单细胞测序对绒山羊毛乳头细胞的鉴定

【目的】 基于单细胞测序技术探究绒山羊毛乳头细胞标记基因,优化毛乳头细胞体外鉴定的方法,为研究绒山羊毛囊发生发育提供良好的细胞模型。【方法】 运用Seurat单细胞分析法分析陕北白绒山羊胚胎期60、90、120 d皮肤组织的单细胞测序数据。原始数据经质控、过滤、标准化后,采用UMAP方法进行数据降维与聚类分析。通过对比已报道的毛囊相关标记基因,获得完整绒山羊毛囊细胞类群谱系信息。通过基因差异表达分析,筛选绒山羊毛乳头细胞特异性标记基因。利用免疫荧光试验鉴定标记蛋白在绒山羊皮肤组织中的表达与分布情况,进一步筛选毛乳头区域特异性表达蛋白。体视镜下机械分离完整绒山羊毛囊,采用酶消化法分离绒山羊毛乳头区域并在体外培养至细胞分离,最终通过差速贴壁法纯化细胞。待毛乳头细胞纯度较高时,利用免疫荧光试验验证候选标记蛋白在分离细胞中的表达情况。【结果】 从单细胞水平分析了绒山羊毛囊发生过程中涉及的关键细胞转录信息,成功获得绒山羊皮肤中的17个主要细胞类群信息,鉴定出包括真皮细胞谱系、表皮细胞谱系、毛乳头细胞、毛干细胞、内根鞘细胞等绒山羊皮肤结构关键细胞类群,以及周皮细胞、巨噬细胞、肌肉细胞等其他功能细胞类群。筛选获得毛乳头细胞特异性基因427个,包括SOX2、FGF7、APOD、BMP3、HHIP、HEY2和SPON1等,这些基因在绒山羊毛乳头细胞中的表达丰度远高于其他细胞类型,被认为是毛乳头细胞特异性标记基因。组织免疫荧光试验进一步证明SOX2、FGF7与APOD等蛋白在绒山羊毛乳头区域内特异性表达,可用于皮肤组织中绒山羊毛乳头细胞的定位。此外,本研究在成功分离单根绒山羊次级毛囊的基础上,实现了绒山羊毛乳头区域的贴壁培养,成功观测到大量细胞从毛乳头区域逐步迁移分离的过程。细胞免疫荧光试验结果显示SOX2、FGF7与APOD均在绒山羊毛乳头细胞中表达,且SOX2阳性细胞约占毛乳头细胞总量的76%左右,而FGF7和APOD阳性细胞则占98%以上。结合绒山羊皮肤组织免疫荧光定位结果,SOX2、FGF7与APOD等标记可用于鉴定体外分离培养的绒山羊毛乳头细胞。【结论】 利用单细胞测序技术描述了绒山羊主要皮肤细胞的转录组信息,筛选出毛乳头细胞特异性表达基因。经免疫荧光试验证实,单细胞测序鉴定标记基因的方法简单高效,且具备较高准确率。筛选的SOX2、FGF7与APOD不仅为绒山羊毛乳头细胞体内定位提供了有效的标记,而且为多标记鉴定毛乳头细胞提供可能,更为进一步研究毛囊发育相关基因的功能及调控机制奠定重要基础。     

内蒙古绒山羊毛囊形态发生规律

以胚胎龄40~110 d内蒙古二郎山绒山羊胚胎体侧部皮肤为材料,通过石蜡切片、HE染色,研究绒山羊胚胎毛囊形态发生规律。结果显示,内蒙古绒山羊胚胎皮肤初级毛囊形态发生经历毛基板前期、毛基板期、毛芽期、毛钉期和毛囊期5个时期,这5个时期又可根据其形态结构的差异划分为不同的亚期,内蒙古绒山羊胚胎皮肤初级毛囊形态发生与汗腺的发生相伴随;内蒙古绒山羊皮肤初级毛囊形态发生是分批进行的。在胚胎龄40~110 d内蒙古绒山羊胚胎体侧部皮肤未观察到次级毛囊的发生。     

Wnt5a基因在鹅皮肤中的定量定位表达特性

采用荧光定量PCR方法和免疫组化方法,研究了Wnt5a基因在鹅胚胎期皮肤定量表达及定位表达的规律,并运用显微测微尺测量毛囊深度。结果表明:Wnt5a基因在胚胎期12~20 d均有表达,其中12~20 d表达量持续上升,20 d表达量最高,20 d以后表达量开始降低,但趋于稳定。Wnt5a基因在13 d的表皮、真皮及羽芽处表达,18 d在羽枝嵴和毛乳头大量表达,23 d在初级毛囊的毛乳头和毛囊干细胞处有少量表达,在次级毛囊中少量表达,29 d初级毛囊形态发生基本完成,Wnt5a基因几乎不表达,在次级毛囊中表达。毛囊深度结果表明:14~20 d,毛囊深度缓慢增加,但是深度增加不明显,Wnt5a抑制毛囊生长发育;20~26 d,是毛囊深度发育的高峰,Wnt5a含量降低,对初级毛囊发育没有抑制作用;26 d以后,深度几乎没有变化。次级毛囊18 d开始发育;18~20 d,次级毛囊深度发育缓慢,高表达量Wnt5a抑制次级毛囊发育;此后Wnt5a表达量降低,次级毛囊深度不断增加。     

苏博美利奴羊胎儿皮肤毛囊结构及形态发育

【目的】研究苏博美利奴羊毛囊的组织结构与形态发育过程,为解析细毛羊毛囊发育的分子调控机制奠定组织学基础。【方法】采用石蜡切片技术分析胎龄为第65、85、105和135天的苏博美利奴羊胎儿头部、颈侧、颈上缘、鬐甲、背部、体侧、肩甲、腹部、荐部及股部等10个不同部位皮肤的组织学特性。【结果】苏博美利奴羊毛囊结构同其它动物一样,由毛球、连接组织鞘、外根鞘、内根鞘和毛干等几部分组成。在胎龄65d时初级毛囊(primary follicles,PF)已经发生形成毛芽,毛芽延长,继续向真皮层深入,形成柱状结构,通过由大量真皮细胞在末端聚集,形成帽子结构,各部位表皮均形成完整的结构。胎龄85d时毛囊上部形成一个膨大部,在毛乳头上方形成锥形结构,毛球基本形成,毛乳头长度明显大于宽度;在初级毛囊基底部可见次级毛囊(secondary follicles,SF)的囊泡结构,并形成皮脂腺原始细胞。在胎龄105d时次级毛囊大量形成,伴随着初级毛囊毛芽伸长,次级毛囊毛芽向真皮层深入,毛乳头直径逐渐增大,皮脂腺开始形成;原始次级毛囊颈部隆突部开始再分化出再分化次级毛囊(secondary-derived follicles,SD),并可见汗腺,毛管发育完整;已形成完整的毛囊群结构,主要为三元毛囊群,每个毛囊群由1—3个初级毛囊和围绕其周围的几个次级毛囊组成。胎龄135d时大量形成再分化次级毛囊,形成成熟的汗腺,大部分初级毛囊和部分次级毛囊发育成熟,毛囊形成角质化毛干并穿出体表。【结论】苏博美利奴羊胚胎皮肤初级毛囊约50—55d开始形成;胎龄65—75d是初级毛囊形成的重要时期;胎龄80—85d是次级毛囊形成期,此时期,初级毛囊大量形成;胎龄105—135d是次级毛囊大量再分化,再分化次级毛囊形成及发育的关键时期。     

5-溴-2-脱氧尿嘧啶核苷标记内蒙古绒山羊皮肤组织的免疫组织化学检测（摘要）

探讨5-溴-2-脱氧尿嘧啶核苷（5-bromo-2-deoxyuridine,BrdU）标记内蒙古绒山羊皮肤组织的可行性及免疫组织化学检测的最优条件。对试验组绒山羊颈静脉注射BrdU,活体背部皮肤采样,4％多聚甲醛固定,石蜡包埋,切片,利用免疫组织化学技术检测切片中是否有阳性细胞分布：通过对BrdU不同注射剂量、生物素标记的第二抗体和链霉菌抗生物素-过氧化物酶各自稀释度、抗原修复方式及DNA变性温度对BrdU标记结果的影响,     

南疆绒山羊皮肤毛囊性状参数与生产性状的相关分析

[目的]研究新疆南疆绒山羊皮肤毛囊结构,分析毛囊数与产绒量之间,毛囊直径与绒细度之间的关系,为新疆南疆绒山羊绒毛发育的分子调控机理的研究奠定组织学基础.[方法]通过制作新疆南疆绒山羊皮肤组织切片,显微镜下观察照相,利用SPSS16.0软件分析南疆绒山羊的毛囊性状参数与生产性状的相关性.[结果]南疆绒山羊皮肤中的毛囊呈现周期性变化规律,初级毛囊较次级毛囊相比周期性活动变化相对不明显;毛囊结构由毛球、外根鞘、内根鞘几大部分组成,各时期的毛囊发育形态不同;次级毛囊密度与产绒量呈显著正相关(P＜0.05);次级毛囊直径与绒细度呈显著正相关(P＜0.05).[结论]南疆绒山羊次级毛囊数量直接影响产绒量,次级毛囊直径直接影响绒细度.     

苏博美利奴羊胎儿皮肤毛囊结构及形态发育研究

【目的】研究苏博美利奴羊毛囊的组织结构与形态发育过程,为解析细毛羊毛囊发育的分子调控机制奠定组织学基础。【方法】采用石蜡切片技术分析胎龄为第65、85、105和135天的苏博美利奴羊胎儿头部、颈侧、颈上缘、鬐甲、背部、体侧、肩甲、腹部、荐部及股部等10个不同部位皮肤的组织学特性。【结果】苏博美利奴羊毛囊结构同其它动物一样,由毛球、连接组织鞘、外根鞘、内根鞘和毛干等几部分组成。在胎龄65d时初级毛囊(primary follicles, PF)已经发生形成毛芽,毛芽延长,继续向真皮层深入,形成柱状结构,通过由大量真皮细胞在末端聚集,形成帽子结构,各部位表皮均形成完整的结构。胎龄85d时毛囊上部形成一个膨大部,在毛乳头上方形成锥形结构,毛球基本形成,毛乳头长度明显大于宽度;在初级毛囊基底部可见次级毛囊（secondary follicles ,SF）的囊泡结构,并形成皮脂腺原始细胞。在胎龄105d时次级毛囊大量形成,伴随着初级毛囊毛芽伸长,次级毛囊毛芽向真皮层深入,毛乳头直径逐渐增大,皮脂腺开始形成;原始次级毛囊颈部隆突部开始再分化出再分化次级毛囊(secondary-derived follicles ,SD),并可见汗腺,毛管发育完整;已形成完整的毛囊群结构,主要为三元毛囊群,每个毛囊群由1—3个初级毛囊和围绕其周围的几个次级毛囊组成。胎龄135d时大量形成再分化次级毛囊,形成成熟的汗腺,大部分初级毛囊和部分次级毛囊发育成熟,毛囊形成角质化毛干并穿出体表。【结论】苏博美利奴羊胚胎皮肤初级毛囊约50—55d开始形成;胎龄65—75d是初级毛囊形成的重要时期;胎龄80—85d是次级毛囊形成期,此时期,初级毛囊大量形成;胎龄105—135d是次级毛囊大量再分化,再分化次级毛囊形成及发育的关键时期。为了解苏博美利奴羊毛囊的结构及毛囊从发生到发育成熟的形态变化过程,为相关领域研究提供参考依据。     

内蒙古阿尔巴斯绒山羊毛囊结构及形态发生过程研究

 【目的】了解绒山羊毛囊的组织结构及毛囊形态发生变化过程，为研究绒山羊绒毛发育的分子调控机理奠定组织学基础。【方法】制作内蒙古阿尔巴斯绒山羊胚胎皮肤组织切片，显微镜下观察照相。【结果】绒山羊的毛囊结构同其它动物一样，由毛球、连接组织鞘、外根鞘、内根鞘和毛干几部分组成。在胎龄55～65 d毛囊开始发生形成毛芽；胎龄135 d，大多数初级毛囊和一部分次级毛囊发育基本成熟；次级毛囊是初级毛囊的一个分支。【结论】了解了绒山羊毛囊的结构组成及毛囊从发生到发育成熟的整个形态变化过程，为相关领域研究者提供借鉴。     

HGT KAPs基因家族成员在山羊皮肤中的表达

利用经体外合成、用地高辛标记的阿尔巴斯白绒山羊高甘氨酸/酪氨酸角蛋白关联蛋白(HGTKAPs)基因家族9个成员的cRNA探针,通过原位杂交技术在山羊皮肤组织切片上进行定位,探测HGTKAPs基因家族9个成员在内蒙古阿尔巴斯白绒山羊10月份皮肤毛囊中的表达.结果表明:HGTKAPs在兴盛期初级毛囊和次级毛囊的皮质层均有强...     

内蒙古绒山羊次级毛囊组织形态周期性变化研究

【目的】研究成年绒山羊次级毛囊组织形态的周期性变化过程,为研究绒山羊绒毛生长的分子调控机理奠定组织学基础。【方法】制作内蒙古绒山羊1年周期内每个月的皮肤组织切片,染色后显微镜下观察照相。【结果】成年绒山羊次级毛囊形态在一年中呈周期性变化,在兴盛期、退行期和休止期的形态各不相同。从4月份开始,次级毛囊外根鞘细胞向下分裂延伸,开始了毛囊的重建;8～9月份毛囊完成重建,毛囊结构完整;10月份毛球细胞停止分裂,毛乳头萎缩,大量细胞程序化死亡,毛根上移,毛囊进入退行期;12月份毛囊根部上升到皮脂腺附近不再变化;翌年1～3月毛囊的形态基本没有变化。【结论】了解了成年绒山羊次级毛囊1年内形态的周期性变化过程,为绒山羊绒毛相关领域的研究提供一定的借鉴。     

新疆山羊皮肤毛囊结构及周期性发育规律的研究

[目的]探索新疆山羊毛绒性状和皮肤毛囊的发育规律,[方法]分别在3月、6月、9月、12月取毛样和体侧部皮肤,检测毛样绒细度、长度、净绒率。皮肤切片后采用sacpic法染色,观察毛囊的生长发育规律。[结果]新疆山羊绒平均细度约为15.16μm,长度为46.6mm,净绒率为28.8%;毛囊活性、深度、密度均以9月份为最高,3月份最低,说明9月为新疆山羊毛囊的兴盛期,3月份为静止期。[结论]从绒细度、长度来看,新疆山羊属于绒山羊中的优秀品种,而且初、次级毛囊密度高,在后期选育对于提高生产性能具有很大的潜力。     

外源褪黑素诱导下Hippo信号通路调控山羊绒生长mRNA和lncRNA的生物信息学分析

为分析绒山羊皮肤中受Hippo信号通路调控的绒生长候选基因集,本研究选取6只罕山白绒山羊随机分为对照组和褪黑素处理组,每组设3个重复。以自然年为试验周期,每月采集皮肤样本进行RNA测序,使用Bowtie、TopHat、Cufflinks、Cuffmerge、Cuffdiff、Cuffcompare、CPAT和CPC软件分析DE-mRNA和DE-lncRNA,联合PCA分析它们对次级毛囊生长周期的应答,利用WGCNA挖掘调控山羊绒生长的基因模块,GSEA分析候选基因集的生物学功能。结果表明：1)筛选得到组间DE-mRNA 2 024个和DE-lncRNA 329个,它们应答了绒山羊皮肤次级毛囊的生长周期。2)获得有生物学意义的对照组7个和试验组9个基因模块。3)深入分析富集到平衡哺乳动物皮肤生长分化、毛囊形态发生的Hippo信号通路基因模块,揭示了外源褪黑素诱导下调控山羊绒生长候选基因集191个mRNA和49个lncRNA的共表达调控网络关系。4)发现候选基因集与皮肤发育生物学过程(|NES|>1且FDR<25%)、Hippo信号通路(|NES|>1且FDR<25...     

阿尔巴斯白绒山羊毛被生长规律

本试验研究放牧条件下绒山羊绒毛季节性生长变化的规律.选择体重及产绒性能相近的周岁内蒙古阿尔巴斯白绒山羊公、母各5只,对其背部、体侧部和腹部进行染色.每月月初定点采背部、体侧部和腹部的绒、毛,并测量当月生长长度.结果表明:山羊绒、毛生长有一定的规律性,不同部位、不同月份的绒、毛月生长速度不同.绒从每年的7月～8月份开始生...     

辽宁新品系绒山羊Hoxc-13基因的结构和分析

本文论述了在研究辽宁新品系绒山羊皮肤上调控绒细度基因时,通过RT-PCR和RACE方法,在皮肤中获得了Hoxc-13启动子1 367bp。此外,本文描述了Hoxc-13基因的分离和特性,并进行比较分析,在控制毛发角蛋白转录方面,Hoxc-13基因在皮肤中可能还有其他的重要功能。     

不同品系绒山羊皮肤毛囊生长发育周期中chi-miR-107-3p及其相关基因的表达分析

为分析chi-miR-107-3p及相关基因在不同品系绒山羊皮肤毛囊生长发育周期中的表达情况,本研究分别在毛囊休止期(4月)、兴盛前期(7月)、兴盛期(9月)和退行期(1月)采集了阿拉善型绒山羊(季节性长绒)和敏盖绒山羊(常年长绒)体侧皮肤组织,通过组织切片比较分析组织形态,实时荧光定量PCR法检测chi-miR-107-3p及ADCK5、DSBC1、ARSA、FMAP4、RHBDF2和ALDH3A2等6个相关基因表达量。结果表明:1)两种品系的绒山羊毛囊在形态特征上基本一致,但在同一时期生长规律不同;2)chi-miR-107-3p和RHBDF2基因在两种品系绒山羊皮肤毛囊不同发育周期的表达量呈相反趋势。在次级毛囊重建初期,chi-miR-107-3p表达量较高,而RHBDF2基因的表达量极低,随着次级毛囊重建逐步完成,chi-miR-107-3p表达量显著降低,RHBDF2基因的表达量逐渐增高。进入退行期,chi-miR-107-3p的表达量逐渐增高,而RHBDF2基因的表达量逐渐降低,休止期,chi-miR-107-3p的表达量达到最大值,此时RHBDF2基因的表达量最小,推测chi-miR-107-3p可能负向调控RHBDF2基因的表达;3)相关性分析表明,chi-miR-107-3p和RHBDF2基因表达水平均与皮肤毛囊性状显著相关(P<0.05),说明chi-miR-107-3p和RHBDF2基因均为两品系绒山羊皮肤毛囊生长发育的重要影响因子;4)ALDH3A2基因的表达量在皮肤毛囊休止期至兴盛期的过程中逐渐降低,由退行期至休止期的过程中逐渐增高。ALDH3A2基因与皮肤毛囊各性状均显著相关(P<0.05),表明高表达的ALDH3A2可能抑制两品系绒山羊毛囊的生长发育,是调控皮肤毛囊生长发育的重要影响因子,其他基因对绒山羊皮肤组织生长均无影响。本研究证实羊绒生长发育过程离不开miRNA及其相关基因参与调控,为进一步研究毛囊发育分子机理提供了参考,为实际生产中进行羊绒增产提供理论依据。     

绒山羊胎儿期毛囊发生发育关键circRNA的鉴定及功能预测分析

为探究调控绒山羊毛囊发生发育阶段关键circRNA及其功能,基于课题组前期得到的内蒙古绒山羊胎儿期(45、55、65和75 d)皮肤组织circRNA表达谱以及各比对组中差异表达circRNA的基础,根据不同时期毛囊形态发生发育情况筛选了毛囊发生发育相关的circRNA,利用生物信息学分析毛囊发生发育关键circRNA...     

内蒙古绒山羊JAG1生物信息学及表达模式分析

为分析绒山羊JAG1蛋白结构特征,及其在不同毛囊生长期中的表达模式,从阿拉善种羊场选择2周岁、体重相近的3只内蒙古绒山羊母羊,利用生物信息学方法比对绒山羊JAG1氨基酸序列与其他物种的相似性,分析JAG1蛋白质理化性质和结构特征;利用免疫组化和实时荧光定量PCR检测其在内蒙古绒山羊皮肤中的表达部位和表达量。结果表明,绒山羊JAG1氨基酸序列与绵羊相似性可达99.5%,JAG1蛋白信号肽位于第1~29个氨基酸序列,含有一个剪切位点和一个跨膜结构,具有61个丝氨酸、26个苏氨酸、19个酪氨酸磷酸化位点,63个O-糖基化位点,6个N-糖基化位点,属于不稳定亲水蛋白。在毛囊退行期(1月份)和休止期(4月份)未检测到JAG1蛋白的表达;生长前期(7月份)和生长期(9月份)在毛乳头细胞中表达。JAG1 mRNA在内蒙古绒山羊皮肤毛囊的4个时期均有表达,随着毛囊进入生长期JAG1 mRNA表达量逐渐增加,生长期皮肤中的表达量显著高于其他阶段(P<0.05)。综上,绒山羊JAG1氨基酸序列在物种进化过程中比较保守,JAG1 mRNA在内蒙古绒山羊毛囊生长前期和生长期表达升高,为深入研究绒山羊JAG1基因对毛囊发育的调控提供理论依据。     

转K2.9基因绒山羊体细胞核移植技术体系的优化研究

【目的】利用体细胞核移植技术制备转毛角蛋白Ⅱ型中间丝K2.9基因的高绒质绒山羊胚胎,为绒山羊优良品种的培育提供一种全新的技术材料。【方法】以含有Neor 基因标记的K2.9 毛囊特异表达载体pcDNA3.1-K转染绒山羊胎儿成纤维细胞,经G418筛选获得转K2.9基因细胞,将获得的转基因阳性细胞与体外成熟的绒山羊卵母细胞进行核移植,并对生产的重构胚进行了体外培养。本文分别进行了激活方法、供体细胞和卵母细胞来源的筛选,且对获得的囊胚进行了PCR鉴定。【结果】（1）Iono+6-D对成年羊卵母细胞的孤雌激活效果好于A23187+6-D,显著提高了胚胎的卵裂率。（2）羔羊孤雌胚的卵裂率显著低于成年羊,但囊胚率差异不显著。（3）来自2只绒山羊胎儿的转基因成纤维细胞对核移植胚的发育没有显著影响,但2号羊的转基因细胞显著提高了融合率。（4）以羔羊卵进行核移植,显著降低了核移植胚的发育率。（5）对获得的囊胚进行PCR鉴定,成功扩增到目的基因。【结论】将K2.9 毛囊特异表达载体pcDNA3.1-K转染的绒山羊胎儿成纤维细胞作为供体细胞,核移植到成年羊卵母细胞中,以Iono+6-D进行激活,首次成功、高效地获得携带K2.9基因的绒山羊囊胚。