荷斯坦母牛AHCY基因PCR-SSCP分析

根据已发表的牛AHCY基因序列设计13对引物,采用PCR-SSCP方法在210头荷斯坦母牛中检测S-腺苷高半胱氨酸水解酶（S-adenosylhomocysteine hydrolase,AHCY）基因全部10个外显子的单核苷酸多态性,同时分析该基因对荷斯坦母牛乳房炎抗性的影响。结果表明,AHCY基因的10个外显子在检测的荷斯坦母牛中都不存在多态性,AHCY基因外显子区域可能不存在影响乳房炎抗性的遗传标记。     

荷斯坦母牛TLR10基因PCR-SSCP分析

设计15对引物,采用PCR-SSCP技术检测Toll样受体10（Toll-like receptor 10,TLR10）基因在210头荷斯坦母牛中的多态性,分析该基因对荷斯坦母牛乳房炎抗性的影响。结果显示,TLR10基因在检测的荷斯坦母牛中都不存在多态性,该基因区域可能不存在影响乳房炎抗性的遗传标记。     

荷斯坦母牛TLR6基因多态性及其与体细胞评分关系的研究

本研究旨在阐明Toll样受体6(TLR6)基因的多态性与荷斯坦母牛乳房炎抗性之间的关系.采用PCR-SSCP和PCR-RFLP技术检测208头荷斯坦母牛TLR6基因多态性,用最小二乘法分析该基因多态性与荷斯坦母牛钵细胞评分(somatic cell score,SCS)的关系.结果发现,TLR6基因mRNA序列中存在T853A、G855A、G1793A、C1859A、G1934A和A1980G 6个多态位点,其中T853A突变使编码氨基酸由缬氨酸变为谷氨酸,G855A突变使天冬氨酸变为天冬酰胺,A1980G突变使异亮氨酸变为缬氨酸.T853A和G855A突变位点经SSCP检测发现3种基因型AA、AB和BB,其频率分别为0.308、0.490和0.202;X~2检验表明荷斯坦母牛在该位点处于Hardy-Weinberg平衡;BB基因型SCS最小二乘均值极显著低于AB和AA基因型所对应的值(P<0.01);AB基因型SCS最小二乘均值极显著低于AA基因型所对应的值(P<0.01).G1793A突变位点经BsiY Ⅰ酶切产生2种基因型CC和CD,其频率分别为0.332和0.668;荷斯坦母牛在该位点偏离了Hardy-Weinberg平衡,CC和CD基因型SCS最小二乘均值差异不显著(P>0.05).C1859A突变位点经BstX Ⅰ酶切产生2种基因型EE和EF,其频率分别为0.178和0.822;荷斯坦母牛在该位点偏离了Hardy-Weinberg平衡;EE和EF基因型SCS最小二乘均值差异不显著(P>0.05).G1934A突变位点经BsiY Ⅰ酶切产生2种基因型GG和GH,其频率分别为0.356和0.644;荷斯坦母牛在该位点偏离了Hardy-Weinberg平衡;GG和GH基因型SCS最小二乘均值差异不显著(P>0.05).A1980G突变位点经Bcl Ⅰ酶切产生3种基因型II、IJ和JJ,其频率分别为0.260、0.567和0.173,荷斯坦母牛在该位点处于Hardy-Weinberg平衡;JJ基因型SCS最小二乘均值极显著低于IJ和II基因型所对应的值(P<0.01);IJ基因型SCS最小二乘均值极显著低于II基因型所对应的值(P<0.01).对于奶牛乳房炎抗性,BB和JJ是有利基因型,AA和II是不利基因型.本研究结果初步表明TLR6基因T853A和G855A突变位点的B等位基因以及A1980G突变位点的J等位基因是提高奶牛乳房炎抗性的2个潜在的DNA标记.     

新疆褐牛与荷斯坦牛NF -κB基因表达与TOLL样受体4基因型的关系

核转录因子NF-κB与动物机体的炎症反应、免疫应答、细胞分化和凋亡等密切相关,而Toll样受体（TLR）通过对侵入机体的病原微生物的抗原识别和信号转导,在NF-κB介导的炎症和免疫应答反应中发挥着重要作用。本研究在新疆褐牛和荷斯坦牛隐性乳房炎调查和TLR4外显子3 +2021 位点（E3+2021）SNP基因型与隐性乳房炎相关性研究的基础上,分析和比较了E3+2021 SNP位点3种不同基因型奶牛个体NF-κB信号通路上9个基因(NFκB1、NFκB2、RelA、c-Rel、RelB、IKKα、IKKβ、IKKγ和IκBα基因)转录水平的差异。结果显示,在BB基因型中,NFκB1和IKKα基因的mRNA转录水平在新疆褐牛与荷斯坦牛品种间差异显著（P＜0.05）,RelA、RelB、IKKβ、IKKγ和IκBα基因mRNA转录水平在品种间差异极显著（P<0.01）。在AB基因型中,IκBα基因mRNA转录水平在品种间差异显著（P＜0.05）。在对新疆褐牛的研究中发现,RelB、IKKγ和IκBα基因mRNA转录水平在AB和BB两种基因型间差异显著（P＜0.05）;而在荷斯坦牛检测的9个基因的mRNA转录水平在AB和BB两种基因型间差异均不显著。因此,Toll样受体信号转导通路下游NFκB1、RelA、IKKβ、IKKγ和IκBα基因的mRNA转录水平在品种间的变化,可能与新疆褐牛乳汁中体细胞数（SCS）显著低于荷斯坦牛相关。在新疆褐牛中,RelB、IKKγ和IκBα基因mRNA转录水平的变化可能是AA基因型SCS显著高于AB基因型的原因之一。     

安卡鸡Mx基因A2032G变异位点对经济性状的效应分析

采用错配PCR-RFLP对安卡鸡Mx基因2032位点多态性进行检测,结果表明,安卡鸡Mx基因2032位点经RsaⅠ酶切后,检测到AA、AG和GG 3种基因型,基因型频率分别为0.232、0.681和0.087,抗性等位基因A的频率为0.572。χ2适合性检验结果表明,安卡鸡Mx基因在RsaⅠ酶切位点上等位基因的分布显著偏离Hardy-Weinberg平衡状态。分析这3种基因型与安卡鸡一些经济性状间的关联性,结果表明,抗性纯合子AA基因型的个体各阶段体重、体尺、主要屠宰性状及常规肉质与AG和GG基因型的个体差异不显著,安卡鸡Mx基因2032位点对重要经济性状没有显著的负效应。     

中国荷斯坦牛Toll样受体4基因的遗传多态性与体细胞评分的关联分析

试验旨在研究中国荷斯坦牛Toll样受体4(toll-like receptor 4,TLR4)基因的遗传多态性及其与体细胞评分(somatic cell score,SCS)的关联性,寻找与乳房炎相关的分子标记,加快中国荷斯坦牛的抗病育种。利用PCR-RFLP和PCR-SSCP技术对30个公牛家系的610头中国荷斯坦牛TLR4基因进行多态性检测,用最小二乘均数法对TLR4基因的多态位点与SCS进行相关分析。结果发现,试验共检测到2个单核苷酸多态(single nucleotide polymorphisms,SNPs),TLR4基因5'侧翼区存在SNP -226 G>C突变,经PCR-RFLP检测发现3种基因型:GG、GC和CC,基因型频率分别为0.208、0.482和0.310;外显子3存在SNP 1760 C>T突变,经PCR-SSCP检测发现3种基因型:CC、TC和TT,基因型频率分别为0.738、0.225和0.007,以上2位点均偏离Hardy-Weinberg 平衡。对于SNP -226 G>C位点,基因型个体的SCS差异不显著;对于SNP 1760 C>T位点,CC基因型个体的SCS最小二乘均值极显著低于TT和TC基因型个体(P<0.01)。SNP 1760 C>T的CC基因型对于中国荷斯坦牛的SCS有较大的遗传效应,可作为分子标记应用于奶牛乳房炎抗性筛选。     

羊C3d基因与细粒棘球蚴EG95s基因在杆状病毒中的串联表达

本研究通过构建含有3拷贝羊C3d基因与细粒棘球蚴EG95s基因的重组杆状病毒,旨在通过昆虫细胞表达EG95-(C3d)3重组融合蛋白,为原核表达和真核表达EG95-(C3d)3重组融合蛋白的免疫效果的比较奠定了基础。将细粒棘球蚴EG95s基因与3拷贝羊C3d基因串联,插入pTarget载体,获得重组质粒pTarget-EG95-(C3d)3,利用BamH Ⅰ和Xba Ⅰ双酶切位点将目的基因EG95-(C3d)3克隆至Bac-to-Bac系统的转移载体pFastBac-Hta中,获得pFastBacHta-EG95-(C3d)3重组质粒,将该重组质粒转化含穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10Bac中进行转座重组,获得携带3拷贝羊C3d基因与细粒棘球蚴EG95s基因的重组转座子rBacmid-EG95-(C3d)3,转染Sf9昆虫细胞后获得EG95-(C3d)3重组杆状病毒,并表达EG95- (C3d)3重组融合蛋白,采用SDS-PAGE和Western blotting进行重组蛋白的鉴定。同时利用昆虫细胞表达蛋白对羊棘球蚴病特异性抗体进行检测。结果表明,获得了EG95-(C3d)3重组杆状病毒,且EG95-(C3d)3重组融合蛋白在Sf9昆虫细胞得到了正确表达,大小约为132 ku,Western blotting鉴定结果显示表达的EG95-(C3d)3重组融合蛋白能与细粒棘球蚴阳性血清产生特异性反应,表明EG95-(C3d)3基因表达产物具有免疫活性。同时表达蛋白对羊棘球蚴病特异性抗体有良好的敏感性。EG95-(C3d)3基因在昆虫细胞获得表达,为原核表达和真核表达EG95-(C3d)3重组融合蛋白的免疫效果的比较,及细粒棘球蚴病的高效检测方法的建立奠定了基础。     

BoLA-DQA、DRB3* exon2多态性及其与奶牛乳房炎的关联分析

采用PCR-SSCP技术，检测到9种中国荷斯坦牛BoLA-DQA^＊ exon2基因基因型、15种BoLA-DRB3^＊ exon2基因的基因型和3种单体型，分析比较了各基因型、单体型与奶牛乳房炎的关联性。结果在中国荷斯坦牛中，没有发现与乳房炎易感性或抗性有关联的基因和基因型，但发现DQA-B／DRB3-C、DQA-G／DRB3-F两种单体型可能与奶牛乳房炎易感性有关，而DQBF／DRB3-E单体型可能与奶牛乳房炎抗性有关。     

苏太猪ESR基因多态性及其与繁殖性能的关联分析

本研究采用PCR-RFLP方法对苏太猪的ESR基因PvuⅡ位点多态性进行检测,并分析其与繁殖性能间的关系。结果表明,ESR基因的3种基因型AA、AB、BB在苏太猪中的频率分别为0.089、0.570、0.341;其中在初产母猪中,AA基因型个体的产活仔数（NBA）和初生窝重（BLW）显著高于AB、BB 基因型的个体（P<0.05）;在经产母猪中,AA基因型个体的总产仔数（TNB）及断奶成活数（NW）显著高于AB和BB基因型的个体（P<0.05）,AA和AB 基因型与BB 基因型之间的断奶窝重（WWL）差异显著（P<0.05）;总体上苏太猪ESR基因PvuⅡ 3种基因型个体的繁殖性状存在AA>AB>BB的趋势。     

山西白猪DECR1基因多态性与生长性状的关联分析

采用PCR-SSCP方法检测了192头山西白猪DECR1基因第5外显子位点的多态性,并采用最小二乘法拟合线性模型（GLM）对该位点多态性与山西白猪生长性状的关联性进行了分析。结果表明,DECR1基因第5外显子位点存在多态性,表现出CC、CD、DD 3种不同基因型。DECR1基因不同基因型对山西白猪6月龄体重、体高和胸围均有显著影响。CD基因型个体6月龄体重、体高、胸围都显著高于DD型个体（P＜0.05）;3种基因型对体长的影响均未达到显著水平（P＞0.05）,但呈现出CD＞CC＞DD的趋势;3种基因型对背膘厚的影响差异不显著（P＞0.05）,但呈现出CC＜CD＜DD的趋势。因此,初步推定CD基因型对选择有正向遗传效应。     

贵州白山羊GDF9基因编码区1007位点的多态性

生长分化因子9(growth differentiation factor 9,GDF9)基因是卵母细胞分泌的生长因子,调节卵泡的早期生长和分化。对贵州白山羊GDF 9基因的研究结果显示,编码区1007位碱基与已知山羊不同。为了研究1007位点对贵州白山羊繁殖力的影响,采用锚定PCR对GDF 9基因外显子2第18位氨基酸密码子所在区域进行了扩增、克隆测序和基因型分析,结果表明,GDF 9基因编码区1007位点表现出C/T多态性,使成熟肽第18位氨基酸为丙氨酸/缬氨酸替换;低产母羊均为杂合基因型,高产母羊中90%为杂合基因型,高产羊群与低产羊群之间基因型频率差异不显著（P＞0.05）,表明GDF 9基因1007位点的多态性与贵州白山羊产羔数之间没有直接的相关性。     

荷斯坦牛TLR6基因多态性分析

为研究中国荷斯坦牛TLR6基因的多态性,确定其等位基因数以及核苷酸变异位点,探讨其遗传特性,采用PCR-SSCP技术对303头荷斯坦牛的TLR6基因进行了遗传多态性检测。结果表明:TLR6基因在扩增区域的209 bp处发生G→A的错义突变,导致TLR6蛋白中第70位天冬氨酸(Asp)变为天冬酰胺(Asn),并产生AA、BB、AB三种基因型,基因型频率分别为0.214 5、0.122 1和0.663 4,经χ~2适合性检验,荷斯坦牛在该位点偏离了Hardy-Weinberg平衡状态(P0.05)。说明中国荷斯坦牛TLR6基因多态性丰富,该位点可以作为荷斯坦牛抗病育种的分子标记位点。     

奶牛结核分枝杆菌rpoB和katG基因突变与多重耐药的相关性

本试验旨在研究奶牛结核分枝杆菌rpoB和katG基因突变与耐药性之间的关系。将临床分离的30株牛源结核分枝杆菌,利用噬菌体生物扩增法（phage amplified biologically assay,PhaB）检测其对利福平（RFP）和异烟肼（INH）的药物敏感性,采用聚合酶链式反应—DNA直接测序法（PCR-DS）扩增rpoB和katG基因并测序,分析rpoB和katG基因突变及其耐药相关性。15株表型耐药菌株中4株单耐RFP,PCR产物直接测序后发现3株在rpoB基因531位点发生突变,突变率为75.00%（3/4）;9株单耐INH菌株中7株发生突变,6株katG基因315位点基因突变,突变率为85.71%(6/7),1株发现463位点密码子基因突变,突变率为14.29%（1/7）;2株耐RFP的同时也对INH耐药,测序发现2株均在rpoB基因的531位点〖JP2〗和katG基因的315位点发生突变。所有菌株均未发现rpoB和katG基因的缺失。rpoB基因531位点和katG基因315位点的突变是RFP和INH产生耐药性的主要机制;检测牛源结核分枝杆菌RFP耐药性的同时可以初步筛选耐多药结核分枝杆菌。     

鸭源致病性大肠杆菌耐氟苯尼考floR基因的克隆与序列分析

为调查鸭源致病性大肠杆菌氟苯尼考耐药基因floR的存在情况,利用PCR对20株临床分离的耐氟苯尼考的致病性大肠杆菌进行floR分子检测,分子检测结果显示,全部菌株floR基因阳性;对其中2株大肠杆菌的氟苯尼考耐药基因floR进行了克隆和测序,结果表明,鸭源大肠杆菌floR基因片段的克隆测序结果与预期所得片段结果相符,长度为753 bp,2株鸭源大肠杆菌floR基因的同源性为99.6%,与牛源、鸡源等floR基因的同源性为84.8%～99.9%。系统发育分析发现,2株鸭源大肠杆菌floR基因不在同一支上,亲缘关系较远,表明floR基因的亲缘关系与该基因的来源动物无关。     

ESR和FSHβ基因与晋阳白猪繁殖性状关系研究

用PCR-RFLP和PCR方法对60头晋阳白猪的ESR和FSHβ基因进行研究,分析了ESR和FSHβ不同基因型繁殖性状的差异。结果表明,在所检测的猪群中,ESR和FSHβ基因对繁殖性状有显著影响,B等位基因为有利基因,BB型均为优良基因型。     

中国荷斯坦牛IL8基因SNP-233（G＞A）不同基因型的表达差异研究

[目的]本研究旨在研究中国荷斯坦牛IL8基因-233（G＞A）位点不同基因的表达差异水平,为探讨该位点在抗奶牛乳房炎作用提供理论依据.[方法]本试验运用SYBRGreen实时荧光定量PCR技术进行定量测定.[结果]GG基因型个体mRNA的表达量显示高于GA和AA基因型个体的表达量.[结论]IL8基因-233（G＞A）位点对中国荷斯坦牛乳房炎抗性有一定影响,可用于中国荷斯坦牛的抗乳房炎的分子标记辅助选择.     

延边黄牛PRKAG3基因第10外显子单核苷酸多态性及其与肉质性状的相关分析

采用PCR-SSCP方法对120头延边黄牛PRKAG3基因的多态性进行检测,结果发现第10外显子存在C4738T突变,产生3种基因型。不同基因型与肉质性状均值差异显著性检验结果发现,基因型CT与a*24、b*24、油酸存在一定的负相关（P＜0.05）;与嫩度、谷氨酸、精氨酸、丙氨酸、缬氨酸和脯氨酸有一定的正相关（P＜0.05）;基因型CC与天冬氨酸存在一定的正相关（P＜0.05）。     

荷斯坦牛TLR2基因遗传多态性与乳腺炎抗性关系分析

利用PCR-RFLP方法检测TLR2基因在297头中国荷斯坦牛中的多态性,并分析其多态性与体细胞评分(SCS)的相关性.结果显示,TLR2基因exon2扩增片断的109 bp处产生C→A的突变,并导致天冬氨酸改变为谷氨酸.TLR2基因exon2被EcoRV消化后表现多态性,表现AA、AB、BB 3种基因型,其中B等位基因为优势等住基因,等位基因频率为0.784 5,而A等位基因频率则为0.215 5.经X2适合性检验,中国荷斯坦牛在该位点达到Hardy-Weinberg平衡状态.同时,群体EcoRV基因座不同基因型与SCS相关分析的结果表明,BB、AB型个体的SCS指标显著高于AA型(P<0.05),AA基因型可作为乳腺炎抗性的有利基因型,可将TLR2作为奶牛乳腺炎候选基因,应用于乳腺炎抗性分子标记辅助选择育种.     

牛TLR4基因的遗传多态性与乳房炎的关联分析

TLR4通过识别病原体而激活免疫细胞，在先天免疫和适应性免疫防御中起着重要作用。以中国荷斯坦奶牛、三河牛和中国西门塔尔牛共397头为研究对象，利用创造酶切位点PCR法扩增243bp的目的片段，通过限制性内切酶HinfⅠ酶切来检测TLR4第3外显子的多态性，结果发现扩增产物的27bp处C到T的突变使得多态位点产生，编码的氨基酸由苏氨酸变为异亮氨酸。A、B2个等位基因在3个群体中均有分布，A等位基因占优势（大于78％），经χ^2适合性检验，三河牛在该位点未达到Hardy-Weinberg平衡状态（P〈0．05）。运用SAS8．2软件采用最小二乘法拟合线性模型，将该基因座不同基因型与奶牛乳房炎进行了关联分析，结果表明：AA基因型为乳房炎抗性基因型（P〈0．05），A等位基因为乳房炎抗性的有利基因。     

绵羊DECR1基因exon 5部分序列多态性分

试验根据GenBank登录的牛2,4-双烯-CoA还原酶1（2,4-dienoyl-CoA reductase1,DECR1）基因序列（NP_001068891）设计引物,应用PCR技术对德国美利奴绵羊、杜泊绵羊、特克塞尔绵羊DECR1基因的exon 5部分序列进行克隆测序;利用PCR-SSCP技术检测了3个绵羊群体exon 5单链构象多态性（SNP）,所获序列与GenBank中其他物种exon 5序列进行了同源性比较,并构建了亲缘关系聚类分析图。结果表明,绵羊DECR1基因exon 5长为137 bp,3个绵羊群体中exon 5均不存在SNPs,各种动物之间DECR1基因exon 5的同源性较高,在81.02%（鸡）～97.08%（牛）之间,其中绵羊和牛同源性最高,达到97.08%;与鸡的同源性最低,为81.02%;聚类分析结果显示,绵羊首先与牛聚为一类,再分别与兔子、狗聚为一类,最后分别与人、猪聚为一类,绵羊与牛的亲缘关系最近,与鸡的亲缘关系最远,与传统分类相一致,说明DECR1基因exon 5在动物进化过程中高度保守。