辣椒细胞质雄性不育系和保持系线粒体DNA差异的SRAP分析

以辣椒细胞质雄性不育系21A及其保持系21B的线粒体DNA为材料进行SRAP分析,结果表明,从128对引物扩增获得了1 440条100～1 000 bp的条带,多态性位点仅有9个,占0.63%,其中7条多态性条带位于21A中;对多态性条带回收、克隆和测序分析后发现,9个克隆在GenBank中找到了相似的功能,绝大部分与能量代谢有关;利用21A中的多态性序列特点设计SCAR引物,对21A和21B的基因组DNA进行扩增验证,3对引物在21A中扩增出目的条带,表明已成功地将SRAP标记转化为SCAR标记,是新发现的与辣椒细胞质雄性不育基因相关的片段。     

青花菜胞质不育相关基因的SRAP标记筛选

以青花菜Ogura胞质不育系XY及其保持系XYF基因组DNA为材料进行SRAP分析,共筛选了146对SRAP引物,其中8对引物在两系之间表现差异,经单株验证只有引物对Me6＋Em7没有交换单株,找到不育系与保持系间的特异扩增片段M6E7-700,该片段仅在不育系中稳定扩增。测序结果表明该片段全长为689bp,经Blast分析比对,该片段与已报道的所有育性相关基因序列均不同源,而其部分序列与大白菜BAC克隆KBrB042N05和KBrB041L12的部分序列高度同源,表明该片段是一段新发现的与胞质不育育性相关片段,且该片段可能来自核DNA。根据测序结果设计了1对特异引物,将M6E7-700标记转化为更稳定的SCAR标记。本研究首次发现芸薹属作物Ogura-CMS不育系和保持系的核DNA也存在差异,该结果为从质核互作角度解释细胞质雄性不育的分子机制提供了新线索。     

菜薹雄性不育相关基因的ISSR分子标记筛选

菜薹(Brassica campestris L.ssp.Chinensis var.utilis Tsenet Lee)属于十字花科芸薹属,原产中国,是华南地区重要的特产蔬菜之一.利用分子标记技术进行菜薹雄性不育相关基因的定位对菜蕞品质创新和选育新品种具有重要意义.目前尚未见有利用ISSR分子标记技术进行菜薹雄性不育分析的研究报道.利用ISSR技术对菜薹雄性不育系及其保持系的基因组DNA进行比较分析:结果显示100个ISSR引物中,只有引物UBC843的扩增结果在两系之间表现出了差异性,找到了不育系和保持系间的特异扩增片段.回收该特异扩增片段并进行克隆测序,测序结果表明该片段全长为462 bp.与白菜其它育性相关序列比较,同源性均低于50%.根据测序结果设计了一对特异引物,将其转化为更稳定的SCAR标记.经F2群体验证,ISSR引物扩增得到的特异片段很有可能来自核DNA.     

利用分子标记鉴定白菜细胞质雄性不育类型的研究

通过对9份白菜细胞质雄性不育材料的不育胞质类型进行分子标记鉴定,以期为今后更好的利用分子标记来进行辅助育种奠定基础。通过CTAB法提取白菜的基因组DNA,根据GenBank中orf138基因保守序列设计2对特异引物,对9份白菜基因组DNA进行PCR扩增,将扩增出条带的PCR产物进行测序,在NCBI中进行同源性比对,最终确定其不育胞质类型。结果表明：2对特异引物PI/PII和PIII/PIV只在4份白菜雄性不育基因中均扩增出条带,在另外5份材料中未扩增出条带,与田间育性鉴定相符,获得4份白菜Ogura胞质雄性不育的分子标记;在GenBank中用BLAST进行同源性比对分析,发现L1-CI、L3-CI、L3-F1 3个不育材料的特异片段与已报道的青花菜Ogu CMS所具有的Ogu orf138基因（Genbank登录号：HQ149728）同源度高达100%,L1-F1的同源度达99%,出现了一个变异位点,另外5份材料的胞质不育类型有待进一步研究。通过该方法鉴定出9份材料中有4份材料是萝卜胞质雄性不育的材料,得到了4条分子标记,该结果可为白菜细胞质雄性不育的分子鉴定提供了新的标记,也为今后利用分子标记辅助育种奠定了基础。     

大葱雄性不育分子标记辅助选择的研究

大葱雄性不育在杂种优势利用中具有重要价值,传统方法选育不育系效率低,分子标记辅助育种可提高育种效率。本研究试图建立大葱雄性不育辅助育种的技术体系,加快大葱不育系、保持系的育种进程。利用RAPD技术分析了多态性片段S132800、S38960、S72300、S731100、S2002400与大葱育性的连锁关系,重组率分别为0、7．5％、0、4．2％、0。其中S132800、S2002400能在多数品种中区分N、S胞质,且重组率接近0,用于胞质鉴定具有很高的准确率,因而具有较高的利用价值。以S132800、S2002400为探针对不育系和保持系mtDNA的酶切片段进行了Southern杂交分析,结果表明它们在N、S胞质中存在多态性。预示着它们可能是与大葱CMS相关的片段。鉴于RAPD标记的应用有一定局限性,进一步对特异片段S132800、S2002400进行了克隆、测序和SCAR标记转化,其中S132800成功转化为SCAR标记,而S2002400转化后多态性消失。为进一步降低成本,简化了SCAR扩增产物的检测技术,初步建立了大葱不育系、保持系分子标记辅助选择的技术体系。研究表明,SCAR产物加入EB直接检测存在一定误差,而通过快速电泳可以快速、准确地鉴定单株的胞质类型。RAPD标记和SCAR标记在育种中应用有望提高大葱不育系、保持系的育种效率。     

一个与亚洲百合无花粉性状紧密连锁的SRAP标记

为了探讨亚洲百合无花粉性状的分子遗传机制,筛选与该性状紧密连锁的分子标记,实现分子辅助选择。本研究以无花粉与有花粉亚洲百合杂交创制的F1单株为试验材料,采用BSA法,对亚洲百合无花粉性状进行SRAP标记分析。在无花粉基因池和有花粉基因池之间共筛选了108对SRAP引物组合,获得了1对在两基因池间扩增存在显著差异的引物组合EM2/ME3,并成功对两基因池间扩增出的差异片段进行回收、克隆和测序,得到了该片段375 bp的碱基序列,并将该特异标记命名为E2M3-375。     

大白菜细胞质雄性不育特异RAPD标记的筛选

根据近等基因系分析原理,以大白菜细胞质雄性不育系CMS-2及其保持系B-2为材料.对大白菜细胞质雄性不育基因及其保持基因进行RAPD标记研究。引物S391在不育系中有特异性扩增,得到一条约700bp的特异片断;引物S425在保持系中有特异性扩增,得到一条约600bp的特异片,分别命名为S391-700bp、S425-600bp。采用Blastn进行核苷酸同源序列比较,结果发现S391-700bp存在一个开放阅读框架,这一开放阅读框架与植物叶绿体丝氨酸乙酰基转移酶DNA部分片段有很高的同源性;S425-600bp是新发现的一段DNA序列。根据测序结果设计特异引物,结果表明本研究所获得的两个标记片断都能确定其特异性。     

瓣化型胡萝卜雄性不育基因atp6的CAPS标记建立

根据atp6的基因序列设计特异扩增引物，以瓣化型胡萝卜核质互作雄性不育系H05A及其保持系H05B为试材，扩增获得了1条约500bp的特异扩增片段。用限制性内切酶BglII对该片段进行酶切，不育系产生1条保持系中没有的特异片段，其分子量约为60bp。建立了atp6基因的CAPS标记，该分子标记可用于胡萝卜雄性不育分子标记辅助育种。     

对除草剂敏感致死水稻bel基因的RAPD和SCAR分子标记

以8077s与抗感的籼稻品种丰35亲本及杂交后自交所得的F2群体为材料，采用群分法（Bulked Segregant Analysis, BSA），从210个10mer随机引物，找到两个水稻苯达松敏感池和抗感池之间表现多态性的特异引物——S20和S316，分别产生的标记片段为S20-440和S316-590。它们与bel基因的连锁距离分别为12.132 cM和7.97 cM。对RAPD扩增标记的片段进行克隆、测序，根据测序结果合成两对特异性的SCAR引物，包含原有的RAPD序列。SC01引物在敏感单株中扩增出一条423 bp带；SC02引物在敏感单株中扩增出一条606 bp带，它们的SCAR标记与bel基因的连锁距离为10.66 cM和7.04 cM。应用SCAR标记对水稻恢复系进行了辅助选育。     

大白菜胞质雄性不育线粒体基因特异分子RAPD标记及克隆

用随机引物对大白菜细胞质雄性不育系及其保持系线粒体DNA的RAPD分析,在不育系与保持系的线粒体基因组间存在明显的差异,用引物S259在不育系中扩增并克隆得到特异片断(mt)S259~600bp,序列分析表明该片断与油菜线粒体基因NADH脱氢酶第四亚基序列有部分相似性,片段与雄性不育的关系还需进一步研究。     

陆两优996种子纯度的SRAP指纹图谱鉴定

利用270对SRAP引物对陆两优996和2个亲本的DNA指纹图谱，获得能在父、母本间表现出多态性的特异SRAP标记引物有54对，其中差异性条带136个。利用Me3Em8引物，条带在杂交种完全互补，对200株样本进行了纯度鉴定，结果鉴定纯度为97.50%，与田间种植鉴结果97.50%(海南鉴定)一致，表明SRAP标记技术适用于种子纯度鉴定。     

Development of a DNA marker for distinguishing CMS lines from fertile lines in rice (Oryza sativa L.)

The main objective of the present study was to identify mitochondrial DNA based marker, which can distinguish male sterile and fertile counterparts of the cytoplasmic male sterile (CMS) lines used in production of rice hybrids. Amplified fragment length polymorphism (AFLP) analysis in CMS lines: IR58025A & IR62829A and their respective maintainers: IR58025B & IR62829B identified a polymorphic DNA fragment of about 510 bp size that was present in both CMS (A) and absent in their maintainer (B) lines. Sequencing followed by database analysis of the polymorphic fragment indicated about 97% similarity with mitochondrial NADH gene subunits of rice, maize and wheat. Based on the variable sequence regions, a site specific primer pair (BF-STS-401) was designed. PCR analysis showed that BF-STS-401 could amplify a strong band of 464 bp size in CMS and a faint band of the same size in maintainer line. To act as a positive control and avoid possible errors in PCR, BF-STS-401 was multiplexed with a new primer pair (BF-STS-402), derived from mitochondrial atp9 subunit of rice, producing monomorphic amplification indiscriminately in both CMS and maintainer lines. Both the primer pairs in combination clearly differentiated CMS lines from their corresponding maintainer lines. This primer combination was validated in a set of diverse genotypes consisting of different sources of CMS lines, restorer lines, hybrids, varieties and mixed samples from private seed companies. Our results suggested that the multiplex primer pairs developed in this study can be effectively utilized to assess the genetic purity in commercial seed lots of CMS lines and hybrids of rice.     

Conversion of the RAPD OPC021150 marker of the Rfo restorer gene into a SCAR marker for rapid selection of oilseed rape

The Rfo fertility restorer gene for the Ogura cytoplasmic male sterility (CMS) applied for oilseed rape hybrid seed production can be monitored with the use of the RAPD OPC02₁₁₅₀ marker while molecular breeding. The aim of this work was to convert the RAPD marker into a more suitable SCAR marker. Total DNA was isolated from a doubled haploid line derived from the line BO20 (INRA, France). A fragment of 1150‐bp linked to the Rfo gene was PCR amplified with the use of the RAPD OPC02 primer, cloned and sequenced. A pair of primers was designed and PCR amplification was performed to develop a SCAR marker for the Rfo gene. The new marker was applied for analysis of 220 oilseed rape lines comprising doubled haploid and inbred restorer lines, restored hybrids as well as F₁ and F₂ recombinant generations involving restorer lines. Simultaneously, the RAPD OPC02 marker was used and it revealed that the markers are equivalent to each other. However, the developed new SCAR marker has made the analysis more practical, rapid and efficient.     

甘蓝细胞质雄性不育相关基因orf138的分子特性分析

为了研究甘蓝雄性不育机制,根据萝卜CMS相关基因orf138的序列信息,设计特异引物,并在甘蓝不同类型不育系和保持系中鉴定PCR产物的稳定性。随后利用Tail-PCR技术,扩增获得此基因的侧翼序列并进行了生物信息学分析。结果表明在甘蓝不育型材料中,能够稳定扩增出300 bp左右的单一条带,而在其他细胞质不育类型和可育材料中均未扩出条带,经多次验证结果稳定可靠。甘蓝中orf138的上下游侧翼序列有效碱基1789 bp,通过生物信息学分析,获得包括起始密码和终止密码的orf138的完整序列共417 bp。同源性比对结果显示：与甘蓝型油菜﹑白菜和萝卜的orf138片段具有高度保守性。分析侧翼序列表明甘蓝orf138的3’端是由ORF83、trnfM、ORF125等基因片段构成的一个复杂序列。获得了甘蓝OguCMS特异的分子鉴定标记,明确了orf138在甘蓝线粒体中的位置,以上结果为甘蓝雄性不育的进一步研究奠定良好的基础。     

Development of PCR-based markers linked to a restorer gene for cytoplasmic male sterility in radish (Raphanus sativus L.)

A random amplified polymorphic DNA (RAPD) marker named OPC06-1900 was previously found linked to a fertility restorer gene (Rfw) for cytoplasmic male sterility (CMS) in radish (Raphanus sativus L.). The RAPD marker was converted to a dominant sequence characterized amplified region (SCAR) marker SCC06-1894 by molecular cloning and nucleotide sequencing. A BLAST search revealed that the SCAR marker SCC06-1894 showed significant homology to the corresponding regions of Arabidopsis and Brassica sulfate transporter genes. The presence of the intron and exon of the DNA fragment SCC06-1894 was demonstrated by comparing RT-PCR and PCR products. Thus, allele-specific oligonucleotide primers were designed to amplify the SCAR marker SCC06-415. PCR test with F₂ plants and sequence analysis showed that SCC06-1894 and SCC06-415 were allelic, linked to Rfw/rfw gene at 8.0 cM. Nine oligonucleotide primers were designed based on a single radish nuclear restorer gene mRNA. A survey of these primer combinations by bulked segregant analysis (BSA) identified three polymorphisms. The three PCR-based markers were co-segregant in the coupling phase and distant from the Rfw gene by 1.4 cM. These specific markers distributed on both sides of the Rfw gene and will be helpful for breeding new rapseed (Brassica napus L.) restorer lines.     

小麦K-CMS保持系的SRAP鉴定及遗传多样性分析

为更好地对小麦K-CMS保持系的遗传背景进行分析,筛选优良亲本,以进一步提高小麦杂交育种的效率。利用SRAP技术,对30份小麦K-CMS保持系的遗传背景进行研究,以SRAP标记在30个品种之间扩增的多态性位点数据,采用Nei和Li的方法,计算品种间的遗传距离;以2年田间试验得到的品种株高、穗长、小穗数、穗下节长、穗粒草重、穗粒数、穗粒重、旗叶长等表现型性状平均数经正态标准化后,采用欧氏距离计算品种间遗传距离,再比较分析。分析表明,82对SRAP引物揭示出多态性,多态率68.3%,获得208条多态性谱带,平均每对引物产生3.68条多态性谱带,表现出较高的多态性。基于分子标记的聚类分析结果与系谱分析结果基本一致。若以整个遗传距离的总平均数作尺度对聚类图的结果进行分类,大致可分为6类。Mantel检测表明,SRAP标记数据计算的遗传距离矩阵和表现型计算的遗传距离矩阵存在极显著的相关性0.8123(t=11.325t0.01)。SRAP标记是检测品种间遗传差异的有效方法,可为小麦K-CMS保持系种质资源遗传差异的研究提供理论依据。研究还证实,一个骨干亲本与由其衍生出来的品种(系)之间的遗传差异一般较小。     

线粒体DNA由来的RAPD标记能鉴别水稻雄性不育和可育细胞质

以野败型细胞质的水稻雄性不育系珍汕97A及其保持系珍汕97B的总DNA为模板,从100个引物中筛选到OPA12对珍汕97A能扩增出一条1600 bp的特异带.用OPA12扩增野败型细胞质的龙特浦A及其保持系龙特浦B、矮败型细胞质的协青早A及其保持系协青早B、恢复系明恢63、珍汕97A/明恢63的F1和F2个体的总DNA,不育系、F1和F2所有调查个体都有16