柑橘黄龙病病原菌的鉴定及16S rDNA序列分析

采用Nested-PCR技术检测顺昌果园红心柚树中柑橘黄龙病病原的携带情况,通过黄龙病病原菌16S rDNA测序和构建系统发育树比较不同类型柑橘黄龙病原菌之间的进化关系,采用特异引物扩增16S rDNA片段鉴别不同黄龙病病原菌,结合限制性内切酶酶切确定该红心柚园黄龙病病原的类型,并分析不同类型柑橘黄龙病病原16S rDNA序列差异性.结果表明:所取的12株红心柚树叶片样品中有7株树的叶片中检测出黄龙病病原,黄龙病病原的阳性检出率为58.33％,其中4个为显性性状,3个为隐性性状.柑橘黄龙病病原菌16SrDNA进化分析及限制性内切酶XbaI酶切结果表明,顺昌柑橘黄龙病病原菌属于亚洲型.不同类型柑橘黄龙病病原菌16S rDNA的序列差异性分析表明,亚洲种与非洲种的差异性为2.75％,非洲种与美洲种的差异性为3.90％,亚洲种与美洲种的差异性为3.44％.     

广西砂糖橘黄龙病亚洲种的Nested—PCR检测

【目的】利用柑橘黄龙病病原亚洲种16S rDNA序列的特异引物检测疑似黄龙病的砂糖橘叶片样品,为砂糖橘黄龙病的综合防控提供理论依据。【方法】选取采自广西9市17个采样点的214份疑似黄龙病及无症状砂糖橘叶片样品,用试剂盒法提取叶脉基因组DNA,采用柑橘黄龙病亚洲种16S rDNA特异引物进行PCR扩增,扩增结果在1%琼脂糖凝胶电泳上检测,统计待检样品柑橘黄龙病病原菌亚洲种的带菌率。【结果】对214份样品的Nested-PCR扩增结果,部分样品可得到1160 bp左右的特异条带,与预期大小相符但条带明暗不同。来自广西9市17个采样点的砂糖橘叶片样品均检测出黄龙病亚洲种病原,平均检出率均在66.0%以上,其中检出率最高的是来自东兴市的样品,检出率为100.0%,检出率最低的是来自南宁市的样品,检出率为66.9%;斑驳、缺素型黄化、叶脉黄化、小叶和无症状叶片样品中均可检测出黄龙病亚洲种。【结论】Nested-PCR技术具有灵敏度高、特异性强的特点,能够快速、准确检测出各种症状样品的黄龙病病原,可用于柑橘黄龙病的早期诊断。     

甘蔗近缘属种23S-4.5S-5S rDNA内转录间隔区序列分析

【目的】探讨叶绿体23S-4.5S-5S rDNA内转录间隔区序列在甘蔗近缘属种系统进化中的应用,为深入研究甘蔗近缘属种系统进化提供参考。【方法】以14个甘蔗近缘属种材料为研究对象,测序分析其23S-4.5S-5S rDNA内转录间隔区序列,并应用BLAST分析其在禾本科中的变异情况。【结果】23S-4.5S-5S rDNA内转录间隔区序列在14个甘蔗近缘属种材料间的同源性为100%,属于高度保守区域,但在禾本科各亚科间表现出一定的变异,且在各亚科中都存在其特异的变异位点。【结论】23S-4.5S-5S rDNA内转录间隔区序列在甘蔗近缘属种间属于高度保守的区域,不适合用于甘蔗近缘属种间系统进化的分析,但可为禾本科亚科系统进化的分析提供有用的信息。     

柞蚕微孢子核糖体基因和转录间隔区的序列及系统进化分析

【目的】研究柞蚕微孢子（Nosema antheraeae）的核糖体基因，转录间隔区（ITS）以及它们的排列顺序，为柞蚕微孢子的分类和系统进化分析提供分子生物学方面的依据。【方法】采用特异引物进行PCR扩增，克隆和测序。用DNAStar软件，用Clustal W 的比对方法得到遗传距离和系统进化树。【结果】得到柞蚕微孢子的核糖体小亚基rRNA（SSU rRNA），转录间隔区（ITS），5S rRNA的全长，得到核糖体大亚基rRNA（LSU rRNA）的部分序列。【结论】柞蚕微孢子的核糖体基因排列顺序为LSU－ITS1－SSU－ITS2－5S与Nosema bombycis 相同，是一种比较特殊的排列方式。将微孢子SSU rRNA基因和ITS结合起来分析微孢子的亲缘关系是一个新的尝试。     

柑橘黄龙病亚洲种RPA快速检测方法的建立

黄龙病是世界柑橘产业的毁灭性病害,引起柑橘黄龙病的病原分为亚洲种、非洲种和美洲种共3个种,目前我国柑橘黄龙病均由亚洲种引起,建立一套快速检测技术对我国柑橘黄龙病的防控具有重要意义.本研究根据柑橘黄龙病亚洲种16S rDNA基因序列设计引物,建立了基于重组酶聚合酶等温扩增(RPA)的检测方法,并评价了该方法的灵敏度和检测准确性.结果表明,本研究所建立的柑橘黄龙病亚洲种RPA快速检测方法特异性强、灵敏度高、操作过程简便,检测灵敏度比常规PCR提高10倍,为基层农技人员开展柑橘黄龙病的快速检测提供了一种新方法.     

甘蔗近缘属种23S-4．5S-5SrDNA内转录间隔区序列分析

【目的】探讨叶绿体23S-4．5S-5SrDNA内转录间隔区序列在甘蔗近缘属种系统进化中的应用,为深入研究甘蔗近缘属种系统进化提供参考。【方法】以14个甘蔗近缘属种材料为研究对象,测序分析其23S-4．5S-5SrDNA内转录间隔区序列,并应用BLAST分析其在禾本科中的变异情况。【结果】23S-4．5S-5SrDNA内转录间隔区序列在14个甘蔗近缘属种材料间的同源性为100％,属于高度保守区域,但在禾本科各亚科间表现出-定的变异,且在各亚科中都存在其特异的变异位点。【结论】23S-4．5S-5SrDNA内转录间隔区序列在甘蔗近缘属种间属于高度保守的区域,不适合用于甘蔗近缘属种间系统进化的分析,但可为禾本科亚科系统进化的分析提供有用的信息。     

南方5省区柑橘黄龙病病原16S rDNA片段的克隆与序列分析

采集了广东、广西、贵州、福建、云南5省区的8个柑橘黄龙病样品,利用黄龙病病原的特异引物对其16S rD-NA片段进行PCR扩增,将其扩增产物纯化、回收,并与 pMD18-T Vector 连接,转化大肠杆菌(Esherichia coli)DH5α,筛选含有黄龙病病原16S rDNA片段的阳性克隆,进行序列测定.利用生物信息学软件对所克隆的序列进行同源性分析和聚类分析.结果表明:来自我国南方5省区的柑橘黄龙病病原16S rDNA的序列与亚洲种(L22532)的同源性为96.9%～98.6%,与非洲种(L22533)的同源性为94.5%～97.1%,与美洲种(AY742824)的同源性为92.5%～94.2%.表明我国南方5省区柑橘黄龙病均属于亚洲种,但在亚洲种内部不同地区的黄龙病病原也发生了微小的变异,其中福建厦门和云南个旧的2个菌株变异较大.     

粘虫核糖体蛋白S11基因cDNA的克隆和序列分析

【目的】克隆和鉴定粘虫核糖体蛋白S11(Ribosomal Protein S11,RPS11)基因,为昆虫核糖体蛋白功能的研究提供基础资料。【方法】运用RT-PCR和RACE技术,以粘虫cDNA为模板,对RPS11基因进行克隆,获得其全长cDNA序列,并利用生物信息学方法,对RPS11基因全长cDNA序列及推测得到的RPS11蛋白氨基酸序列进行分析,构建其系统进化树。【结果】获得的粘虫核糖体蛋白S11基因(RPS11)cDNA序列长度为521 bp,其中包括26 bp的5′非编码区、36 bp的3′非编码区和459 bp的开放阅读框,编码一个由152个氨基酸组成的蛋白,其具有核糖蛋白S17蛋白家族典型特征。推测得到的粘虫RPS11蛋白的理论分子质量为17.737 9 ku,等电点为10.63,富含6种类型的特定功能位点,与同属夜蛾科的烟芽夜蛾(Heliothis virescens)的RPS11蛋白相似性高达97%。用Neigh-bor-joining(NJ)法构建基于RPS11氨基酸序列的系统发育树,结果显示,粘虫RPS11与烟芽夜蛾(H.virescens)、草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)和家蚕(Bombyx mori)等3种鳞翅目昆虫的亲缘关系较近。【结论】成功获得了粘虫RPS11基因全长序列(GenBank登录号为GQ222274),由其编码的核糖体蛋白RPS11属于核糖蛋白S17蛋白家族。     

柑橘黄龙病菌核糖体蛋白基因的多态性及系统发育分析

通过PCR扩增6个不同地区柑橘黄龙病(citrus huanglongbing,HLB)病原菌的核糖体蛋白基因,采用4种不同的限制性内切酶对PCR产物进行限制性片段长度多态性(RFLP)分析;并对核糖体蛋白基因克隆和测序后,使用DNAman和NCBI Blast等软件对基因序列进行比对分析,并通过软件Mega4.1构建其系统发育树.结果表明:6个分离物核糖体蛋白基因的RFLP指纹图谱有所差异,表现出一定的多态性;不同分离物核糖体蛋白基因的核酸序列和氨基酸序列均存在差异,但相互之间同源性很高,其中核酸序列与数据库中亚洲种(Candidatus Liberibacter asiaticus)的同源性高达99%～100%,与非洲种(Ca.L.africanus)的同源性为85%,与美洲种(Ca.L.americanus)的同源性为77%～80%;系统发育分析显示所有的Ca.L.asiaticus亲缘关系极近,归为一个类群,而后与Ca.L.africanus和Ca.L.americanus组成韧皮部杆菌属(Candidatus Liberibacter)一个大的类群.     

云南小驳骨丛枝植原体的分子鉴定及相关基因序列分析

【目的】确定采自元谋地区自然表现丛枝病的小驳骨(Gendarussa vulgaris Nees)植株是否感染植原体。【方法】通过利用植原体16S组和亚组通用或半通用特异性引物分别对植原体16S rRNA、rp和secY基因序列进行PCR扩增、克隆及测序分析;此外还对secY蛋白的蛋白特性及其结构进行了分析和预测。【结果】本研究获得了基因片段长度分别为1 248 bp的16S rRNA基因(nested PCR)、1 171 bp的rp基因和1 425 bp的secY基因。基于rp和secY基因核苷酸序列的同源性比对及构建的进化树推断的植原体遗传分化关系几乎与16S rRNA基因的推断相一致,均与植原体16S rⅡ-A亚组各株系的遗传进化关系最为接近,但rp和secY基因序列比16S rRNA基因序列能够呈现出更大的遗传变异程度;此外,对secY蛋白进行了生物信息学分析和初步探讨,发现它具有10个明显且分布相对均匀的跨膜螺旋区域,无信号肽。【结论】小驳骨丛枝病(Gendarussa vulgaris witches’-broom phytoplasma,GvWB-YNym)是由植原体侵染而发生,该植原体株系被划分到16S rⅡ-A亚组,相关的候选种为Candidatus Phytoplasma aurantifolia;secY蛋白生物信息参数的分析表明:secY蛋白在感病小驳骨植株中以疏水性稳定跨膜蛋白的形式存在,含10个明显的疏水跨膜区域,该蛋白不存在信号肽。     

柑橘木虱黄龙病菌携带量与其内生菌群相关性

【目的】分析柑橘木虱（Diaphorina citri）体内可能与黄龙病菌（Candidatus Liberibacter asiaticus）互作的内生细菌,为黄龙病菌的人工培养及其病害防控奠定基础。【方法】首先通过传统分离培养方法比较不同地理来源带黄龙病菌（带菌）和不带菌黄龙病菌（不带菌）的木虱中可培养内生细菌的差异。其次将带菌状况不同的木虱分别分为头、胸、腹3部分,经PCR扩增其16S rDNA的V6-V8区,用变性梯度凝胶电泳（PCR-DGGE）方法,比较带菌状况不同的木虱内生细菌的差异和木虱不同部位内生细菌的差异。选择3种差异的内生细菌：Bacillus sp.、Salmonella sp.、Enterobacter sp.,在8份带菌状况不同的木虱样品中通过q-PCR分别对其进行实时荧光定量分析,再以总细菌量为校正计算包括黄龙病菌在内的4种细菌的相对含量,数据经LSD检验,以各种细菌相对含量的-lg值作图,先比较同一样品中3种细菌分别与黄龙病菌的相对含量关系,再比较同种细菌在不同样品中的特性,分析3种内生细菌和黄龙病菌的互作关系。【结果】不带菌木虱中可培养内生菌菌落丰富度和菌落形成单位均大于带菌木虱中。在不带菌木虱中共获得14株形态不同的菌株,分属于芽孢杆菌属（Bacillus,3株）、欧文氏菌属（Erwinia,1株）、克雷伯氏杆菌属（Klebsiella,1株）、葡萄球菌属（Staphylococcus,2株）、节杆菌属（Arthrobacter,1株）、泛菌属（Pantoea,2株）、果胶杆菌属（Pectobacterium,1株）、沙门氏菌属等（Salmonella,1株）、链霉菌属（Streptomyces,1株）、Massilia brevitalea（1株）等10个细菌属。在带菌木虱中分得的4株细菌在不带菌木虱中均分离到,分属于克雷伯氏菌属、芽孢杆菌属、果胶杆菌属。其中Dc-11（嗜气芽孢杆菌属）在带菌木虱和不带菌木虱中分离频率均达到100%,表明其为木虱体内常驻细菌;对木虱不同部位（头、胸、腹）内生细菌16S rDNA的PCR-DGGE图谱显示,带菌与不带菌木虱中细菌种群差别明显,带菌状况相同的木虱不同部位之间差别不明显。其中优势条带10 （Wolbachia sp.）、12（Wolbachia pipientis）、13（Syncytium endosymbiont of Diaphorina citri）、14（Uncultured bacterium）、19（Serratia marcescens）、21和22（均为嗜麦芽寡养单胞菌Stenotrophomonas maltophilia）在木虱体内稳定存在,带菌木虱腹部特有优势内生细菌为Enterobacter sp.,木虱中同样也存在次级内生菌Wolbachia。q-PCR的结果验证了所选的3种细菌在前期传统分离培养和16S rDNA-PCR-DGGE中结果的可靠性,同时表明肠杆菌属在8份样品中与黄龙病菌呈正相关关系。【结论】黄龙病菌进入木虱体内会改变木虱内生细菌菌群种类和结构;嗜气芽孢杆菌（B. aerophilus）在柑橘木虱体内稳定存在,为木虱体内常驻菌群;Enterobacter sp.与黄龙病菌带菌量呈正相关,推测其可能与黄龙病菌互作。     

云南柑橘黄龙病病原检测及其 １６ＳｒＤＮＡ序列分析

利用柑橘黄龙病菌的特异引物,对采自云南红河州建水县和个旧市、玉溪市华宁县、大理州宾川县、昭通市盐津县、德宏州瑞丽市以及保山市隆阳区等地共 １５１个疑似柑橘黄龙病样品进行了黄龙病菌的检测,其中建水县有 ５个样品检测结果为阳性,检出率为 ３３３％;个旧市、华宁县和宾川县各有 １个样品为阳性,检出率分别为 ８.３％,５.５％,６.７％;而昭通、德宏和保山的样品均为阴性。表明黄龙病在云南的主要柑橘产区建水、个旧、华宁和宾川均有不同程度的发生,其中建水县发生率较高,生产上应尽快引起重视。对所获得的黄龙病菌 １６ＳｒＤＮＡ进行了克隆和序列测定,发现 ８个云南柑橘黄龙病菌 １６ＳｒＤＮＡ的序列一致性均为１００％,与柑橘黄龙病菌亚洲种 （ＣａｎｄｉｄａｔｕｓＬｉｂｅｒｉｂａｃｔｅｒａｓｉａｔｉｃｕｓ）相应序列的一致性为 ９８.７％ ～１００％,与柑橘黄龙病菌非洲种 （ＣａｎｄｉｄａｔｕｓＬｉｂｅｒｉｂａｃｔｅｒａｆｒｉｃａｎｕｓ）的一致性为 ９７.５％ ～９８.７％,而与柑橘黄龙病菌美洲种（ＣａｎｄｉｄａｔｕｓＬｉｂｅｒｉｂａｃｔｅｒａｍｅｒｉｃａｎｕｓ）的一致性均为 ９６.５％。表明云南主要柑橘产区发生的黄龙病菌均属于柑橘黄龙病菌亚洲种。     

柑橘黄龙病菌侵染对甜橙叶片糖代谢的影响

【目的】研究甜橙（Citrus sinensis）在柑橘黄龙病菌（Candidatus Liberibacter asiaticus）侵染下不同时期糖代谢的变化,以探讨其与柑橘叶片中淀粉积累间的关系,为进一步阐明柑橘黄龙病的发病机理提供理论依据。【方法】以甜橙为供试材料,采用腹接接种病原的方法,试验组植株用感染黄龙病菌的芽条进行嫁接,对照组植株用健康芽条进行接种,每个植株均嫁接3个芽条。在检测到感病的植株中选取生长状况良好且接近的3株作为后续试验材料,每月采集1次成熟叶片,至10月份结束。采集的叶片立即抽提DNA和RNA,并进行可溶性糖及淀粉含量的测定,其余叶片用液氮速冻后保存于-80℃用于测定糖代谢过程中关键酶活性的变化,同时利用实时荧光定量PCR技术比较二者关键酶基因表达量的差异。【结果】随着病原菌胁迫时间的延长,可溶性糖和淀粉含量总体呈升高趋势,均在6月达到峰值,分别为对照的1.59和3.73倍,在感病后期开始有所下降;通过对二者的比值分析发现,感病植株的比值随时间的延长不断下降。在黄龙病菌侵染的不同阶段,各种酶的作用程度有所不同。感病植株的蔗糖磷酸合成酶（SPS）活性在感病初期迅速上升至顶峰,高达58.44 μg·g^-1·min^-1,至后期已略微低于对照;酸性转化酶（AI）总体显示出较高活性,各个时期均有显著性差异（P＜0.05）,感病中期活性最高为对照的2.91倍;中性转化酶（NI）活性在感病和对照中均维持较低水平,且变化趋势基本一致;可溶性淀粉合成酶（SSs）与束缚性淀粉合成酶（GBSS）协调作用,共同参与淀粉合成的调控;淀粉酶活性在感病不同时期均有所下降,在感病中期低至0.38 U·g^-1。定量PCR分析表明,蔗糖磷酸合成酶基因SPS1表达量显著升高,与其酶活性具有显著相关性（P＜0.05）。蔗糖分解相关基因中,蔗糖合成酶基因SuSy在感病不同时期的表达差异不大,变化幅度小;细胞壁酸性转化酶基因CSCWI在不同时期均上调表达,最高上调约7.4倍,且表达量一直维持在较高水平;与CSCWI相比,液泡酸性转化酶基因CUAI1的表达水平较低。淀粉合成相关酶ADP-葡萄糖焦磷酸化酶基因最高上调3倍左右;淀粉分解相关基因BAM3、MEX1和DPE2在不同时期有所下调,达到显著性差异水平（P＜0.05）。【结论】柑橘黄龙病感染甜橙后,对植株叶片中光合产物的形成与运转产生影响,扰乱宿主糖代谢平衡,与宿主淀粉积累及后期症状的产生有密切关系。     

基于SSR标记的中国亚洲韧皮杆菌种群结构研究

【目的】亚洲韧皮部杆菌是柑橘黄龙病病原。通过筛选SSR（Simple sequence repeat）位点,分析中国境内亚洲韧皮部杆菌（‘Candidatus Liberibacter asiaticus’）的群体结构。【方法】根据已报道亚洲韧皮部杆菌基因组上的25个SSR位点,使用中国不同地理来源的样品,对报道的SSR位点进行筛选,找出其中适宜进行中国样品群体结构分析的位点。应用PCR的方法,对收集的中国境内的285个亚洲韧皮部杆菌相应SSR位点进行扩增,聚丙烯酰胺凝胶电泳。所得电泳图导入软件Quantity One 4.5.0读取产物的碱基数。通过PopGen version 1.31软件评估选出的位点和不同地理来源的样品的多态性,分别使用软件Powermarker 3.25和structure 2.3.4进行聚类分析。【结果】共选出5个SSR位点可用于中国种群结构研究,Nei's多样性指数0.1542-0.9556。其中LasA位点多态性最高,有效等位基因数NE=22.5,Nei's多样性指数H=0.9556。通过这5个位点分析中国境内8个不同地理来源的样品,发现云南省样品存在较高多态性,NE=5.7,H=0.6580。8个地理种群间的遗传距离0.0236-0.5786,遗传相似度0.5607-0.9767,广西和四川遗传距离最大,遗传相似度最小。Powermarker软件以UPGMA方法进行聚类分析的结果显示,所有样品分为两个组群,四川和云南为一个组群;福建、浙江、贵州、广东、广西和江西为一个组群。Structure软件分析也得出了相似的结果,云南和四川样品的种群构成较为单一,90%以上个体为同一组群,而其他6个地理来源不同程度的为两个组群的混合。【结论】基于5个SSR位点分析中国境内的Ca. L. asiaticus表明其可能存在两种不同的群体结构,为进一步研究中国柑橘黄龙病的发生和流行规律提供了有价值的线索。     

广东梅州柑橘黄龙病和病毒病的发生调查及其黄龙病菌原噬菌体多样性

【目的】调查柑橘黄龙病（Huanglongbing,HLB）和病毒病在广东省梅州市柑橘主产区的危害情况,分析该地区柑橘黄龙病菌（CLas）的原噬菌体多样性。【方法】以16S rDNA为模板设计引物,利用实时荧光定量PCR（qPCR)检测梅州市不同抽检地在2017—2019年3年间柑橘黄龙病的发病情况;同时分别采用已报道的柑橘衰退病毒（Citrus tristeza virus,CTV）、柑橘裂皮病毒（Citrus exocortis viroid,CEVd）、柑橘褪绿矮缩病毒（Citrus chlorotic dwarf-associated virus,CCDaV）、柑橘碎叶病毒（Citrus tatter leaf virus,CTLV）和柑橘黄脉病毒（Citrus yellow vein clearing virus,CYVCV）的特异性检测引物,提取样品的RNA,反转后以样品的cDNA为模板,通过普通PCR的方法分析梅州市抽检地区柑橘病毒病的发生情况。此外,以基于2种原噬菌体类型（SC1和SC2）对应的超变异基因区域设计的2对引物（Lap-TJ-F/Lap-TJ-R1和Lap-TJ-F/Lap-TJ-R2）,运用普通PCR方法分析该地区CLas菌株原噬菌体的遗传多样性。【结果】除2018年9月梅州大浦顺兴公司蜜柚基地的抽检样品外,梅州市其他被检地区均发现CLas。总体来说,梅州市的脐橙CLas检出率为55.3%,蜜柚为61.5%,沙田柚为61.7%。其中2017年采集自平原县大拓镇的蜜柚和沙田柚样品CLas检出率为100%,兴宁市白马镇的蜜柚为100%,沙田柚为80%;其他抽检地区的样品CLas检出率在16.7%—83.3%。虽然梅州市部分地区的检出率较高,但其病原菌的含量并不高,大部分处于柑橘黄龙病发病初、中期,属可防可控阶段;此外,梅州市柑橘病毒的总检出率不高,CTV、CTLV和CYVCV为梅州的主要病毒,CEVd和CCDaV没有检测到。CTV、CTLV和CYVCV在脐橙上的检出率依次为78.9%、7.9%和21.1%,蜜柚为15.4%、25.0%和9.6%,沙田柚为6.4%、2.1%和4.3%。基于Lap-TJ-F/Lap-TJ-R1和Lap-TJ-F/Lap-TJ-R2来研究CLas原噬菌体多样性的PCR扩增条带共有4种类型（SC1-1、SC1-2、SC2-1和SC2-2）,经过PCR电泳和测序得出,来自梅州市脐橙和沙田柚的CLas菌株以SC2-1型为主,蜜柚上以SC1-1型为主。【结论】梅州柑橘产区的柑橘黄龙病目前属于可防可控阶段,其病原菌菌株的原噬菌体在不同品种上具有其独特性;由于在抽检时发现有柑橘病毒病的存在,因此在种植过程中需加强种苗监管,同时应采取有效措施对柑橘黄龙病和柑橘木虱（Diaphorina citri）进行绿色防控。     

柑橘黄龙病病原DNA提取方法比较

【目的】筛选出一种快速高效获取柑橘黄龙病病原DNA的提取方法,为黄龙病亚洲种病原的检测奠定基础。【方法】选取5份疑似黄龙病症状柑橘叶片样品,分别采用4种试剂盒（快捷型基因组DNA提取系统、新型植物基因组DNA提取试剂盒、植物基因组DNA提取试剂盒、快速DNA提取扩增套装）及CTAB法提取柑橘叶脉基因组DNA,并用柑橘黄龙病亚洲种的16S rDNA特异引物fD1/fD2和OI1/OI2c进行PCR扩增,DNA提取产物及PCR扩增产物在1%琼脂糖凝胶电泳上检测。【结果】快捷型基因组DNA提取系统获得的DNA质量最好,植物基因组DNA提取试剂盒和CTAB法提取DNA方法提取得到的DNA质量较好,新型植物基因组DNA提取试剂盒所获得的DNA质量较差,快速DNA提取扩增套装所获得的DNA质量最差。除快速DNA提取扩增套装外,其余4种DNA提取方法均扩增出黄龙病亚洲种病原。【结论】快捷型植物基因组DNA提取系统试剂盒操作简单快捷,耗时短,提取的DNA效果较好,能够满足黄龙病病原PCR检测的要求。     

马蜂柑响应黄龙病菌不同侵染时期的生物学和转录组学分析

【目的】 柑橘黄龙病（Huanglongbing,HLB）是制约柑橘产业发展的重大病害,我国发生的黄龙病由韧皮部杆菌亚洲种（‘Candidatus Liberibacter asiaticus’,CLas）引起。本研究通过分析潜在耐黄龙病柑橘品种马蜂柑（Citrus hystrix）在感染黄龙病后不同时期的生物学症状、显微结构和转录组学差异,揭示马蜂柑不同时期对黄龙病菌具有耐性的分子机理,为进一步深入挖掘抗性基因及开展抗病育种打下基础。 【方法】 以嫁接在两年生卡里佐枳橙砧木上的马蜂柑作为供试材料,使用只感染CLas、其他常见柑橘病毒类病原均呈阴性的毒源为接毒材料对马蜂柑进行接种,并在接种毒源后每隔15 d进行定期的荧光定量PCR检测。将马蜂柑接种毒源4个月（最早检测到CLas阳性）作为感病前期处理,接种毒源14个月作为感病后期处理,以健康植株为对照,进行生物学症状和显微结构观察,分析其感病后不同时期的结构变化。结合比较转录组学分析与荧光定量PCR验证,解析其耐病相关机制。 【结果】 症状观察发现,马蜂柑在感病前期和感病后期,植株叶片几乎不显症;显微结构观察表明,马蜂柑在感病前期中脉组织结构清晰,细胞形态正常,无淀粉粒积累的现象,仅在后期出现韧皮部极少数的筛管被堵塞;对转录组测序结果进行筛选鉴定,马蜂柑感病前期共筛选鉴定到181个差异表达基因,感病后期共筛选鉴定到1 384个差异表达基因;比较转录组分析表明,马蜂柑感病前期和后期的差异表达基因主要涉及细胞壁代谢、防御反应、淀粉与蔗糖代谢、胼胝质合成以及信号转导等方面,其中在感病前期,淀粉与蔗糖代谢、细胞壁代谢相关的调控基因下调表达,在感病后期,水杨酸代谢及其信号转导途径、病程相关蛋白和谷胱甘肽转移酶相关的调控基因上调表达。 【结论】 马蜂柑响应CLas早期侵染主要表现为物理结构稳定、淀粉合成和光合作用等途径不受干扰;而水杨酸介导的抗性信号转导、效应蛋白触发免疫反应（effector-triggered immunity,ETI）激活的病程相关蛋白和谷胱甘肽转移酶参与的解毒作用是感病后期的主要耐病机制。