草鱼呼肠孤病毒VP7基因核酸疫苗的构建及免疫效果

将草鱼呼肠孤病毒( GCRV)外衣壳蛋白VP7双基因(约0.9 kb)及团头鲂的β-肌动蛋白启动子(约0.56 kp)经扩增并鉴定正确后,克隆至基因转移载体pFastBacTM Dual中,获得重组质粒pFastBac-β-VP71 -VP72,以此研究草鱼免疫实验及免疫效果.重组质粒按10、30、60μg分为3组,同时设30 μg空载体组及对照组.于免疫后第14、21、28、49天通过RT-PCR检测VP7的转录水平、间接凝集反应测定抗体水平及攻毒试验检测免疫保护效果.结果显示,pFastBac-β-VP71 -VP72导入鱼体后,VP7基因在β-肌动蛋白启动子的驱动下持续表达,至第49天仍能检测到目的基因的转录;各免疫组均有抗体产生,抗体效价在免疫后第21天达到最高,攻毒后10、30、60 μg核酸疫苗免疫组死亡率分别为0％、0％、5％,而空载体组和对照组分别为30％和100％,表明pFastBac-β-VP71-VP72作为核酸疫苗对草鱼病毒性出血病有较好的免疫保护效果.研究结果为草鱼呼肠孤病毒核酸疫苗的研发与生产应用奠定了基础.     

草鱼出血病病毒vp6核酸疫苗的免疫效果评估

为了评估草鱼出血病病毒(GCRV)vp6基因核酸疫苗的免疫效果,将vp6基因克隆进pFastBacTMDual载体杆状病毒的多角体蛋白(Ph)启动子下游,同时将团头鲂(Megalobrama amblycephala)β-actin启动子控制的vp6基因克隆进杆状病毒的P10启动子下游,获核酸疫苗载体pFastBac-FA-VP6-ph-VP6。按每尾分别注射疫苗载体10、30、60μg的剂量免疫草鱼(Ctenopharyngodon idellus)(体长14～20 cm,体质量60～120 g),同设pFastBacTMDual载体(30μg/尾)阴性对照组及空白对照组(0.4 mL/尾无菌水)。于免疫后不同时间通过RT-PCR检测免疫鱼体中vp6基因的表达,并于免疫后第14、21、28、49、70天分别通过间接凝集反应检测血液中的抗体水平,并在免疫第21天感染GCRV评估免疫保护效果。结果显示,核酸疫苗免疫草鱼后,各免疫组均有抗体产生,抗体效价在免疫后第28天达到最高;攻毒后每尾注射疫苗载体10、30、60μg组的死亡率分别为0%、0%、5%,pFastBacTMDual载体对照组和空白对照组分别为30%和100%。表明构建的核酸疫苗对草鱼病毒性出血病有较好的免疫保护效果。     

草鱼出血病病毒VP6蛋白的原核表达、纯化及免疫效果

为了探讨草鱼出血病病毒(GCRV)VP6亚单位疫苗对草鱼出血病的免疫保护作用,将vp6基因克隆进原核表达载体pET-28a(+),构建了重组质粒pET28a(+)-VP6。SDS-PAGE和Western-blotting显示,重组VP6蛋白的分子量约为43 ku,主要以包涵体形式存在,重组蛋白占菌体总蛋白的20%左右;Ni2+柱纯化后的重组蛋白,以每尾500μg肌肉注射免疫草鱼(14～20 cm,60～120 g),并在第14、21、28、49、70天通过间接凝集反应检测抗体水平,结果显示,免疫注射后第14天可检测到鱼体产生的特异性抗体,第21天达到最高峰,第70天仍可检测到抗体的存在;免疫注射第21天人工接种GCRV,免疫后的草鱼对出血病的保护力达100%。     

鳜传染性脾肾坏死病毒重组主衣壳蛋白免疫效果的初步验证

将大肠杆菌重组表达的鳜(Siniperca chuatsi)传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)主衣壳蛋白(MCP),以不同剂量(20μg,尾、50μg/尾、100μg/尾)腹腔注射免疫幼鳜(2月龄),测定各免疫组的血清抗体效价变化规律、头肾淋巴细胞增殖刺激指数(SI)、肝脏Mx蛋白表达及相对免疫保护率(RPS).结果表明,各免疫组抗体效价在第14天时达到峰值,其中50 ug/尾免疫组的抗体效价最高,随后各组的效价均下降,至第35天时与对照组无差异;头肾淋巴细胞经LPS、ConA刺激后,50 μg/尾免疫组及100 μg/尾免疫组的刺激指数均升高,其中50 μg/尾免疫组的刺激指数最高,20μg/尾免疫组与对照组无差异;在免疫后48 h各剂量免疫组Mx蛋白均有低量表达,对照组无表达,各免疫组表达量无显著差异;免疫后第36天攻毒,50μg/尾免疫组的相对保护率最高,为64.3%.研究结果表明,重组MCP蛋白有较好的免疫原性,可以激发鳜特异性免疫及非特异性免疫应答,当免疫剂量为50μg/尾时,免疫保护效果最好.     

鱼源植物乳杆菌表达IPNV VP2-VP3重组蛋白及其口服免疫程序

为比较鱼源乳酸菌表达系统口服疫苗在不同免疫程序下诱导鱼免疫应答水平的差异,确定鱼源乳酸菌表达系统口服免疫虹鳟幼鱼的免疫程序。本研究构建了重组表达IPNV VP2-VP3蛋白的鱼源植物乳杆菌L1212,将重组菌pPG612-VP2-VP3/L1212包裹颗粒饲料,口服免疫虹鳟幼鱼。免疫程序分为连续免疫组、免疫1 d后间隔1 d再免疫1 d组、连续免疫4 d后32 d加强免疫1次组和间隔免疫后32 d加强免疫1次组。免疫后进行尾动脉采血,间接ELISA方法检测各组血清抗体效价,免疫接种66 d后,腹腔注射IPNV,计算各组相对免疫保护率。确定颗粒饲料按照1 mL/g比例与108 CFU/mL重组菌pPG612-VP2-VP3/L1212和2.5%海藻酸钠混合,于20℃烘干制备口服疫苗。间隔免疫组血清抗体效价和攻毒保护率均显著高于其他组,并且免疫2次的间隔免疫组的血清抗体效价和攻毒保护率均显著高于免疫1次间隔免疫组。采用重组菌包被颗粒饲料饲喂虹鳟幼鱼,间隔免疫的免疫程序和免疫保护率优于连续免疫的免疫程序,对IPNV的入侵起到保护作用。     

入冬应抓好草鱼浸泡免疫

我校渔场1985年由于没有进行草鱼出血病免疫,尽管采取了多种防病措施,但草鱼成活率不高,一般年徘徊在20～30％。 1986年开始搞疫苗注射,草鱼出血病大大减少,成活率提高到70％左右。但人工注射疫苗、费工费时、操作麻烦。且注射疫苗后,部分鱼由于受伤而陆续死亡者常发生     

特异化饵料免疫预防草鱼出血病的生产性试验

草鱼出血病是一种病毒性鱼病，它严重影响着草鱼的成活率，尤其是对一龄草鱼种的危害。目前比较有效的防治方法是将出血病疫苗注射到鱼体使其获得后天的免疫保护力，但这种注射法需要一尾一尾地进行，费工费时还易损伤鱼体，对当年草鱼和大规模的鱼种生产难以应用。因此，研究更简便、有效的免疫途径是预防草鱼出血病迫切需要解决的课题。我们于１９９６～１９９８年用草鱼出血病细胞疫苗处理的特异化饵料，在草鱼苗开口期投喂，完成疫苗接种。经室内攻毒测定，对草鱼出血病的免疫保护力可达９０％以上，免疫后的草鱼血清抗体凝集价显著高于…     

鱼用哈维氏弧菌亚单位缓释微球口服疫苗的免疫效果初探

通过复乳化-溶剂挥发技术,采用生物可降解性高分子材料聚-DL-乳酸-聚乙二醇共聚物(PELA)包裹哈维氏弧菌(Vibrio harveyi,Vh)重组外膜蛋白OmpK,制成缓释微球颗粒疫苗,口服免疫鲫鱼,测定其血清的凝集效价和相对免疫保护率.结果表明,制备的缓释微球疫苗直径＜10μm,且以粒径＜5μm的微球居多;微球中重组外膜蛋白OmpK包裹率达78.3%.鲫鱼口服微球疫苗2周后,血清抗体水平持续上升,第5周血清凝集抗体效价可达到与佐剂注射组相当的水平(28),抗体高峰期比注射组长1～2周,且降低较慢;免疫4周后用活菌攻击,口服组具有69.4%的相对免疫保护率,而对照组死亡率高达98%.结论为采用可生物降解的缓释微球作为鱼类亚单位口服疫苗的载体系统是可行的.     

传染性造血器官坏死病核酸疫苗的构建及其抗性基因对环境细菌抗性的影响

本研究以传染性造血器官坏死病毒(infectious hematopoietic necrosis virus,IHNV)分离株XJ-13为研究对象,克隆其糖蛋白(glycoprotein,G)基因并连接到商业化载体pcDNA3.1(+),成功构建了真核表达载体pIHNxj-G。为了检测该载体作为核酸疫苗的可能性,本研究以2μg/尾的剂量采用背鳍基部注射免疫虹鳟(Oncorhynchus mykiss)鱼苗[(5±0.5)g]。在免疫后第4天及第30天,以100 TCID_(50)的剂量利用IHNV-XJ-13对虹鳟进行腹腔注射攻毒;在免疫后第4天及第7天,利用Real-time PCR技术检测虹鳟头肾及接种部位肌肉组织Mx-1基因表达情况;在免疫后第4天及30天检测虹鳟血清IHNV中和抗体效价;在免疫后65 d内,分别于不同时间点采集循环水池里的粪便、水以及虹鳟的肠内容物,进行氨苄青霉素抗性菌的分离鉴定。攻毒试验结果显示,核酸疫苗在免疫后第4天和第30天的相对保护率均高于90%;Mx-1基因检测结果显示,Mx-1基因在头肾和接种部位肌肉中均显著上调表达;中和抗体效价测定结果显示,在免疫后第4天,所有血清中均不存在中和抗体(效价均20);而在免疫后第30天,10尾虹鳟中有8尾血清中存在中和抗体,最高效价为160;抗性菌分离结果显示,分离到的氨苄青霉素抗性菌均是天然具有氨苄青霉素抗性的气单胞菌(Aeromonas sp.)和柠檬酸杆菌(Citrobacter sp.),并未分离到包括大肠杆菌在内的任何具有氨苄青霉素抗性的指示菌,且实验组和对照组的氨苄青霉素抗性菌的种类和数量均没有发生统计学意义的改变。本研究提供了具有良好保护效果的IHN核酸疫苗,并为IHN核酸疫苗的安全评价提供了基础数据。     

草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型VP6蛋白多克隆抗体制备及其特异性分析

为了制备高效的草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型VP6蛋白多克隆抗体并对其特异性进行鉴定,实验以草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型HZ08株为模板,采用PCR方法扩增S9基因,将该S9基因与p ET-32a(+)载体连接构建p ET-32a-S9原核表达载体,转化到大肠杆菌BL21(DE3)后用IPTG诱导表达;纯化后的重组VP6蛋白免疫新西兰兔,制备多克隆抗体,使用间接ELISA方法测定抗体效价,Western blot和IFA试验鉴定抗VP6蛋白多克隆抗体特异性。结果显示草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型的S9基因在原核表达载体中能够正确地表达VP6蛋白,纯化的重组蛋白免疫新西兰兔制备的抗VP6多克隆抗体,经间接ELISA方法测定其效价约为1∶105,Western blot和IFA试验结果显示制备的多克隆抗体能特异性识别GCRVⅡ型毒株,而不能识别GCRV I型、Ⅲ型以及其它病毒,表明该多克隆抗体具有较高的特异性。研究表明制备的抗VP6蛋白多克隆抗体能够特异性识别GCRVⅡ型病毒,为GCRVⅡ型病原学研究及草鱼出血病临床诊断奠定基础。     

基因Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒病毒样颗粒的构建与鉴定

为研究II型草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus, GCRV)病毒样颗粒(viruses-like particles, VLPs)疫苗,本试验利用杆状病毒-昆虫细胞表达系统(baculovirus expression vector system, BEVS)将编码VP35蛋白的GCRV-S11基因克隆入杆状病毒载体pFastBacHTA^TM,然后将鉴定正确的重组质粒转化至DH10Bac感受态细胞,筛选得到重组穿梭质粒Bacmid-VP35。将穿梭质粒Bacmid-VP35以及实验室前期构建的重组穿梭质粒Bacmid-VP3、Bacmid-VP4分别转染sf9昆虫细胞获得重组杆状病毒pFHB-VP35、pFHB-VP3以及pFHB-VP4。利用Bac-PAK快速滴定试剂盒测定重组杆状病毒滴度,并通过间接免疫荧光(IFA)和Western Blot鉴定重组蛋白的表达情况。结果显示,本试验获得了较高滴度的重组杆状病毒,并且重组蛋白在杆状病毒感染的sf9昆虫细胞中正确表达。将成功表达的重组杆状病毒pFHB-VP35、pFHB-VP3以及pFHB-VP4共感染sf9细胞组装GCRV-VLPs,通过透射电镜(EM)进行检测。结果显示,GCRV的3个蛋白在sf9昆虫细胞中可以完成自我组装,形成与天然病毒结构形似的VLPs,直径大小为65-72nm。本试验结果为进一步研制安全、高效的GCRV-VLPs疫苗奠定基础。     

芽孢杆菌对草鱼养殖水质的影响

为研究芽孢杆菌对草鱼养殖水质的影响,选取体重约45g的草鱼210尾,随机分为2组,每组设3个平行重复.对照组在水中不添加任何菌,处理组每隔7d分别向水中按照1×108 cfu/m3添加芽孢杆菌菌粉,二组均饲喂基础日粮.草鱼养殖水体水质测定结果表明:与对照组相比,第28天处理组氨氮含量比对照组下降29.17％(P＜0.05).亚硝酸盐氮含量无显著性差异且在0.39 mg/L以下.第14天时,处理组硝酸盐氮含量比对照组降低60.26％( P＜0.01),在第21天和第28天分别比对照组提高26.98％(P＜0.05)和67.85％(P＜0.01).处理组的总无机氮含量在21d内无显著差异,第28天时下降了15.39％(P＞0.05).养殖水体pH值维持在6.8～7.6,各组之间无显著差异.养殖水体中添加芽孢杆菌可降低氨氮含量,改善养殖水体水质.     

固相萃取-气相色谱-质谱联用法测定水产品中邻苯二甲酸酯的残留量

建立了测定水产品中常见的6种邻苯二甲酸酯类化合物（ PAEs）的气相色谱-质谱（GC-MS）分析方法。样品经环己烷：乙酸乙酯（V/V,1∶1）混合溶液超声提取,用乙腈饱和的正己烷除脂,再用正己烷饱和的乙腈反提,过PAE30006-C固相萃取小柱净化,用1%乙酸乙酯的正己烷淋洗,再用正己烷：乙酸乙酯（V/V,1∶1）混合溶液洗脱,洗脱液浓缩后,正己烷定容,供GC-MS测定。结果显示：6种邻苯二甲酸酯类化合物（ PAEs）在10-5000 ng/mL的线性范围内,相关系数在0．9992-0．9998,线性良好,检出限（ LOD ）在0．62-2．96μg/kg,定量限（ LOQ）在2．0-9．0μg/kg。选择罗非鱼样品为测试对象,按照10μg/kg、50μg/kg和100μg/kg 的添加量做加标回收试验,平均回收率在70．5%-105．4%之间,相对标准偏差在3．78%-7．57%之间;选用南美白对虾、草鱼、锯缘青蟹、大黄鱼和牡蛎样品对此方法进行验证,在添加浓度为50 ug/kg的水平上进行加标回收实验,6种PAEs的平均加标回收率在71．5%-102．5%之间,相对标准偏差在3．25%-7．86%之间。该方法提取效率高,净化效果好,可操作性强,符合水产品中药物残留检测的要求。     

草鱼干扰素3蛋白多克隆抗体制备及其应用

为探讨干扰素3(Interferon 3,IFN3)在抗病毒免疫应答中的作用,以草鱼(Ctenopharyngodon idella)巨噬细胞cDNA为模板,PCR扩增IFN3成熟肽基因序列,制备草鱼IFN3蛋白的多克隆抗体,同时研究了IFN3在草鱼不同免疫组织中的蛋白表达,以及草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus,GCRV)感染草鱼肾细胞系(Ctenopharyngodon idella kidney,CIK)后不同时间点的表达。结果显示,细菌表达的重组IFN3大小约为45 kD,主要以包涵体形式存在;抗体效价约为1∶3 200,制备的多克隆抗体既能识别原核表达的重组蛋白,也能识别个体水平上和细胞水平上的内源蛋白。草鱼主要免疫组织中,肝胰腺和皮肤检测到相应条带。CIK细胞感染病毒后12 h开始检测到IFN3蛋白,随感染时间的延长,IFN3蛋白表达量有所增加。蛋白水平上检测IFN3的表达,为深入研究草鱼的抗病毒免疫机制奠定了基础。     

气相色谱-质谱法测定水产品中氟胺氰菊酯残留量

本文建立了水产品中氟胺氰菊酯残留量的气相色谱-质谱测定方法。样品经正己烷-丙酮（体积比2：1）超声提取、冷冻除脂、中性氧化铝固相萃取柱净化后,用气相色谱-质谱法进行测定和确认,外标法定量。在优化实验条件下,氟胺氰菊酯在10．0～400．0μg·L^-1范围内线性关系良好,相关系数为0．9999,检出限为2．0μg·kg^-1,定量限为4．0μg·kg^-1。在4．0、8．0和40．0μg·kg^-1加标水平下,鲤（Cyprinus carpio）、草鱼（Ctenopharyngodon ideUus）和凡纳滨对虾（Penaeus vannamei Boone）可食部分为基质的平均回收率为87．92％～98．37％,相对标准偏差为0．96％～4．97％。该方法操作简单、灵敏度高、净化效果理想、重珊陛好,可满足水产品中氟胺氰菊酯的定性定量检测的要求。     

饲料蛋白质和能量水平对草鱼幼鱼生长和消化酶活性的影响

在水温24～29℃下,将675尾规格整齐、健康、体质量为（35.59士0.44）g的草鱼（Ctenopharyngodon idel-lus）随机分为9个处理,每处理3个重复,放养于水泥池中的网箱（100cm×50cm×100cm）内,投喂以鱼粉和豆粕为蛋白源,豆油作为脂肪源配制的3个蛋白水平（24%、28%、32%）,每一蛋白水平设3个脂肪水平（4%、6%、8%）,共计9种饲料。饲料蛋能比（P/E）在15.81-22.46 mg·kJ-1之间。92d的饲养表明：D4组（蛋白质含量为28.02%,脂肪为4.30%）草鱼的特定生长率最高,显著高于其他各组（P〈0.05）。随着饲料中蛋白含量的增加,草鱼全肠中蛋白酶的活力逐渐升高,之后又降低,以D4组饲料的蛋白酶活性最高,显著高于D1、D8和D9（P〈0.05）。本实验表明,该生长阶段的草鱼所需最适蛋白水平为28.02%,能量为14307kJ.kg-1,P/E约为19.58mg·kJ-1。     

超高效液相色谱-电喷雾串联质谱法同时测定鱼类加工品中12种杂环胺类化合物

建立了超高效液相色谱-电喷雾串联质谱法同时测定鱼类加工品中12种杂环胺类化合物（HAAs）的分析方法。经过条件优化,肉样选用乙酸乙酯、氨水和三乙胺提取,提取液经MCX固相萃取小柱净化,按V（甲醇）∶V（氨水）=9∶1洗脱,采用Thermo Hypersil Gold C18色谱柱,以甲醇和5 mmol.L-1乙酸铵溶液为流动相进行梯度洗脱分离,电喷雾离子源（ESI）,正离子模式,采用选择反应监测（SRM）扫描模式,内标法进行定量分析。结果表明,12种HAAs在1.0～100.0μg.L-1范围内线性关系良好,相关系数R〉0.99,在12 min内实现分离,3个加标水平的平均回收率为42.98%～125.00%（n=6）,相对标准偏差（RSD）为1.49%～9.88%,检测限（LOD）为0.3～1.0μg.kg-1。该方法简便快捷,准确度高,易推广应用,可作为快速测定鱼类加工品中多种HAAs的有效方法。