牛源性成分LAMP检测方法的建立

根据牛cytB基因设计3对特异性引物,运用GenieⅡ等温扩增荧光检测系统,以环介导等温扩增(LAMP)荧光检测方法为基础,建立了牛源性成分LAMP检测方法,并对该方法进行了反应体系和条件的优化。试验结果表明:该方法操作简单、特异性好;灵敏度比普通PCR方法高100倍,达到5.408×10~(-2)μg/μL;反应时间短,最快的10分钟内即可完成反应。     

山羊痘病毒LAMP检测方法的建立

为了建立适用于基层养殖场快速、可视化的山羊痘病毒(GTPV)环介导等温扩增技术(LAMP)检测方法,根据GenBank公布的GTPV ORF103保守区核苷酸序列为靶序列,设计并合成一组特异性LAMP引物,优化反应条件(时间、温度)和反应体系(dNTP、内外引物浓度比),并进行特异性和灵敏度试验。结果表明,所建立的LAMP方法在65℃时反应50 min即可获得清晰的梯状条带;扩增物经10×SYBR GreenⅠ荧光染料染色,紫外线照射或日光下即可直接判定结果;灵敏度试验结果表明,该方法能够检出的GTPV核酸最低浓度为1.287 ng/mL,与常规PCR方法相比,灵敏度增高100倍;该方法特异性良好,与小反刍兽疫病毒(PPRV)、羊支原体(Mccp)、羊口疮病毒(ORFV)均无交叉反应;对10份临床样品检测结果显示,该方法与传统PCR检测结果一致。建立的LAMP检测方法可用于临床山羊痘病毒的检测。     

猴痘病毒实时荧光LAMP检测方法的建立

为建立一种特异性强、灵敏度高、操作简单的猴痘病毒(Monkeypox virus, MPXV)检测方法,试验针对MPXV保守区OPG002基因片段设计特异性引物,通过优化环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)反应体系中内引物、环引物体积及反应温度建立了一种MPXV实时荧光LAMP检测方法,对该方法的特异性和灵敏度进行了分析,并应用该方法检测了临床样品和模拟样品。结果表明：建立的MPXV实时荧光LAMP检测方法于64℃恒温反应60 min即可完成DNA检测;该方法能特异性地检出MPXV,最低检出限为25 copies/μL,灵敏度是普通PCR方法的20倍;该方法对12份临床样品的检测结果均为阴性,可检测出质粒浓度为0.5×10²～0.5×10⁶ copies/μL的模拟阳性样品。说明建立的MPXV荧光LAMP检测方法具有特异性强、灵敏度高、操作简单的优点,可用于MPXV的快速鉴别诊断。     

羊泰勒虫可视化LAMP检测方法的建立

为了建立1种快速简便的羊泰勒虫检测方法，试验根据羊泰勒虫MPSP基因设计2组引物，建立羊泰勒虫环介导等温扩增(LAMP)检测方法，利用该方法分别检测羊泰勒虫、瑟氏泰勒虫、卵形巴贝斯虫、附红细胞体的DNA。结果：LAMP方法检测羊泰勒虫的结果为阳性，其他虫体均为阴性，具有较好的特异性；对羊泰勒虫DNA最低检测量为1.9×10^-9 ng/μL,是PCR方法的100倍。分别利用LAMP、PCR检测30份疑似羊泰勒虫感染病例，LAMP方法阳性检出率为20%(6/30),PCR方法阳性检出率为16.67%(5/30),LAMP方法准确率高于PCR方法。结论：建立的羊泰勒虫可视化LAMP检测方法特异性好、准确率高，可作为羊泰勒虫病诊断的检测方法。     

3种新城疫病毒核酸扩增检测方法的比较研究

本研究利用3种方法对新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)进行检测,并对这3种检测方法的灵敏度和特异性作出比较。根据新城疫病毒的融合蛋白基因(F基因)设计合成6条特异性引物,利用水浴LAMP法、PCR及LAMP实时浊度仪进行检测。通过对恒温水浴中的反应温度、反应时间及反应液中Mg^2＋浓度进行优化获得最佳反应条件,结果用凝胶电泳分析;用优化的温度进行LAMP实时浊度仪检测,同时都与PCR方法进行比较。结果显示,获得了最佳反应条件,水浴LAMP方法最低检测限是1.58 pg,比PCR高100倍,而LAMP实时浊度仪检测灵敏度比水浴LAMP方法高10倍,最低检测限是0.158 pg。3种方法对其他非新城疫病毒均无检出。结果表明,新城疫病毒水浴LAMP检测方法速度快、不需要高精密的仪器,而且具有灵敏度高、特异性强、操作简单等特点,有望在核酸扩增领域取代PCR技术,LAMP浊度仪法检测灵敏度更高,但是所需仪器和试剂比较昂贵。     

羊梅迪-维斯那病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

为了建立一种能快速检羊梅迪-维斯那病毒(MVV)的实时荧光定量PCR,根据GenBank中MVV gag基因的序列,设计了1对特异性引物及TaqMan探针,经过反应体系及条件优化,以定量的10倍系列稀释的阳性质粒为标准品进行实时荧光定量PCR扩增,建立了MVV实时荧光定量PCR。结果显示,该方法对MVV DNA最小检出量为10copies/μL,比普通PCR具有较高的检出率;组内及组间变异系数均低于2%,具有较好的重复性;该方法可以特异地检测到MVV,与其他病毒性样品无交叉反应。被检的92份临床样品中,实时荧光定量PCR和常规PCR的阳性检出率分别为4.3%和3.3%。为羊MVV快速检测和分子流行病学调查提供了一种有效的方法。     

改良的环介导等温扩增技术在羊布鲁菌病快速诊断中的应用

布鲁菌病严重威胁人类健康和畜牧业生产的常见人畜共患病。建立改良的LAMP,对防控布鲁菌病的传播具有重要意义。选择羊布鲁菌标准菌株DNA保守序列,设计LAMP引物;建立并优化LAMP快速检测体系;通过倍比稀释法等完成灵敏度和特异性实验;选择可疑布鲁菌感染羊血液样本200例,分别进行LAMP、PCR和RBPT检测,完成一致性检验。LAMP反应体系中MgSO₄为8 mmol/L,甜菜碱为0.8 mmol/L,钙黄绿素为5 mmol/L,MnCl₂为10 mmol/L;布鲁菌均呈现绿色,5种阴性菌株均为橙色;随着模板稀释度的逐渐增大,扩增开始时间逐渐延长,检测极限为10 copies/μL,与凝胶电泳、PCR结果一致;与PCR比较,羊血液标本LAMP阳性率基本一致,无统计学意义(P>0.05);与RBPT比较,LAMP阳性率显著升高,有统计学意义(P<0.05);PCR和LAMP检测一致性较好(Kappa=0.987,P>0.7)。因此,本研究为布鲁菌病提供了特异性好,灵敏度高检测试剂盒。     

2种鸡免疫抑制性疾病LAMP检测方法的建立

本文借助环介导等温扩增技术(LAMP),建立了两种常见鸡免疫抑制病的(鸡传染性贫血病、J亚群白血病)的快速检测方法。采用简易法提取DNA模板,设计特异性LAMP引物,成功扩增出梯形条带,并且对反应体系进行优化,以及特异性试验和灵敏度试验。结果表明LAMP的灵敏度可达10个拷贝,比PCR灵敏度高10倍;且具有特异性,对其他相关鸡病病原检测结果均为阴性。用建立的LAMP方法对临床样品进行检测,同时与PCR方法比较,结果表明LAMP结果基本与PCR相符,但检测的阳性率要比PCR高。操作简便,无需昂贵设备,适用于临床快速诊断。     

鸡鸭源性成分荧光LAMP检测方法的建立及应用

为快速鉴别牛羊肉中是否掺杂了鸡肉、鸭肉等其他肉类,基于Genie II等温扩增荧光检测系统,建立了检测鸡鸭源性成分的荧光LAMP检测方法。同时,优化了反应体系和条件,进行了特异性和灵敏度试验,以及市场检测应用。结果显示:鸡鸭源性成分荧光LAMP检测方法具有很强的特异性,除了相对应的动物源性成分外,其他13种动物源性成分均呈阴性;该方法检测鸡、鸭源性成分的灵敏度分别为0.88、3.32 pg/μL,均高于普通PCR 10倍;加入双加速引物,该方法的反应时间仅为15~20 min,10 min左右时就可进行实时初判;市场应用检测结果与普通PCR的符合率为100%。结果表明,本方法特异、灵敏,所需时间短,可用于鸡鸭源性成分的市场快速检测。     

猪圆环病毒3型TaqMan-MGB荧光定量PCR方法的建立及应用

为建立猪圆环病毒3型(PCV3)荧光定量PCR检测方法,本研究根据GenBank中PCV3基因序列设计特异性引物和探针,经过反应体系和条件优化,建立了特异性检测PCV3的TaqMan-MGB荧光定量PCR方法。该检测方法在4.78×10~1拷贝/μL～4.78×10~9拷贝/μL质粒标准品范围内均有良好的线性关系;该方法特异性试验结果显示,其与多种常见猪病病毒均无交叉反应,特异性良好;本研究建立的方法敏感性是常规PCR方法的100倍,敏感性较高;批内批间重复性试验变异系数均小于2.3%,重复性良好。对临床样品的检测结果显示,该方法对PCV3的检出率高于常规PCR方法,并且PCV3阳性样品多存在混合感染情况。该方法的建立为PCV3的实验室诊断及流行病学调查提供了快速、准确的检测手段。     

可视化环介导等温扩增技术研究进展

环介导恒温扩增技术(LAMP)因扩增效率高设备简单极具应用价值,但其产物易污染环境致假阳性限制了其推广应用。LAMP产物分析技术经历了开放式凝胶电泳,封闭式显色,到免疫薄膜层析显色发展历程,污染问题逐步得到解决。     

环介导等温扩增技术及其应用

环介导等温扩增(LAMP)技术于2000年由日本学者提出,其反应原理是由两对特异性引物,针对靶基因的6个不同区域进行特异性识别,在DNA聚合酶作用下,恒温条件进行链置换扩增。由于LAMP技术具有高灵敏度、强特异性、快速简便、成本低廉等特点,使得其广泛应用于病原菌的检测、胚胎性别鉴定、食品卫生检验等方面。论文针对LAMP技术的研究背景、反应原理、应用等方面进行了综述,总结出不同因素对LAMP反应的影响,对其优势和局限性进行了讨论,并对LAMP的发展前景进行了展望。     

等温扩增技术的原理及其在病原检测中的应用

等温扩增技术(IAT)作为一种新型的体外核酸扩增技术,与PCR相比,该技术具有特异性强、敏感性高、简单便捷和成本低等优点。目前,等温扩增技术在病原检测方面得以应用,论文对环介导等温扩增(LAMP)、依赖解旋酶的等温扩增(HDA)、依赖核酸序列的等温扩增(NASBA)、链置换等温扩增(SDA)、交叉引物扩增(CPA)5种扩增技术的原理、特点及应用分别予以介绍,为该技术在病原检测的实际应用提供参考。     

环介导等温扩增技术研究进展

环介导等温扩增技术(LAMP)是由Notomi等建立的一种核酸扩增技术。该方法最大的优点是能够在63~65℃的等温条件下扩增特定DNA序列,并在30~60 min内观察到结果。LAMP已经成功用于许多病毒的检测,本文主要概述了LAMP技术原理及发展现状。     

环介导恒温扩增技术在动物病原检测中的应用

环介导恒温扩增技术(LAMP)是一种新型核酸扩增技术,是依赖于靶目标上6个区域的4条引物和一种具有链置换活性的DNA聚合酶Bst的作用,在60 ℃～65 ℃恒温条件下1 h之内即可完成的基因扩增技术.该技术虽然起步较晚,但发展迅速,目前在很多领域的研究和应用已经取得很大进展.论文从技术原理、引物设计、反应机制和特点等方面了介绍了环介导恒温扩增技术,并就该技术在动物细菌性病原微生物、病毒和寄生虫检测中的应用做了介绍.     

环介导等温扩增技术在病原检测中的应用

文章介绍了环介导等温扩增技术的的基本原理、特点及其在传染性疾病中检测和诊断的应用。环介导等温扩增技术具有特异性强、等温灵敏、操作简单、产物易检测等优点。环介导等温扩增技术已经被用来快速诊断动物的传染病。目前可检测圆环病毒2型、鹅细小病毒、伪狂犬病病毒、高致病性禽流感病毒、新城疫病毒、副猪嗜血杆菌、单核细胞增生性李斯特氏菌、猪肺炎支原体及弓形虫基因等。     

LAMP技术在家禽病毒检测中的应用

环介导等温扩增技术(LAMP)是一种简便快速的DNA扩增技术,具有特异性强、敏感性高、反应迅速、设备简单、判定简易等特点,非常适合在基层和临床上应用。自LAMP出现后,在多个领域得到了大量的研究和应用,尤其在家禽病毒的检测方面发展迅速,检测动物包括鸡、鸭、鹅、鸽等多种家禽,检测对象包含引起呼吸道感染、肿瘤、免疫抑制等方面的多种病毒,检测的敏感性和特异性比PCR还要高,在家禽病毒性感染的诊断和防控中发挥了重要的作用。当前影响其广泛应用的主要问题是扩增模板,如果能解决病原核酸在生产现场的简便提取,定能在将来得到更广泛的普及应用。     

羊丝状支原体簇环介导等温扩增检测方法的建立

本试验利用环介导等温扩增技术(LAMP)建立了羊丝状支原体簇的快速检测方法,该方法以羊丝状支原体簇成员的保守性基因16S rRNA为靶序列,设计了4条特异性引物,在65 ℃等温条件下,60 min一步完成反应。在反应管中预先添加羟基萘酚蓝(HNB),阳性呈蓝色,阴性呈紫色。丝状支原体簇成员——丝状支原体山羊亚种(Mmc)、丝状支原体丝状亚种LC型(Mmm LC)、山羊支原体山羊肺炎亚种(Mccp)的LAMP检测为阳性;对其他病原菌没有交叉反应。以Mmc的核酸为模板进行灵敏度检测,LAMP的最低检出限为10 pg/μL。结果表明,本试验建立了一种特异、敏感、快速、简便的羊丝状支原体簇的LAMP方法。     

恒温扩增技术在动物疫病检测中的应用

恒温扩增技术是继PCR技术后发展起来的一门新型的体外核酸扩增技术。目前主要的恒温扩增技术有:滚环核酸扩增、环介导等温扩增、链替代扩增、依赖核酸序列扩增和解链酶扩增。它们都具有共同的特点:恒温、高效、特异、不需要特殊的仪器设备。本文就现阶段恒温扩增技术的特点及其在动物疫病检测中的应用情况和前景做一综述。     

快速检测双芽巴贝斯虫LAMP方法的建立

为提高双芽巴贝斯虫(Babesia bigemina)检出率,本研究采用环介导等温扩增技术(LAMP)建立一种快速、灵敏、特异的B.bigemina检测方法。根据GenBank上公布的Babesia bigemina细胞色素b(Cytochrome b,cyt b)基因序列,设计4条特异地识别B.bigemina的cyt b基因6个特殊区域的LAMP引物,优化反应体系和条件,在Bst DNA聚合酶的作用下,65 ℃反应60 min,加入SYBR Green Ⅰ后观察。结果表明,该LAMP检测方法特异性强,与牛巴贝斯虫(Babesia bovis)等DNA不发生交叉反应;敏感性高,对B.bigemina的cyt b基因最小检测值为0.085 fg/μL,是一般PCR方法的1000倍。该方法具有简单、快速、低成本的特点,可用于B.bigemina的基层现场快速检测。