MAR序列介导野苋菜凝集素基因在白菜中的表达

以‘丰顺’白菜带柄子叶为转化受体, 用带有MAR (Matrix Attachment Region) 和不带MAR的两种植物表达载体进行农杆菌介导转化野苋菜凝集素基因(Amaranthus viridis L. agglutinin, AVA ) 获得转基因的抗蚜小白菜。分析MAR序列介导对转基因表达的影响。表明利用MAR序列介导AVA 基因表达,获得转基因植株的数量比对照提高29.63%; 转AVA基因白菜对桃蚜(Myzus persicae) 的群体发展有一定的抑制作用, 平均抑制率为55.8%; MAR序列介导AVA 基因表达的转基因植株中, 该基因的表达水平比对照高, 并且不同转基因单株间AVA基因表达差异比对照小。     

雪花莲外源凝集素基因在大白菜中的表达和抗蚜性遗传分析

 通过农杆菌介导法将雪花莲外源凝集素基因(gna)导入了大白菜自交系282。分子检测和抗虫试验表明gna基因已整合进大白菜基因组，转基因植株较非转化对照植株有一定的抗蚜虫能力，抗虫性好的植株可以检测到较强的gna基因转录产物；后代遗传分析表明外源基因在转基因大白菜植株282-3和282-9的T₁代呈3:1的孟德尔分离比例。     

月季Rchsp1718基因转化烟草的非生物胁迫耐性研究

 为了研究从月季中分离的小分子热激蛋白Rchsp1718的生理功能, 把Rchsp1718的编码框插入到表达载体PHB的35S组成型启动子后面, 通过农杆菌GV3101转化烟草, 获得转基因植株。在高温、干旱、渗透、高盐胁迫条件下分别检测转基因烟草形态、失水率、电导率、脯氨酸含量及其内外源基因表达模式。结果显示: 与对照相比, 转基因烟草抗性表型明显, 电导率较低, 脯氨酸含量大幅度提高, 失水率降低; P5CS基因的表达量上调, 说明转Rchsp1718基因烟草苗在高温以及高渗透胁迫下表现出明显的耐受性。     

甜瓜反义酸性转化酶基因对甜瓜的遗传转化

利用子房注射法将甜瓜反义酸性转化酶基因导入厚皮甜瓜自交系‘0123’果实, 应用PCR和Southern Blot对后代进行分子鉴定。结果表明, 330株甜瓜转化植株中, 有2株为阳性转基因植株, 转化率约为0.6%。进一步研究发现, T0代转基因甜瓜植株生长势减弱, 果实比对照小30%左右, 但可溶性糖含量比对照提高了52%。PCR和PCR - Southern Blot鉴定表明, T0-1的自交后代没有基因丢失, 反义酸性转化酶基因已在转基因植株中稳定遗传。T1代转基因植株生长势也明显减弱, 但成熟果实可溶性总糖含量提高了26% , 蔗糖含量比对照提高了2.5倍, 果糖和葡萄糖含量略有降低, 酸性转化酶活性比对照明显降低。这些结果表明, 反义酸性转化酶基因通过降低酸性转化酶活性, 调控了甜瓜果实蔗糖代谢过程, 改变了甜瓜果实糖分组成, 同时抑制了植株生长。     

月季Rchsp17.8基因转化烟草的非生物胁迫耐性研究

为了研究从月季中分离的小分子热激蛋白Rchsp1718的生理功能, 把Rchsp1718的编码框插入到表达载体PHB的35S组成型启动子后面, 通过农杆菌GV3101转化烟草, 获得转基因植株。在高温、干旱、渗透、高盐胁迫条件下分别检测转基因烟草形态、失水率、电导率、脯氨酸含量及其内外源基因表达模式。结果显示: 与对照相比, 转基因烟草抗性表型明显, 电导率较低, 脯氨酸含量大幅度提高, 失水率降低; P5CS基因的表达量上调, 说明转Rchsp1718基因烟草苗在高温以及高渗透胁迫下表现出明显的耐受性。     

黄河蜜甜瓜CMV CP基因转化及其抗病性鉴定

利用整合有CMVCP基因及NPT-II基因的改建质粒pBim438,以农杆菌为载体,对黄河蜜甜瓜子叶进行转化,以75mg/L卡那霉素筛选转化体,获得了完整的转基因植株。Southern杂交证明转化植株整合了CMVCP基因,Western杂交证明转基因获得了表达。温室CMV攻毒试验及病毒含量测定表明,转基因甜瓜对CMV的侵染表达了较高的抗病性,能够推迟系统症状显症发生,减轻病害发生程度,转基因植株体内病毒含量低于对照。转基因植株抗病性存在差异,筛选出的2个抗性株系中,TM0-1抗性高于TM0-2。     

大白菜转修饰豇豆胰蛋白酶抑制剂基因获得抗虫植株

 以大白菜3 d 苗龄带柄子叶为外植体, 经根癌农杆菌(Agrobacterium tumef aciens) 介导, 将修饰的豇豆胰蛋白酶抑制剂基因(sck) 导入大白菜自交系‘GP-11’和杂交种‘中白4号’, 并获得了卡那霉素抗性植株。PCR 检测和Southern blot 杂交证实, sck 基因已整合进大白菜基因组中; 豇豆胰蛋白酶抑制剂活性检测表明, 大部分转基因植株都对牛胰蛋白酶有一定的抑制活性, 对照未转化植株抑制活性很低。室内离体叶片饲虫和田间自然抗虫性鉴定进一步证明, 转基因植株对菜青虫(Pieris rapae L. ) 具有一定抗性。     

根癌农杆菌介导BDN1 基因转化马铃薯的研究

以马铃薯品种东农303 微型薯为试验材料,通过根癌农杆菌介导法,将来自耐旱植物厚 叶旋
蒴苣苔的脱水蛋白基因BDN1 导入马铃 薯,并对其遗传转化的影响因素进行了研究。获得了抗性再生植株
35 株 ;PCR 检测27 株呈阳性;Southern-blot 检测4 株呈阳性,表明BDN1 基因已整合到马铃薯基因组中;
半定量RT-PCR 检测结果表明BDN1 基因在马铃薯抗性植株中表 达。通过对相对含水量、脯氨酸、丙二醛
含量和SOD 活性测定,证明4 个转基因株系对干旱胁迫的抗性显著高于对照植株。     

月季抗白粉病基因RhMLO的亚细胞定位及功能分析

MLO是一类新发现的抗病基因,一些双子叶植物隐性突变的mlo基因使其获得了广谱高抗的抗病性。通过生物信息学分析结合亚细胞定位试验,对前期克隆获得的月季MLO进行亚细胞定位,结果表明,RhMLO1和RhMLO2均为主要分布于细胞质膜、液泡膜和细胞核的跨膜蛋白,与预测结果相符。构建了RhMLO1的正义表达载体,通过农杆菌介导法对月季‘白玉’植株体细胞胚进行遗传转化。利用PCR法和荧光定量PCR法对转基因植株进行分子检测,表明基因已经整合到转基因植株中。分别利用离体鉴定法和显微镜观察法对转基因植株和对照植株进行对白粉病菌(Podosphera pannosa)抗性鉴定,结果一致显示:正义载体的导入降低了转基因植株对白粉病的抗性。     

农杆菌介导PSAG12-IPT基因转化辣椒的研究

异戊烯基转移酶(Isopentenyl-Transferasas,IPT),也称作细胞分裂素合成酶,是植物中细胞分裂素合成的限速酶。IPT在转基因植株中超表达后,会使叶片中的细胞分裂素含量增加,从而延缓叶片衰老。但过高对植物的生长和育性都是有害的。如果将衰老特异性启动子(PSAG)与IPT基因融合,在它的驱动下表达,只有在叶片衰老时才表达合成分裂素,既能延缓衰老又不影响植物的生长发育。以p CAMBIA1301-PMI表达载体为基础载体,用衰老特异性启动子驱动目的基因IPT,用辣椒Flamingobill外植体作受体,采用农杆菌介导的方法转化辣椒,并利用甘露糖筛选体系对辣椒转化体进行筛选,对转基因植株进行分子生物学检测和抗衰老检测。结果表明,共获得82株抗性植株,PCR检测的阳性率约为50%。而在对T1代的PCR检测表明该基因能稳定遗传给下一代。这些经转化的植株具有叶片衰老延缓及植株生命周期延长等现象,花的衰老也有所延缓。T1的株高和侧芽萌发与对照相比无明显差异。     

基因枪介导的高羊茅基因转化体系的建立

 用高羊茅( Festuca arundinacea Schreb. ) 种胚离体诱导的胚性愈伤组织作受体进行了基因枪的轰击试验, 确定了以轰击2 枪, 子弹距可裂圆片6 cm , 子弹距轰击受体6 cm 为最佳轰击参数, 建立了基因枪优化转化方案, 获得了遗传稳定的抗除草剂PPT 的转化植株。随机抽取的转化植株的Bar 基因PCR检测、总DNA 点杂交, 皆成阳性, 除草剂PPT 抗性试验表明, 转化植株比对照有了更强的抗性。     

高羊茅抗真菌病基因转化的研究

 通过农杆菌介导法将双价载体(含抗真菌病的几丁质酶基因Chi和β - 1, 3 - 葡聚糖酶基因Glu) 导入高羊茅愈伤组织细胞内, 建立了高羊茅的农杆菌转化体系, 获得了抗真菌病的转基因高羊茅植株。在转化过程中, 确定了卡那霉素(Kan) 筛选剂的浓度以200～300 mg/L为宜, 联合运用羧苄青霉素(Carb) 与头孢霉素(Cef) 作为抗菌素能得到好的脱菌效果; 农杆菌的几种共培养方式对转化频率的影响表明, 共培养基上垫一层滤纸, 愈伤周围滴加浸染液, 恢复培养1周后用甘露醇和抗生素液洗涤, 是一种好的转化方式。对转化植株进行PCR分析和分子杂交及禾谷镰刀菌挑战接种, 发现转化植株有高阳性率及抗真菌能力。     

高羊茅EST-SSR标记开发及遗传多样性分析

采用从其他作物转移与利用自身EST序列设计两种方法为高羊茅（Festuca arundinacea L.）开发EST-SSR分子标记,并利用所开发标记对高羊茅品种（系）进行遗传多样性分析。利用来自小麦、大麦、玉米、高粱和水稻的732对EST-SSR在高羊茅上进行通用性分析,得到406个有效的扩增引物对（55.46%）。利用高羊茅EST数据库（GenBank/dbEST）中63 853条EST序列进行微卫星序列的查找,共发现包含微卫星的EST序列420条,占整个EST总数的0.658%。其中三核苷酸基序出现频率最高（43.33%）,次之为二核苷酸基序（33.57%）。二核苷酸基序以CT/GA出现频率最高（16.90%）,三核苷酸基序以CAG/GTC出现的频率最高（10.63%）。进一步运用Primer 5.0软件设计了108个引物对,并交上海桑尼公司合成。PCR检测表明,92个引物对（85.19%）在高羊茅中均可以扩增出稳定清晰的带型。从498对（其中5种作物的406对,高羊茅的92对）有效扩增的EST-SSR引物中随机选取81对引物,对12个高羊茅品种（系）进行扩增。79个引物对显示出多态性（97.53%）。共检测到133个等位变异,平均每对引物有1.68个等位变异;多态性信息含量（PIC）值最高为0.66,最低为0.14,平均为0.48。聚类分析结果表明,12份材料在相似系数为0.61处可分为5大类：第Ⅰ类为‘爆发力’和‘法思’;第Ⅱ类为‘强劲’、‘家园’和‘翠碧A’;第Ⅲ类为‘可其思3号’和‘凌志’;第Ⅳ类为‘雅典娜2号’、‘美洲虎3号’、‘火凤凰’和‘TF160’;‘球道’单独为第Ⅴ类。     

发根农杆菌K599对菊花活体转化及其高效再生

 发根农杆菌K599侵染菊花无菌苗刻伤的叶片形成转基因不定根,生根频率为88.0%;不定根经过诱导培养形成愈伤组织,并再生完整植株,愈伤组织诱导率和分化率分别为75.0%和63.3%。诱导的不定根和再生植株经过PCR鉴定含有K599 Ri质粒中的rolC基因,qRT-PCR检测显示rolC基因在再生转基因植株中实现了正常表达。再生植株表现出矮缩、多毛状根特征,并能正常开花。建立的利用活体材料直接作为发根农杆菌K599侵染的受体诱导不定根的遗传转化体系,能克服假阳性不定根的出现;同时,利用不定根繁殖过程中顶端生长点区域无菌的特点,通过截取不定根顶端靠近生长点区域进行继代培养,结合使用头孢霉素杀菌,能达到有效抑制和杀灭农杆菌的目的,在随后的不定根诱导愈伤及分化过程中无须再使用抗生素杀菌,提高了转基因再生效率,为菊花的矮化育种和目标基因的转移提供了良好的试验体系。     

根癌农杆菌介导Cry1Ac基因转化‘雪青’梨获得转基因植株

 以‘雪青’梨叶片愈伤组织为外植体, 经根癌农杆菌介导将CaMV35S启动子调控下的Cry1Ac基因导入‘雪青’梨。698块愈伤组织和231个Kan^r芽与携带表达载体质粒pBX203的根癌农杆菌菌株LBA4404共培养3 d后, 转入含50 mg·L^-1 Kan的筛选培养基培养30 d, 15 d转接1次。结果表明,在MS + 5 mg·L ^-1 6-BA + 0.1 mg·L^-1 IAA筛选培养基中, Kan^r芽率为34.24% , 在1/2MS + 2 mg·L^-1 IBA+ 0.5 mg·L^-1 6-BA + 500 mg·L^-1AC筛选培养基中, 15.58% Kan^r芽生根。共获得再生植株32株, 经PCR和Southern-blot分析证明, 其中4株的基因组已成功导入和整合Cry1Ac基因。     

农杆菌介导ODREB2B基因转化马铃薯的研究

以马铃薯品种黄麻子和中薯3号脱毒微型薯为外植体,利用根癌农杆菌介导法,将来源于诸葛菜的抗逆相关转录因子ODREB2B基因导入马铃薯,并对遗传转化的影响因素进行优化。获得抗性植株黄麻子33株、中薯3号27株,经PCR-Southern杂交分析,两品种分别有16株和14株呈阳性,证明ODREB2B基因已整合到马铃薯基因组中。     

聚合物包膜尿素氮释放特性及其对高羊茅草坪生长的影响

 通过静态水溶试验和草坪施肥试验, 研究了高分子聚合物包膜尿素( PCU) 的养分释放特性及春季一次性施用对高羊茅草坪生长的影响。结果表明, 由于肥料所处环境温度不同导致实验室静态水溶法测定PCU养分释放速度快于其在田间的实际释放速度。田间试验中一次性施用该肥料可以满足高羊茅草坪整个春季生长对氮素养分的需要; 与尿素和市场上的草坪肥料相比, 草坪质量无显著差异, 且草坪生长速度均匀, 草屑量相对较少, 起到了减少草坪修剪次数降低养护强度的作用。     

提高苹果基因转化效率的研究

采用根瘤农杆菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）强株系ＥＨＡ１０５（ｐ３５ｓＧＵＳ－ｉｎｔｒｏｎ）研究了影响‘皇家嘎拉’苹果（Ｍａｉｎｓ ｄｏｍｅｓｔｉｃａ Ｂｏｒｋｈ．）外植体的β-葡萄糖醛酸酶（ＧＵＳ）基因的瞬时、稳定表达水平和转基因植株的再生。证明在培养基生长素（ＩＢＡ、ＮＡＡ）存在的条件下,外植体的ＧＵＳ基因的瞬时表达水平提高了３－４倍,而共培养两周后稳定表达水平提高２倍以上,产生９．８个ＧＵＳ愈伤组织表达区域。白化处理促进外植体的基因转化,白化处理的新梢顶端第一节间外植体ＧＵＳ表达区域比常用的叶片外植体高４倍。在生长素存在的条件下 ２％外植体获得了转基因植株。Ｓｏｕｔｈｅｒｎ　ＢｌｏｔＤＮＡ杂交和组织化学染色分析证明ＧＵＳ基因已整合到苹果的染色体上,并得以表达。     

Management of Tomato Ringspot Virus in Red Raspberry with Crop Rotation

Abstract

Tomato ringspot virus (ToRSV) is an important disease of red raspberry which is vectored by the dagger nematode, Xiphinema americanum. A field study was conducted to evaluate crop rotation as an alternative to soil fumigation for the management of ToRSV. The effects of treatments on nematode population densities and ToRSV were evaluated for 18 months during growth of rotation crops, and for 36 months after replanting raspberries. Treatments included the rotational crops rapeseed (Brassica napus) and tall fescue (Festuca arundinacea) (nonhosts for ToRSV), clean fallow, fumigation with methyl bromide, and controls in which raspberries followed raspberries. At planting, X. americanum densities were highest in fescue and control plots and lowest in fumigated plots, but densities decreased and remained low in all plots after planting ‘Meeker’ raspberries. Raspberry leaves were collected in each plot and assayed for ToRSV with ELISA for 3 years. ToRSV was detected only in the control plots. Rotations with rapeseed or tall fescue, or weed-free fallow were as effective as fumigation with methyl bromide in preventing re-infection of raspberry plants with ToRSV for three years.