中编码ILL蛋白家族的基因成员分别为：PpILR1、PpILR2、PpILR3、PpILR4、PpILL1、PpILL2、PpILL3、PpILL4和PpILL5,所有这些预测的蛋白都含有M20结构域和M20二聚化结构域。运用荧光定量实时PCR技术对该基因家族在桃果实生长发育各阶段的表达水平进行了分析,结果显示：ILL 基因家族中的数个成员在果实不同发育阶段表达水平有变化,其中PpILR1的表达量在果实生理成熟期明显上调。     

基于银杏花芽3个分化时期转录组测序的相关基因筛选与表达分析

鉴定银杏花芽分化调控的关键基因,揭示银杏花芽分化调控的主要分子机制,为缩短银杏童期和选育银杏早花品种提供理论指导。本研究中采用高通量测序技术对银杏花芽分化3个时期（花芽未分化期、花芽分化始期、花芽分化盛期）的样品进行转录组测序,并分析数字表达谱,筛选开花调控相关基因并进行荧光定量PCR（RT-qPCR）表达验证。转录组测序共产生27.52 Gb原始数据,注释到8大功能数据库（GO、COG、KEGG、KOG、NR、Pfam、Swiss-Prot、eggNOG）上的 unigene 总数为35 179个。通过GO分类和KEGG Pathway 富集性分析,将unigene分别归于55个GO类别和126个代谢途径。差异表达基因分析显示,花芽未分化期较花芽分化始期有2 253个基因上调,2 032个基因下调;花芽分化始期较花芽分化盛期有1 770个基因上调,1 901个基因下调;花芽未分化期较花芽分化盛期有1 865 个基因上调,2 042个基因下调。发掘出大量的开花相关的基因涉及5个开花调控途径（光周期途径、春化途径、赤霉素途径、自主途径和年龄途径）。筛选出gene.Gb_17618（GI序列）、gene.Gb_19790（FT/TFL1序列）、gene.Gb_16301（AG序列）、gene.Gb_28337（花发育MADS-box序列）、gene.Gb_01884（SOC1序列）和gene.Gb_41704（CO序列）等6个银杏花芽分化差异表达关键基因序列,荧光定量PCR检测表达水平与转录组结果一致。     

三褶虾脊兰CtARF57和CtIAA12基因克隆及功能分析

以三褶虾脊兰(Calanthe triplicata)不同发育时期的花瓣距为试材，基于转录组测序数据，通过克隆获得生长素信号转导途径中CtARF57和CtIAA12基因全长序列，并进行生物信息学分析，探究园林花卉三褶虾脊兰生长素相关响应因子(ARF和Aux/IAA)的表达特性及功能，以期揭示三褶虾脊兰花瓣距的发育机理。结果表明：cDNA全长为3 054 bp和1 124 bp,分别编码911、177个氨基酸。2个基因氨基酸序列与铁皮石斛同源基因的相似性较高，均超过84%。保守结构域分析表明CtARF57蛋白具有B3结构域、Auxin＿resp结构域和Aux/IAA结构域；CtIAA12具有Aux/IAA蛋白的DomainⅠ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ特异性结构域。实时荧光定量PCR结果显示，其转录水平受到生长素的诱导，不同时期基因表达水平差异明显，2个基因均在三褶虾脊兰花瓣距发育最后一个时期表达量最高，前2个时期表达量较低，与转录组FPKM值趋势一致。综上所述，初步推测2个响应因子基因参与生长素信号传导途径并调控园林花卉三褶虾脊兰花瓣距的形态建成和生长代谢过程。     

梅花PmMYB21在花丝伸长过程中的功能与表达调控分析

MYB21是调控雄蕊花丝伸长的关键转录因子。以梅花（Prunusmume）早花品种‘粉红朱砂’与晚花品种‘早绿萼’的花芽为材料，分别克隆得到两个序列完全一致的PmMYB21。序列分析表明PmMYB21蛋白含有MYB转录因子的R2R3保守结构域，系统进化分析表明PmMYB21与其他物种的MYB21有较高的同源性，亚细胞定位结果显示其位于细胞核内。PmMYB21的表达水平在两个梅花品种开花过程中随花丝伸长而升高；相对于晚花品种，早花品种表达上调时间显著提前。在两个梅花品种的PmMYB21启动子–1 529～–1 243 bp区域中均检测到CG序列型的甲基化水平下调，该区域甲基化水平与PmMYB21的表达量呈负相关；并在此区域检测到脱落酸、赤霉素和光响应元件，推测这些调控过程可能受到甲基化修饰的影响。加权基因共表达网络分析（WGCNA）结果显示，5296个差异表达基因与Pm MYB21具有连通性，显著富集于激素响应等生物过程。结合WGCNA筛选结果和表达趋势分析，预测Pm MYB21介导生长素（IAA）、赤霉素（GA）和茉莉酸（JA）等激素的信号转导，进而参与梅花花丝的伸长。     

苹果‘长富2号’开花调控转录因子基因MdSPL6的克隆及表达分析

以‘长富2号’苹果短枝顶芽为材料,采用RT-PCR方法克隆得到1个候选开花调控转录因子基因SQUMOSA PROMOTER BINDING PROTEIN LIKE(SPL),含有570 bp开放阅读框,编码189个氨基酸。序列比对发现,该基因含有一个保守的SBP结构域和核定位信号,属于SBP转录因子基因家族。系统进化分析表明,MdSPL6蛋白的核苷酸序列与拟南芥AtSPL3、AtSPL4和AtSPL5具有较高的同源性。实时定量PCR分析结果表明,在不同的组织中MdSPL6的表达量存在差异,在叶片和顶芽中的表达量相对较高。易成花的‘烟富6号’苹果短枝顶芽内MdSPL6的表达高于难成花的‘长富2号’。外源GA处理诱导MdSPL6的表达在花后40和60 d下调;6-BA处理使MdSPL6的表达呈现先上升后下降趋势;蔗糖处理促使MdSPL6表达上调。推测MdSPL6对激素和糖信号介导的成花诱导有重要作用,可作为调控苹果花芽分化的目标基因。     

不同基因型大白菜对外源钙敏感性鉴定评价

为探讨大白菜钙敏感性鉴定的便捷指标,以20个大白菜品种为试材,研究不同钙水平对大白菜不同生育期干烧心指数及植株生长量、叶片叶绿素含量及钙含量的影响。结果表明:不同基因型大白菜干烧心指数差异较大,总体上均随钙水平的升高明显降低,而相同钙水平下则随生育期延长而升高;幼苗期钙水平0 mmol·L~(-1)和莲座期、结球期钙水平0.5mmol·L~(-1)处理的干烧心指数聚类结果基本一致。采用多元逐步回归分析建立的幼苗干烧心指数回归模型中,仅幼苗期0.5mmol·L~(-1)与4.0 mmol·L~(-1)钙水平下的植株鲜质量及叶片叶绿素含量相对值入选,且以入选变量为参数进行聚类分析的结果与幼苗期干烧心指数聚类结果完全一致,均可将参试大白菜品种分成钙敏感型、钙迟钝型和中间型3类,说明幼苗期0.5mmol·L~(-1)和4.0 mmol·L~(-1)钙水平下的大白菜植株鲜质量与叶片叶绿素含量相对值可作为大白菜品种钙敏感性鉴定的便捷指标。     

菜薹（菜心）对土壤中重金属的富集特征及产地土壤安全临界值

通过采集珠三角地区蔬菜产地原位土壤（非人工添加重金属）进行盆栽试验，研究了Cd、Pb、As、Hg、Cr 5种重金属在种植菜薹土壤中的活性，菜薹可食部分对土壤中全量和有效态重金属的富集特征，并探讨了5种重金属在土壤产地环境中的安全临界值以及土壤理化性质对菜薹吸收重金属的影响。结果表明：种植菜薹的土壤中重金属的活性顺序为Cd＞Pb＞As＞（Cr、Hg），菜薹对重金属的富集能力顺序为Cd＞Cr＞As＞Pb。依据《食品中污染物限量》（GB2762-2005）进行方程拟合，得出适合菜薹种植土壤的重金属全量限量值分别是：Cd，1.18 mg?kg-1|Pb，401.93 mg?kg-1|As，25.67 mg?kg-1|Cr，150.71 mg?kg-1，有效态重金属限量值分别是：Cd，0.64 mg?kg-1|As，3.05 mg?kg-1|Cr，4.93 mg?kg-1。菜薹对Hg富集能力弱，在供试土壤Hg浓度范围内菜薹中Hg含量均未超过限量值。     

大白菜BrAOP2 基因的遗传多样性及其与硫甙含量的相关性分析

以大白菜品种Chiifu 为试验材料, 采用RT-PCR 技术, 克隆了3 个硫甙合成关键基因
BrAOP2 基因的cDNA 序列（BrAOP2.1、BrAOP2.2、BrAOP2.3）。通过氨基酸同源性比对分析,BrAOP2.1
与BrAOP2.2 的同源性为78%,BrAOP2.1 与BrAOP2.3 的同源性为74%,BrAOP2.2 与BrAOP2.3 的同源
性为81%。通过32 份大白菜重测序数据分析了3 个BrAOP2 基因CDS 序列的遗传多样性,并对其与硫甙
含量的相关性进行了分析。结果表明：在32 份大白菜中共检测到7 种硫甙,其中4-戊烯基硫甙（GBN）
含量和2-羟基-3-丁烯基硫甙（PRO）含量较高,分别占总硫甙含量的23.99% 和23.16%。在BrAOP2.1
基因编码区检测到5 个变异位点,在BrAOP2.2 基因编码区检测到7 个变异位点,在BrAOP2.3 基因编码
区仅检测到1 个变异位点。其中BrAOP2.1 基因的A1051G 变异位点与PRO 含量极显著相关,BrAOP2.2
基因的A560G、C753T、A790G 和T927C 变异位点与PRO 含量显著相关,BrAOP2.2 基因的G825A 位点
与4-羟基-3-吲哚基甲基硫甙（4OH）含量显著相关。     

芸薹属5种紫红色蔬菜花青素苷含量及组分分析

采用高效液相色谱-质谱法对芸薹属中红叶芥菜、紫红色大白菜、红菜薹、紫色白菜和紫结球甘蓝新鲜叶片所含花青素苷含量和组成进行鉴定。结果表明,这些蔬菜中花青素苷主要组分为矢车菊素苷,兼有少量的飞燕草素苷和矮牵牛素苷。红叶芥菜、紫红色大白菜、紫色白菜和红菜薹中均含有矢车菊–3–p–香豆酰–丙二酰–葡萄糖苷–5–葡萄糖苷、矢车菊–3–阿魏酰–丙二酰–槐糖苷–5–葡萄糖苷和矢车菊–3–芥子酰–阿魏酰–槐糖苷–5–丙二酰–葡萄糖苷,分别达到总量的46.51%、56.04%、46.38%和68.96%。紫结球甘蓝主要花青素苷成分为矢车菊–3–芥子酰–槐糖苷–5–葡萄糖苷,矢车菊–3–槐糖苷–5–葡萄糖苷和矢车菊–3–p–香豆酰–槐糖苷–5–葡萄糖苷,分别达到总量的41.87%、20.58%和16.02%。花青素苷含量最高的是红叶芥菜,为719.04 μg · g-1 FW;其次是紫红色大白菜,为604.03 μg · g-1 FW;第三是紫结球甘蓝,为264.96 μg · g-1 FW;最低的是红菜薹和紫色白菜,分别为219.07 和130.02 μg · g-1 FW。紫红色大白菜中检测到2 种特有的矢车菊素苷和1 种矮牵牛素苷。     

萝卜胞质结球芥和长柄芥雄性不育系的选育

以新萝卜胞质雄性不育大白菜为不育源,育成了结球芥及长柄芥雄性不育系。这些芥菜不育系的植株和花器官生长正常,表现100% 的雄性不育,且育性稳定;所配制的杂交组合杂种优势明显,杂交种制种产量正常。     

结球甘蓝抗寒性配合力分析及优良抗寒组合选育

通过自交分离和抗寒性鉴定,选育出经济性状优良的结球甘蓝抗寒自交系逾30份,以其中6份抗寒性有一定差异的自交系为试材,按照Griffing双列杂交方法Ⅳ进行甘蓝抗寒性配合力及遗传力分析。结果表明：甘蓝抗寒性遗传符合加性-显性模型,以加性效应为主,随着寒害程度的增加其加性效应所占比重增加|一般配合力方差在总遗传方差中所占比重较大,一般配合力/特殊配合力的均方比大于7,且差异达极显著水平,因此在甘蓝抗寒育种中应重视早期世代的选择。结合配合力测定结果及田间经济性状调查结果,初步明确两个优良抗寒越冬甘蓝新组合。     

复绿铃微肥在大白菜上的肥效试验

为验证复绿铃微肥在大白菜上的增产效果并其确定最佳施用方法,在大白菜上进行了复绿铃不同施用方法的随机区组肥效试验,通过分析对照和复绿铃不同处理的大白菜小区产量、外叶和叶球质量,发现施用复绿铃后大白菜产量有显著提高,对其外叶和叶球生长都有一定的促进作用。通过综合分析发现,大白菜莲座期喷施复绿铃增产效果最好,比对照增产27.3%,结球期喷施复绿铃效果次之。     

结球甘蓝自花和异花授粉诱导的柱头转录组分析

分别以自花授粉30 min、异花授粉30 min和未授粉处理的甘蓝柱头进行Illumina HiSeq2000高通量转录组测序,分析自交不亲和性甘蓝自花授粉、异花授粉柱头与未授粉柱头中基因表达的差异。转录组测序共获得1.6 × 108对原始序列读取片段,总碱基数为2.38 × 1010 bp,与未授粉对照相比,自花、异花授粉后差异表达的基因分别有2 900个和2 328个,共有的差异表达基因1 904个。在差异表达基因背景和全部基因背景下,自花授粉较大比例的差异基因是细胞杀伤、胞外基质部分和核酸结合转录因子活性;异花授粉较大比例的差异基因是信号传递、胞外区域部分、结构分子活性和营养库活性。GO功能的显著性富集分析表明,自花授粉处理后特有的40个极显著的富集条目主要涉及糖跨膜转运活性、微管结合和钙调素依赖性蛋白激酶活性等。异花授粉特有的53个极显著的富集条目主要涉及法尼酸O–甲基转移酶的活性、微管负向运动和生长素跨膜运输等。自花授粉处理后特异差异表达的996个基因主要涉及钙离子结合、细胞骨架相关、茉莉酸和水杨酸代谢等生物过程,异花授粉处理后特异差异表达的424个基因主要涉及物质跨膜转运及脂质代谢。