柔嫩艾美耳球虫钙依赖蛋白激酶4酵母双杂交诱饵质粒的构建与检测

为了筛选出柔嫩艾美耳球虫钙依赖蛋白激酶(Et CDPK4)在虫体内发挥作用时的作用受体即相互作用蛋白,构建了能够应用于筛选柔嫩艾美耳球虫子孢子酵母双杂交c DNA文库的诱饵重组质粒p GBKT7-Et CDPK4,本研究以柔嫩艾美耳球虫子孢子为材料,提取了总RNA,经反转录得到c DNA第一链,利用PCR的方法扩增获得了该基因大小为1660 bp的Et CDPK4的功能区片段,并将其连接于酵母BD诱饵p GBKT7载体上,经双酶切鉴定和序列分析,以及检测了p GBKT7-Et CDPK4在酵母双杂交系统中的自激活、细胞毒性和表达情况。结果显示,成功构建了酵母双杂交诱饵重组质粒p GBKT7-Et CDPK4,在酵母双杂交系统中没有自激活活性和细胞毒性,且在酵母细胞Y2HGold中能够进行表达。表明所构建的诱饵质粒p GBKT7-Et CDPK4可以应用于酵母双杂交系统中,用于筛选柔嫩艾美耳球虫子孢子酵母双杂交c DNA文库,获得可能与Et CDPK4具有相互作用的蛋白质。     

牛骨骼肌酵母双杂交cDNA文库构建

为构建应用于酵母双杂交系统的牛骨骼肌cDNA文库,利用Trizol法提取牛骨骼肌总RNA,采用SMART技术PCR扩增合成cDNA第二链片段,并与文库线性载体pGADT7-Rec共转化酵母菌Y187构建酵母双杂交文库。结果显示文库容量达到1．7×10^7cfu／mL,插入片段主要在0．5～3kb范围内,文库重组率为80％。以上结果表明该文库质量好,能够通过筛选文库得到与目的蛋白相互作用的蛋白质。     

利用SMART技术构建猪血管内皮细胞酵母双杂交cDNA文库

本研究旨在建立猪血管内皮细胞酵母双杂交cDNA文库,进而为研究猪瘟病毒的基因功能及致病机理提供良好的试验体系。体外培养猪血管内皮细胞,提取细胞总RNA,并用Oligotex mRNA Mini Kit纯化PolyA+mRNA,利用SMART技术合成双链cDNA(ds cDNA)。经CHROMA SPINTM TE-400Column纯化后的dsDNA与线性化的pGADT7-Rec共转化酵母感受态细胞Y187中,以同源重组的方式在酵母细胞内构建猪血管内皮细胞cDNA文库。结果获得的文库容量在6×106 CFU/mL,随机挑选24个克隆进行PCR检测,插入的片段大小集中在400² 000bp之间,平均插入长度为1 000bp左右,文库重组率为100%。本研究为从文库中高通量地筛选出与猪瘟病毒互作的重组子,即寻找与该病毒相互作用的受体蛋白奠定了坚实的基础。     

牛源犬新孢子虫酵母双杂交cDNA文库的构建及鉴定

旨在构建酵母双杂交牛源犬新孢子虫cDNA表达文库,进而为研究新孢子虫功能结构以及为其入侵宿主致病机理研究提供良好的试验体系。体外培养牛源犬新孢子虫延边株,纯化并提取虫体总RNA,应用SMART技术合成双链cDNA(ds cDNA)。利用CHROMA SPINT+TE-400Columns纯化柱纯化ds cDNA,并与线性化的p GADT7-Rec共转化酵母菌菌株Y187,以同源重组的方式在酵母细胞内构建牛源犬新孢子虫酵母双杂交cDNA表达文库。结果显示,文库容量为5.78×108cfu/m L,随机挑取23个单克隆进行菌落PCR检测,插入的双链c DNA片段大小为400~4 000 bp,平均长度在2 000 bp左右,文库重组率为100%,此文库可用于酵母双杂交筛选。试验为筛选新孢子虫与宿主之间相互作用蛋白研究奠定了基础。     

绵羊卵巢组织细胞酵母双杂交cDNA文库的构建及鉴定

试验旨在构建绵羊卵巢组织细胞的cDNA文库,为进一步研究绵羊卵巢中蛋白互作机制提供工具。本研究以不同发情周期的绵羊卵巢组织为材料,利用TRIzol试剂提取绵羊卵巢组织细胞总RNA,应用SMART技术经过长链PCR(LD-PCR)合成双链cDNA(ds cDNA),通过CHROMA SPIN~(TM)+TE-400柱纯化得到ds cDNA,并与线性pGADT7-Rec共转化酵母Y187感受态细胞。用同源重组的方式,在酵母细胞内构建绵羊卵巢组织细胞酵母双杂交cDNA表达文库。结果构建了含有3×10~8个重组子的绵羊卵巢组织cDNA文库,插入片段长度多数为500～2 000 bp,重组率达96%,重组子中平均插入的片段长度为1 000 bp,文库滴度为2×10~7cfu/mL,符合建库标准。     

柔嫩艾美耳球虫裂殖子全长cDNA文库的构建及应用

为克隆柔嫩艾美耳球虫裂殖子阶段的功能基因的全长序列,利用SMART技术,采用Clontech公司的Creator TMSMARTTMcDNA Library Construction Kit构建了鸡球虫裂殖子的全长cDNA文库。用试剂盒提取mRNA后,以cDNA合成试剂盒合成cDNA。连接至pDNR-LIB载体,用电转化法将重组质粒转化到E.coli DH10B内得到原始文库,扩增后保存于-80℃冰箱内;最后以文库为模板,分别以研究室已成功克隆序列(EtSAG2、EtMIC-2、EtMCAT)及Sanger的部分EST序列(Contig1218)设计引物,进行PCR扩增并测序检验文库的实用性。经测定,构建的初级cDNA文库约含有8.72×107个重组子,插入的片段多在1kb～3kb之间,平均插入片段长度约1.8kb,扩增后文库保存的滴度为2.4×104 cfu/mL;通过文库的PCR扩增,不仅可以成功扩增出研究室已成功克隆的序列(EtSAG2、EtMIC-2),并成功获得EtMCAT和EST序列(Contig1218)的全长cDNA序列,经比对分析Contig1218所编码的蛋白为组织蛋白酶B样半胱氨酸蛋白酶(Cathepsin B)。结果表明,已成功构建了柔嫩艾美耳球虫裂殖子高质量的全长cDNA文库,从而为筛选鸡球虫的功能基因全长序列奠定了基础。     

柔嫩艾美耳球虫子孢子cDNA表达文库的构建

在无RNase污染的环境下,提取柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)子孢子RNA,进而纯化mRNA,采用Oligo(dT)引物反转录合成cDNA第一链和第二链,并在其两端加EcoRⅠ/HindⅢ定向接头。将所产生的cDNA分子定向克隆到具有EcoRⅠ/HindⅢ黏性末端的λSCREEN载体的两臂之间。用Phage Maker extract对以上连接产物进行体外包装,形成完整的噬菌体,并用该噬菌体转染大肠杆菌ER1647,进行文库容量测定和扩增。以扩增文库的DNA为模板,利用已知基因引物克隆E. tenella3-1E基因,并进行测序。结果表明,成功构建了E. tenella孢子化卵囊子孢子的cDNA文库,文库原始库容量约为4×106pfu/mL,插入片段约100~3000 bp,扩增得到特定的E. tenella3-1E基因,说明文库质量高、代表性强,为进一步从文库中筛选相关基因提供了有效的工具。     

毒害艾美耳球虫第二代裂殖子cDNA文库的构建

本文采用Trizol试剂提取毒害艾美耳球虫第二代裂殖子总RNA,用oliogo(d T)磁珠法纯化m RNA后,采用SMART技术构建了毒害艾美耳球虫第二代裂殖子cDNA噬菌体表达文库。经鉴定,原始文库容量为2.14×106pfu/m L,扩增后的文库容量为4.47×1010pfu/m L,扩增文库的重组率为90%。随机挑取100个单克隆,通过菌液PCR检测得知文库插入片段长度以400~1000 bp为主。本研究结果为毒害艾美耳球虫新基因的筛选和功能研究奠定了基础。     

柔嫩艾美耳球虫顶膜抗原-1潜在子孢子互作蛋白的筛选

为了筛选与柔嫩艾美耳球虫顶膜抗原-1(Eimeria tenella apical membrance antigen 1,EtAMA1)存在互作的子孢子蛋白,以柔嫩艾美耳球虫子孢子c DNA为模板,PCR扩增EtAMA1基因胞外区,将扩增产物与p GEX-6P-1连接,构建原核表达质粒p GEX-6P-1-EtAMA1,表达、纯化重组蛋白EtAMA1-GST。纯化的重组蛋白经Western blot验证,结果显示在75 k Da处有单一的目的条带,证实了所获得的蛋白为EtAMA1-GST融合蛋白。将EtAMA1-GST蛋白、GST蛋白和PBS分别与谷胱甘肽琼脂糖珠孵育后,再分别与子孢子裂解物共孵育,洗脱液经SDS-PAGE分析后,结果显示三者之间的条带明显不同。将差异条带切下进行质谱分析,对获得的蛋白质肽段与Uniprot中鸡球虫蛋白质数据库进行Blast比对,初步获得了10个与EtAMA1存在潜在互作的柔嫩艾美耳球虫子孢子蛋白,包括微线体蛋白、糖酵解酶类、肌动蛋白相关因子以及一些保守蛋白等,他们广泛参与了虫体的入侵、发育、能量代谢等生物学过程。研究结果为进一步阐明EtAMA1在球虫入侵宿主细胞中发挥重要作用的分子机制奠定了基础。     

宿主GAPDH对柔嫩艾美耳球虫子孢子入侵细胞的影响

目前,关于宿主细胞应对球虫感染机制的研究极其有限。在前期研究中,我们利用相对和绝对定量同位素标记技术结合液相色谱串联质谱技术分析了感染柔嫩艾美耳球虫子孢子72 h后鸡胚成纤维(CEF)细胞的蛋白质组表达变化,作者拟进一步研究其中一个上调蛋白——甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)对柔嫩艾美耳球虫子孢子入侵细胞的影响。克隆鸡GAPDH基因并构建原核重组质粒pGEX-4T-1-GAPDH,表达重组GAPDH蛋白,用Western blot对表达进行验证。使用q-PCR、Western blot和免疫组织化学的方法检测感染柔嫩艾美耳球虫子孢子后DF-1细胞中GAPDH的表达量,并使用抗体抑制试验检测GAPDH多克隆抗体对柔嫩艾美耳球虫子孢子入侵细胞的影响。结果显示:成功克隆1 123 bp的GAPDH基因,并获得61.7 ku的重组GAPDH蛋白。q-PCR和免疫组织化学检测均显示,GAPDH在柔嫩艾美耳球虫子孢子感染的DF-1细胞中的表达显著升高。抗体抑制试验表明,与相同浓度的正常兔IgG相比,50、100、200、300和400μg·mL~(-1)的抗GAPDH抗体均能明显抑制子孢子的入侵。以上结果表明,子孢子感染会引起宿主细胞GAPDH蛋白的上调,并且宿主GAPDH蛋白在子孢子入侵过程中起正调控作用。     

猪肺泡巨噬细胞酵母双杂交cDNA文库的构建与鉴定

为研究猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)与猪肺泡巨噬细胞(porcine alveolar macrophages,PAM)蛋白质间相互的作用,本研究使用SMART技术成功构建了猪肺泡巨噬细胞酵母双杂交cDNA文库。首先提取PAM总RNA,使用SMART RACE法经LD PCR合成双链cDNA,运用SMART技术,通过同源重组的方法将双链cDNA与pGADT7-Rec质粒共转化进酵母Y187感受态,再利用营养缺陷的方法在SD/-Leu平板上筛选阳性克隆,最终构建的文库滴度达到了6.96×10~7 CFU/mL,重组率初步计算达到95%,插入片段范围在200~2 000bp。本研究为PRRSV致病蛋白的筛选以及相关疾病的研究奠定了基础。     

柔嫩艾美耳球虫子孢子的变化

纯化的柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊，经消毒，水洗处理后放入玛瑙乳钵内研磨。研磨后的卵下混入适量消化液，在４０℃恒温水浴消化３０分钟即成为球虫子孢子粗提液。此粗提液经ＤＥ５２纤维素层析柱过滤，用甘氨酸洗脱液冲洗，收集滤液经离心沉淀即得纯化的柔嫩艾美耳球虫子孢子。     

鸡柔嫩艾美耳球虫HAP2基因的克隆与生物信息学分析

为研究鸡柔嫩艾美耳球虫HAP2(Hapless2/generative cell-specific)基因的抗原性,根据GenBank发表的HAP2基因的cDNA序列ORF设计一对引物,用RT-PCR方法从柔嫩艾美耳球虫配子体总RNA中扩增HAP2基因,将扩增产物与pMD18-T载体连接后进行测序和序列分析,同时应用生物信息学软件对HAP2基因表达蛋白的结构域和在柔嫩艾美耳球虫生活史的各阶段表达情况进行预测。结果获得867 bp的目的基因扩增片段,经同源性分析比较柔嫩艾美耳球虫HAP2基因与其他艾美耳球虫种HAP2基因同源性在70%以上,该基因所表达的蛋白主要在球虫配子生殖阶段的配子体和未孢子化的卵囊中表达。说明HAP2基因具有作为传播阻断疫苗的候选抗原的可行性。     

堆形艾美耳球虫巨噬细胞移动抑制因子的克隆和表达

本研究扩增和克隆了堆形艾美耳球虫巨噬细胞移动抑制因子,并在大肠杆菌中表达出MIF重组蛋白。根据GenBank中的MIF mRNA序列,设计特异引物,采用PCR方法以堆形艾美耳球虫孢子化卵囊cDNA文库为模板扩增获得MIF基因,将MIF基因片段连接到原核表达载体pET-28a（＋）,构建重组表达质粒pET28a—MIF,并在大肠杆菌BL21（DE3）中诱导表达,对表达产物进行Western blot分析。结果从堆形艾美耳球虫孢子化卵囊cDNA文库中扩增出MIF基因片段,长度为709bp;经序列分析,扩增片段的核苷酸序列与GenBank中登录的MIF序列的同源性为99．5％;经SDS-PAGE检测表明重组质粒pET（28a）-MIF在大肠杆菌中以包涵体形式表达;Western blot分析证明堆形艾美耳球虫抗血清可与重组表达蛋白特异性结合。本研究结果为进一步研究该基因的功能奠定了基础。     

酵母双杂交随机肽库的设计及构建

构建一个含16个氨基酸的酵母双杂交随机肽库,设计合成编码16肽的随机DNA片段,PCR扩增随机DNA片段,经限制性内切酶BamHI和EcoRI酶切后克隆入酵母表达质粒pGADT7GH,构建酵母双杂交随机肽库质粒pGADT7GH-RP并检验其库容。结果表明,扩增获得编码16肽的随机DNA片段,并成功将随机DNA片段克隆入酵母表达质粒pGADT7GH,与GAL4AD形成融合蛋白,其库容为1.28×107。从而成功地构建了酵母双杂交随机肽库。     

不同发育期两种艾美耳球虫在鸡消化道内的分布

对柔嫩艾美耳球虫Eimeria teenlla和巨型艾美耳球虫Eimeria maxima的卵囊、孢子囊和子孢子在鸡消化道和粪便中的分布情况进行了研究。口服接种柔嫩艾美耳球虫卵囊第1小时后,盲肠内孢子囊数为3.4×10~8、以后则逐渐减少;而子孢子数增加且直到接种后第12小时仍保持一个高水平。其它肠段只有少量的孢子囊和子孢子。在接种巨型艾美耳球虫卵囊后的第2小时,主要在空肠内发现有大量的子孢子。研究发现,柔嫩艾美耳球虫和巨型艾美耳球虫的绝大多数子孢子分别寄居在盲肠和空肠内,表明每种球虫子孢子侵袭部位的特异性在侵袭发生前就确定了。     

梨酵母双杂交cDNA文库的构建与鉴定

酵母双杂交是检测蛋白质之间相互作用的有效手段。构建梨酵母双杂交cDNA文库，能为利用酵母双杂交技术探究梨基因功能的互作机制提供技术支撑。本研究以沙梨主栽品种‘圆黄’梨的叶片和果肉为材料，采用Trizol法提取其RNA，利用SMART技术经LD-PCR合成全长cDNA，通过同源重组法与pGADT7载体连接，再电转化至大肠杆菌菌株。经检测，构建的cDNA文库滴度为1.76×108 cfu/mL，文库片段插入阳性率为100%，片段长度主要分布在600~1500 bp。该研究结果表明，构建的cDNA文库质量较高，完整性较好，能为后续利用酵母双杂交技术鉴定基因的互作蛋白奠定基础。     

3种兔球虫ITS-1序列测定与系统发育分析

从河北省兔场分别单卵囊分离孢子化大型艾美耳球虫卵囊、黄艾美耳球虫卵囊及肠艾美耳球虫卵囊,接种无球虫兔后获得纯种卵囊,CTAB法提取孢子化卵囊基因组DNA。利用艾美耳属球虫18SrDNA和5．8SrDNA保守引物,PCR扩增3种兔球虫ITS-1片段,产物纯化后测序。将3种球虫ITS-1测序结果与GenBank发布的兔球虫ITS-1序列进行比对和遗传距离比较,绘制系统发育树。结果表明,大型艾美耳球虫、黄艾美耳球虫及肠艾美耳球虫河北株分别扩增出424、455、434bp的ITS-1片段。大型艾美耳球虫、黄艾美耳球虫及肠艾关耳球虫河北株与GenBank中发布的同种兔球虫ITS-1序列相似性分别为97．4％、97．9％和96．9％。系统发育树显示兔球虫ITS-1序列形成1个单系群,该单系群根据寄生部位分为2个姊妹群。     

猪外周血单个核细胞cDNA酵母表达文库的构建及与猪瘟病毒E2蛋白相互作用细胞蛋白的筛选

为研究猪瘟病-毒(CSFV)蛋白与宿主细胞蛋白之间的相互作用,本研究通过SMART技术合成猪外周血单个核细胞(PBMC)双链cDNA,以携带与载体pGADT7-Rec重组位点同源序列的特异引物经long-distance PCR扩增双链cDNA.纯化双链cDNA并与载体pGADT7-Rec共转化酵母菌株Y187,经同源重组构建PBMC cDNA酵母表达文库.以CSFV E2蛋白为诱饵进行酵母双杂交筛选,得到阳性克隆根据序列比对分析结果,进一步进行共转化验证.结果显示筛选到17个与CSFV E2蛋白相互作用的宿主细胞蛋白,基因注释(GO)分析表明这些蛋白分别参与免疫、代谢、细胞生长与增殖、生物调节等过程,为研究它们与CSFV E2的相互作用奠定了基础.     

紫茎泽兰处理鸡柔嫩艾美耳球虫后差异基因筛选和分析

为获得紫茎泽兰处理鸡柔嫩艾美耳球虫后差异基因,将0.5%紫茎泽兰提取液作用于鸡柔嫩艾美耳球虫卵囊孢子化过程,采用抑制消减杂交技术(SSH)筛选处理后卵囊的差异表达基因,通过GO和COG功能预测分析,并采用实时荧光定量PCR验证差异表达的基因。结果显示,采用SSH成功构建了紫茎泽兰处理前后鸡柔嫩艾美耳球虫卵囊的cDNA消减文库,获得86条ESTs序列,经拼接和聚类后得到31条独立基因(Unigenes),其中有23个基因有功能注释,8个基因没有功能注释,另外有4个基因没有同源性匹配。为进一步验证文库的特异性,从中随机选取3个差异表达基因,运用实时荧光定量PCR技术验证表面抗原13、3-羟酰辅酶A脱氢酶和细胞色素P450基因在紫茎泽兰处理前后的表达差异,结果显示,3个基因在经紫茎泽兰处理的鸡球虫孢子化卵囊中的表达量明显低于未处理组,说明紫茎泽兰对柔嫩艾美耳球虫卵囊具有一定的活性抑制作用。本试验获取了紫茎泽兰作用柔嫩艾美耳球虫卵囊的主要调控基因,为将紫茎泽兰研发成环境杀虫剂奠定了良好的理论基础,也可为球虫致弱疫苗或基因缺失疫苗的靶标筛选研究提供参考。