两种微孢子虫孢子表面蛋白及对家蚕侵染性的比较研究

对来自家蚕的内网虫属样微孢子虫和家蚕微孢子虫的形态、表面蛋白及侵染性进行了比较研究。内网虫属样微孢子虫孢子显著小于家蚕微孢子虫 ,孢囊中孢子数为 8～ 32个 ,只侵染中肠组织 ,对家蚕无胚胎传染性。SDS UreaPAGE和 2D PAGE图谱显示两种孢子表面蛋白有明显差异。在SDS UreaPAGE中 ,内网虫属样微孢子虫的主要表面蛋白为 2 2kD ,而家蚕微孢子虫为 4 5kD。 2D PAGE显示 ,当上样量为 12 0 μg时 ,内网虫属样微孢子虫孢子表面蛋白斑点有 330多个 ,而家蚕微孢子虫孢子只有 16 0多个 ,其中仅有 10多个相同或疑似蛋白点。家蚕微孢子虫的主要表面蛋白点约有 2 0个 ,以中性偏酸的小分子居多 (<18kD ,pI 5 .4～ 7.2 ) ;内网虫属样微孢子虫有 30多个 ,分布较分散。根据两种孢子都能感染家蚕的特点 ,认为相同或疑似蛋白与是否能够感染有关 ,而大量差异蛋白与对家蚕的感染程度有关。两孢子表面蛋白中的主要蛋白均为差异蛋白 ,可能是孢子表面的结构蛋白。     

家蚕微孢子虫假定层粘连蛋白基因NbHLAMB4的克隆和序列分析及互作蛋白质筛选

层粘连蛋白是重要的细胞外基质成分之一,在基膜的构建及细胞的黏附等方面都有重要作用。通过检索微孢子虫数据库发现家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)存在假定层粘连蛋白基因Nb HLAMB4,根据该基因序列设计引物,以家蚕微孢子虫基因组DNA为模板克隆了Nb HLAMB4基因。该基因的开放阅读框(ORF)全长为1 104 bp,预测编码的蛋白质含有367个氨基酸,分子质量为43.74 k D,等电点为5.72。Nb HLAMB4蛋白序列含有一个N-糖基化位点和Pfam:SAS-6_N结构域,无信号肽,也无跨膜结构域。应用酵母双杂交技术,以Nb HLAMB4作为诱饵蛋白,通过筛选家蚕中肠c DNA文库,初步得到3个与Nb HLAMB4互作的候选蛋白质,分别是家蚕热休克蛋白(Hsp40)、锌指蛋白420类似物(similar to zinc finger protein 420)、氨肽酶N(aminopeptidase N)。研究结果为阐明家蚕微孢子虫的侵染机制提供了新的线索。     

柞蚕微孢子虫部分孢壁蛋白的分离鉴定及孢壁蛋白8的序列分析

研究柞蚕微孢子虫的孢壁蛋白组成和结构特点,有助于解明柞蚕微孢子虫在侵染过程中与蚕体细胞的互作机制。分别采用煮沸法和Laemmli法分离提取柞蚕微孢子虫总蛋白和孢壁蛋白,回收30kD左右的蛋白条带进行液质联用离子阱电喷雾质谱分析,获得的短肽序列经Mascot在线检索工具进行蛋白同源序列比对,共鉴定出27种具有功能注释的蛋白,有3种注释为孢壁蛋白。其中获得了与家蚕微孢子虫孢壁蛋白8(NbSWP8)高度同源的柞蚕微孢子虫孢壁蛋白8(NaSWP8)的基因全长序列。序列分析表明NaSWP8与NbSWP8的氨基酸序列相似性达到90%,且均具有特征性的肝素结合基序,二者的编码基因核苷酸序列的非同义替换率和同义替换率比值(dN/dS)明显小于1,表明孢壁蛋白8基因在2种蚕类微孢子虫中受到纯化选择压力的作用,基因的功能相对稳定。     

微孢子虫O-甘露糖糖基化通路相关酶基因序列的比较分析

糖蛋白在免疫识别、信号转导等生命进程中扮演重要角色。为研究微孢子虫糖蛋白及其糖基化类型,采用比较基因组学方法对微孢子虫O-甘露糖糖基化通路进行分析。真核生物的O-甘露糖糖基化通路中有6种主要酶类,包括己糖激酶、磷酸甘露糖酶、GDP甘露糖磷酸化酶、Dol-P甘露糖合成酶、甘露糖转移酶、Dol-P甘露糖蛋白甘露糖转移酶。通过生物信息学方法分析家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)、蜜蜂微孢子虫(Nosema ceranae)、兔脑炎微孢子虫(Encephalitozoon cuniculi)、肠脑炎微孢子虫(Encephalitozoon intestinalis)、比氏肠道微孢子虫(Encephalitozoon bieneusi)和柞蚕微孢子虫(Nosema antheraea)的这6种酶基因编码氨基酸序列特征及结构域类型,发现这些酶的垂直同源基因比较保守,多重序列比对表明在6种微孢子虫之间,6种酶的氨基酸序列相似性比较高,系统进化分析显示同属的微孢子虫多聚为一簇。研究结果表明,N.bombycis、N.ceranae、E.cuniculi、E.intestinalis和N.antheraea 5种微孢子虫的O-甘露糖糖基化的蛋白质修饰通路是完整、保守的,然而在E.bieneusi中,其关键酶Dol-P甘露糖蛋白甘露糖转移酶的氨基酸序列比较短,只有342个氨基酸,缺失了关键结构域PMT,因此可能无法完成O-甘露糖糖基化修饰。以上微孢子虫的O-甘露糖糖基化通路中6种主要酶的序列信息,为后续解析家蚕微孢子虫糖基化通路及对糖蛋白糖基化类型与功能的研究提供了线索。     

家蚕微孢子虫感染家蚕对其中肠和血液蛋白酶活性影响

本试验测定了不同浓度剂量微孢子虫感染家蚕后,家蚕中肠和血液中蛋白酶的变化.并对不同浓度剂量家蚕微孢子虫感染家蚕后对家蚕发育的影响和不同组织中所含微孢子虫孢子的浓度等作了初步的研究.从本实验中可以看出,感染不同浓度微孢子虫的家蚕,体内相同组织的微孢子虫数量存在显著差异.而感染相同浓度微孢子虫的蚕,不同组织中微孢子虫的数量也有差异,中肠的微孢子虫数量远高于其他部位.感染微孢子虫后,家蚕血液中的蛋白酶活性显著升高,中肠的蛋白酶的活性变化不显著,而感染微孢子虫的数量对血液和中肠中的蛋白酶的活性无显著影响.     

家蚕微孢子虫海藻糖酶(Trehalase)基因的生物信息学分析及原核表达和多克隆抗体制备

海藻糖是家蚕微孢子虫(Nosema bombycis,Nb)成熟孢子的主要糖类物质之一,海藻糖酶作为海藻糖代谢的主要催化酶,在微孢子虫的发芽及侵染过程中发挥重要作用。通过生物信息学分析发现,家蚕微孢子虫的海藻糖酶具有4个序列相似度较高的编码基因拷贝(Nb Tre1、Nb Tre2、Nb Tre3和Nb Tre4),除了Nb Tre4编码蛋白质的N端有18个氨基酸组成的信号肽,其他拷贝的编码蛋白质均没有信号肽结构域,但都具有少数的N-糖基化位点,而没有O-糖基化位点,此外,丝氨酸磷酸化位点的比率也较高,二级结构较为简单,仅有螺旋区和低复杂度区。基于生物信息学分析结果,设计特异性引物克隆了Nb Tre1基因,该基因片段长933 bp,编码310个氨基酸,预测蛋白质分子质量36.7 k D,蛋白质的氨基酸序列有2个潜在的N-糖基化位点和14个磷酸化位点。通过构建重组表达载体并转化Escherichia coli Rosetta(DE3)感受态细胞,获得Nb Tre1蛋白的表达菌株,利用IPTG诱导获得大量以包涵体形式表达的融合Nb Tre1蛋白,其分子质量与预期值一致。融合Nb Tre1蛋白经亲和层析纯化后免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,利用间接ELISA法测定多克隆抗体的效价达1∶25 600。通过Western blot检测验证了该多克隆抗体的特异性,制备的多克隆抗体能够应用于家蚕微孢子虫海藻糖酶的检测等。     

家蚕微孢子虫海藻糖合成酶基因Nbtps1的克隆与原核表达

海藻糖在保护细胞质膜和生物大分子空间结构,维持胞内渗透压增大的过程中发挥重要作用,海藻糖合成酶是海藻糖合成途径中的一个关键酶。通过检索微孢子虫基因组数据库发现,家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)基因组中含有4个海藻糖合成酶基因,其中Nbtps1基因的开放阅读框长1 386 bp,为单外显子结构,编码461个氨基酸残基,预测蛋白质分子质量53.7 k D,等电点5.19。Nb TPS1蛋白序列含有1个糖基转移酶结构域和4个潜在的N-糖基化位点,亚细胞定位预测该蛋白质位于细胞质中。多重序列比对分析结果表明,Nb TPS1与东方蜜蜂微孢子虫(Nosema ceranae)、兔脑炎微孢子虫(Encephalitozoon cuniculi)海藻糖合成酶的氨基酸序列相似度分别为59.0%、54.7%,系统发育进化树显示三者的亲缘关系与之相符。构建重组表达载体Nbtps1/p ET-28a(+)并转化大肠埃希菌Rosetta(DE3)菌株,经IPTG诱导表达及亲和纯化后获得最终质量浓度为1.18 mg/m L的重组融合蛋白His-Nb TPS1。用纯化后的融合蛋白制备兔多克隆抗体Anti-Nb TPS1,利用间接ELISA法测定多克隆抗体的效价达1∶25 600,并通过Western blotting检测验证了该多克隆抗体的特异性,为研究Nb TPS1的生物学功能以及家蚕微孢子虫的间接免疫检测奠定了实验基础。     

家蚕微孢子虫伴侣蛋白CCTθ的鉴定

家蚕微粒子病是一种严重危害蚕种生产的蚕病,被列为蚕桑生产唯一的检疫对象.分子伴侣协助底物蛋白折叠、装配和转运,但目前对家蚕微孢子虫分子伴侣CCT(chaperonin containing tailless complex polypeptide)的研究较少.本研究克隆了家蚕微孢子虫NbCCTθ基因,构建原核表达载体pET-28a-NbCCTθ表达重组蛋白,纯化后制备多克隆抗体.间接免疫荧光分析结果显示,NbCCTθ在家蚕微孢子虫的整个生命周期中均表达,但在不同发育阶段分布不同;在成熟孢子中主要分布于细胞质和质膜上,在裂殖增殖期主要分布于细胞质中,孢子形成期后期定位在细胞核中.研究结果为进一步探索NbCCTθ的具体功能奠定了基础,对家蚕微粒子病的防治也有一定的指导意义.     

家蚕Bmtutl-519蛋白在家蚕微孢子虫感染BmEN细胞中的作用

家蚕Bmtutl-519蛋白是家蚕Turtle蛋白的一个亚型,属于免疫球蛋白超家族。在家蚕微孢子虫感染BmN细胞后,Bmtutl-519的相对表达水平明显上调。在BmN细胞中,通过间接免疫荧光分析(indirect immunoinfluscent assay,IFA)、共定位实验、蛋白印迹法以及增强型绿色荧光蛋白(EGFP)融合载体转染Bmtutl-519表达质粒来研究Bmtutl-519的亚细胞定位。结果表明,Bmtutl-519在BmN细胞的细胞质和细胞膜中均有分布。Bmtutl-519可能作为细胞表面受体或调控因子参与了家蚕微孢子虫的感染过程。Bmtutl-519与家蚕微孢子虫壁蛋白NbSWP26(参与宿主细胞粘附和感染过程)的相互作用分析表明,NbSWP26的C端肝素结合基序(heparin-binding motif,HBM)介导了这两种蛋白之间的相互作用。在将NbSWP26的赖氨酸突变为甘氨酸(K208G、K209G、K210G和K213G)的突变型中,NbSWP26蛋白中HBM的突变导致其结合Bmtutl-519蛋白的能力丧失。微孢子虫粘附和感染试验表明,Bmtutl-519增强了家蚕微孢子虫与宿主细胞表面的结合能力,但并没有增强家蚕微孢子虫对宿主细胞的感染能力。相反,在BmN细胞中,Bmtutl-519的持续高表达抑制了家蚕微孢子虫的增殖。     

家蚕微孢子虫半胱氨酸脱硫酶基因的克隆及表达和亚细胞定位

半胱氨酸脱硫酶是一类活性依赖于磷酸吡哆醛的酶类,可催化L-半胱氨酸转化为L-丙氨酸和硫烷硫原子,为铁硫簇组装提供硫原子。基于家蚕微孢子虫基因组数据,克隆了家蚕微孢子虫半胱氨酸脱硫酶(NbNfs)基因。序列结构分析显示NbNfs含有其活性所需的保守氨基酸位点,但不具有线粒体型N端导肽;系统发育分析表明微孢子虫半胱氨酸脱硫酶与真菌线粒体型半胱氨酸脱硫酶聚为一类,属于类群Ⅰ,起源于α-变形细菌;共线性分析表明半胱氨酸脱硫酶基因在不同微孢子虫之间其基因座位保守,具有共线性。构建重组质粒pET30a(+)-NbNfs,并转化到E.coli Rosetta(DE3),经IPTG诱导表达NbNfs融合蛋白,用Ni-NTA亲和层析柱进行纯化后,将融合蛋白免疫昆明小鼠制备多克隆抗体,Western blotting检测NbNfs在成熟家蚕微孢子虫具有表达。胶体金免疫定位显示NbNfs主要定位于成熟家蚕微孢子虫的细胞质中。研究结果为家蚕微孢子虫铁硫簇组装途径的研究奠定了基础。     

家蚕微孢子虫cDNA文库的构建及部分EST同源性分析

以成熟的家蚕微孢子虫 (Nosemabombycis,N .b)为实验材料 ,以λTriplEx2为载体 ,构建了滴度为 1 86× 10 6pfu/mL ,插入片段平均在 5 0 0bp以上的较高质量的家蚕微孢子虫cDNA文库。从cDNA文库中随机挑取 180个克隆进行EST测序 ,得到了 130个有效序列。经BLASTn、BLASTx同源性分析后发现 ,7个ESTs编码基因在氨基酸水平上与脑孢虫有较高的同源性 ,推定为家蚕微孢子虫基因 (putativegene) ,同时获得了 2 7个未知序列。     

两种微孢子虫全基因组中密码子偏好性比较

微孢子虫(Microsporidia)是一类细胞内营专性寄生的单细胞真核生物.基于其已测得的两个典型种的基因组数据,比较了家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)与兔脑炎微孢子虫(Encephalitozoon cuniculi)之间全基因组的密码子偏好性异同.结果表明两基因组的密码子偏好性都较弱,基因表达程度都...     

家蚕微孢子虫细菌人工染色体文库的构建

细菌人工染色体(BAC)文库是进行生物基因组学研究的一个重要手段。以家蚕微孢子虫(Nosema bomby-cis)重庆分离株为材料,在前期构建的家蚕微孢子虫基因组框架图数据基础上,对构建家蚕微孢子虫BAC文库过程中的关键技术,如脉冲胶块(plug)的制备与处理、限制性酶的筛选、DNA的部分消化、酶切片段的选择、插入DNA片段与载体的摩尔比值等进行了研究,建立了构建家蚕微孢子虫BAC文库适宜的技术体系。构建的家蚕微孢子虫BAC文库由6 478个克隆构成,克隆片段平均大小约为50 kb,相当于家蚕微孢子虫基因组(15.33 Mb)的20倍,文库空载率较低,有利于深入开展家蚕微孢子虫基因组相关方面的研究。     

家蚕微粒子病的PCR诊断技术研究

在ＤＮＡ水平上，以聚合酶链反应（ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎＲｅａｃｔｏｎ，ＰＣＲ）技术检测家蚕微孢子虫的结果。设计、合成了两对引物，其中引物Ⅰ是针对家蚕微泡子虫（ＮｏｓｅｍａｂｏｍｂｙｃｉｓＮ．ｂ．）引物Ⅱ是针对变形孢子虫（ＶａｉｒｉｍｏｒｐｈａｎｅｃａｔｒｉｘＶ．ｎ，）的。用这两对引物分别对“桑尺蠖微孢子虫”孢子ＤＮＡ和Ｎ．ｂ．（镇江株）的纯孢子及其感染的幼虫、蛹及蛾的ＤＮＡ进行ＰＣＲ扩增，均获得预期的阳性条带；对不同引物扩增的产物进行了ＤＮＡ序列分析。初步认为引物Ⅰ可作为家蚕微孢子虫Ｎ．ｂ．特异性较高的检测引物，而引物１是微孢子虫共有的检测引物。进一步讨论了对家蚕微孢子的检测及分类上的问题。     

家蚕微粒子孢子单克隆抗体的研制及其在检测上的初步应用

将家蚕微粒子Nosema bombycis孢子免疫的BALB/c小鼠的脾细胞和FO细胞融合,经克隆筛选获得6株能稳定分泌抗N.bombycis孢子表面抗原的单克隆抗体细胞株(Nb_(1-6))。其中Nb_(1-2)和Nb4分泌的抗体属于IgM,Nb_3,Nb_5和Nb_6分泌的分别为IgG_2b、IgG和IgG_3。特异性检查结果表明,除Nb_4和Nb_6对柞蚕微粒子孢子有交叉凝集反应外,其余均对家蚕N.bombycisJ孢子具特异性。杂交瘤细胞培养上清液对N.bombycis孢子的凝集效价以Nb_1为最高,达1:256,由此细胞株诱发的腹水效价高达1:5000。建立了以普通聚苯乙烯酶标板为载体,完整的N.bombycis孢子为抗原的LEISA测定方法,最低检测量为700个孢子。     

一种适用于双向电泳的家蚕微孢子虫总蛋白的制备方法

本文对适用于双向电泳的微孢子虫总蛋白提取方法进行了探讨。研究表明，采用液氮多次冻融结合手工研磨，再用裂解液抽提的方法能够得到产率较高且适用于双向电泳的家蚕微孢子虫总蛋白。     

家蚕几种病原微孢子虫的比较研究

从不同地区养蚕生产及桑园害虫中分别收集到四种微孢子虫，ＭＡ—１、ＭＤ—１、Ｐｈａ—Ｍ和Ｈａ—Ｍ。从它们孢子的形态、对蚕的致病性、相互间的血清学关系、在蚕体内的寄生部位和引起的组织与细胞病变以及在蚕体内增殖的生活史等方面与典型的家蚕微粒子病病原Ｎｏｓｅｍａｂｏｍｂｙｃｉｓ进行了比较研究。结果表明，ＭＡ—１与Ｎ．ｂｏｍｂｙｃｉｓ相同；Ｈａ—Ｍ可能亦来源于Ｎ．ｂｏｍｂｙｃｉｓ；ＭＤ—１为Ｎ．ｂｏｍｂｙｃｉｓ的形态变异株，定名为Ｎ．ｂｏｍｂｙｃｉｓｍｏｒ．ｖａｒ．；而Ｐｈａ—Ｍ为与Ｎ．ｂｏｍｂｙｃｉｓ不同的种，暂称为Ｎｏｓｅｍａｓｐ。     

家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)侵染草地贪夜蛾卵巢细胞(Sf21)体系的建立

家蚕微孢子虫(Nosemabombycis,简称N.b)经KOH处理后,接种于草地贪夜蛾卵巢细胞(Sf21),建立家蚕微孢子感染增殖体系,同时,对孢子与宿主细胞在感染增殖过程中的形态变化进行了跟踪观察。KOH处理的孢子发芽率约为67%,Sf21细胞的初期感染率约为4.3%,接种24h内,细胞感染率变化不明显,但随后逐渐增加,到接种后的第7天达76.9%。接种后第12天起,细胞内充满不同发育阶段的孢子,并可见大量的胞外游动孢子。随后,大量细胞破裂,孢子逸出后,破裂的细胞内出现大量囊泡,且有合胞体(巨型多核融合细胞)出现。另外,将感染孢子的家蚕中肠组织和丝腺组织用胰蛋白酶处理后直接接种Sf21细胞,不经发芽处理,细胞也能感染。     

家蚕微孢子虫PCR检测的研究

根据家蚕微孢子虫（Nosemebombycis,N．b）孢子的DNA序列，设计合成一对引物，对家蚕微孢子虫孢子及其近缘种孢子的DNA进行PCR检测。结果表明只有家蚕微孢子虫孢子DNA获得特异性扩增区带，大小为317bp，可以区别于Nosemasp.MG1和MG2、柞蚕微孢子虫、Vairimorphanecatrix及Pleistophoraanguillarum等。对N.b孢子DNA检测灵敏度达1ng水平。