布鲁氏菌A、M因子血清的研制

研制牛种布鲁氏菌A因子血清和羊种布鲁氏菌M因子血清,用于光滑型布鲁氏菌特异性种属鉴定。将灭活牛种布鲁氏菌2308株及羊种布鲁氏菌16M株免疫1.5~2 kg家兔各5只制备高免血清。对高免血清采用抗原交叉吸附的方法,制得A、M因子血清,分装冻干后置-20℃保存。微量试管凝集试验结果显示:研制的A因子血清对16M抗原在1∶2.5时无凝集现象,对2308抗原凝集价为1∶320;研制的M因子血清对2308抗原在1∶2.5时无凝集现象,对16M抗原凝集价为1∶160。玻片凝集试验结果显示:研制的A、M因子血清对异种抗原无凝集现象。试验表明,研制的A、M因子血清具有特异性强、效价高的特点,可辅助光滑型布鲁氏菌特异性种属鉴定。     

布鲁氏菌20kD外膜蛋白的表达和鉴定

布鲁氏菌病是由布鲁氏菌引起的一种人畜共患病,在家养和野生哺乳动物中会引起流产和不育.目前,世界各国动物布病的普查、监测及贸易检疫的检测方法难以区别布鲁氏菌自然感染动物和疫苗免疫接种动物,而且也不能鉴别布鲁氏菌与其他革兰氏阴性菌存在免疫学交叉反应.许多学者报道,通过检测动物血清中的布鲁氏菌菌体蛋白抗体可以大幅度提高布鲁氏菌病诊断的特异性.由于布鲁氏菌外膜蛋白暴露于细菌表面,在布鲁氏菌不同种之间具有保守性,动物感染后可以产生针对不同蛋白的特异性抗体[1-4].因此,本研究试图通过克隆、表达布鲁氏菌的不同种类外膜蛋白抗原,探讨该蛋白抗原对布病自然感染动物血清的反应性,以期获得适合布鲁氏菌不同感染时期的诊断、检测试剂,同时为动物布鲁氏菌病基因工程疫苗研制奠定基础.     

一种检测奶样中布鲁氏菌抗体免疫层析方法的建立

通过制备脂多糖(LPS)并将其作为检测抗原,建立了一种检测奶样中布鲁氏菌抗体的酶联免疫层析方法。通过对处理方法和反应条件的优化,制备出敏感性高、特异性强的布鲁氏菌抗体检测试纸条。该试纸条敏感性为98.0%,抗体滴度为1:2~1:8,特异性为96.0%,且与其他常见病原无交叉反应,批内、批间重复性良好。保存期加速试验显示,该试纸条在2~30℃下可保存12个月;符合率验证显示,该方法与标准奶样的符合率达94.9%。上述结果表明,该检测方法具有敏感性高、特异性强以及方便、快捷等优点,适用于现场大批量检测,因而可应用于奶牛场布鲁氏菌病的快速诊断。     

单克隆抗体牛型布鲁氏菌乳胶凝集试验的研究

布病是一种严重的人兽共患传染病,其致病因子为布鲁氏菌(Brucella).根据致病性的不同和宿主特异性,将其分为6个生物种:羊型布鲁氏菌(B.melitensis)、流产型布鲁氏菌(B.abortus)、猪型布鲁氏菌(B.suis)、绵羊型布鲁氏菌(B.ovis)、犬型布鲁氏菌(B.canis)、沙林鼠型布鲁氏菌(B.neotomae)[1].     

多重PCR方法鉴别牛、羊、猪种布鲁氏菌株

用eri作为布鲁氏菌属特异性基因,以IS711基因拷贝数差异作为布鲁氏菌种间特异性标志,建立了鉴别牛、羊、猪种布鲁氏菌株的多重PCR方法。结果:牛种布鲁氏菌2308株扩增出大小为494 bp和178 bp的两条带,羊种布鲁氏菌M28株扩增出大小为733 bp和178 bp的两条带,猪种布鲁氏菌S1330株扩增出大小为285 bp和178 bp的两条带,均与预期吻合;而胸膜肺炎放线杆菌、多杀性巴氏杆菌、流产沙门菌、都柏林沙门菌、大肠杆菌均未扩增出任何条带。硫化氢和血清学试验结果也符合相应种布鲁氏菌的特点。结果表明,本研究的多重PCR方法可用于牛、羊、猪种布鲁氏菌株的快速鉴定。     

临床就诊犬布鲁氏菌病血清学调查

1绪论犬布鲁氏菌病是由布鲁氏菌侵入机体引起的传染变态反应性人畜共患传染病,国内外均有犬感染该病的报道。犬布鲁氏菌病的检测主要采用国际标准中规定的虎红平板凝集试验(RBPT)、试管凝集试验(SAT)和补体结合试验(CFT)[1]。这些方法具有敏感性高、特异性强的特点。但由于试管凝集试验和补体结合试验操作繁琐、费时,抗原、血清用量较大,试管、吸管反复刷洗,在标本量大的布鲁氏菌病     

布鲁氏菌和鹦鹉热衣原体双重PCR检测方法的建立与应用

为建立同时检测布鲁氏菌和鹦鹉热衣原体的双重PCR方法,本研究据GenBank上已发表的具有属间特异性的布鲁氏菌bp26基因和鹦鹉热衣原体23S rRNA基因,利用 Primer Premier 5.0软件各设计1对特异性引物,扩增的目的片段长度分别为219和356 bp。通过优化反应条件,建立了能同时检测布鲁氏菌和鹦鹉热衣原体的双重PCR方法。该方法具有较好的特异性和可重复性,对2种基因单重PCR检测敏感性均达到3.1×10²拷贝/反应,双重检测的灵敏度为3.1×10³拷贝/反应。利用该双重PCR方法对流产牛抗凝全血、血清、流产胎儿及奶液共172份临床疑似布鲁氏菌感染的样品进行检测,检测到布鲁氏菌阳性样品53份,鹦鹉热衣原体阳性样品2份,以上这2种病原的阳性检出率分别为30.8%和1.2%,且检测到2种病原混合感染的阳性样品2份,阳性检出率为1.2%。临床应用结果表明,该方法可用来对布鲁氏菌和鹦鹉热衣原体进行同步、快速、灵敏的检测。     

PCR技术在布鲁氏菌检测与鉴别中的应用

布鲁氏菌是一种可感染多种哺乳动物的人兽共患病病原,能给公共卫生和畜牧业带来严重危害。常用的布鲁氏菌病原检测方法包括布鲁氏菌分离培养和分子生物学方法。其中的PCR技术具有特异性强、灵敏度高、操作简便等优点,在布鲁氏菌检测、菌种鉴别、疫苗株与野毒株区分等方面得到了广泛应用。本文综述了PCR技术在通用型布鲁氏菌、不同种型布鲁氏菌及布鲁氏菌疫苗菌株检测与鉴别中的应用研究,以期为检验检疫、流行病学调查、人与动物布鲁氏菌病诊断等提供技术参考。     

布鲁氏菌种荧光定量PCR快速检测方法的建立

根据荧光定量PCR原理和技术,通过与Gene Bank数据库中布鲁氏菌基因组进行序列比对,选择不同种属布鲁氏菌的特异性位点,设计3对引物和Taqman荧光探针。将3对引物进行独立的种特异荧光定量PCR实验优化,最终实现在1次荧光定量PCR反应中完成对牛种、羊种、猪种布鲁氏菌的鉴别和定量。该检测方法特异、敏感、快速,既能实现对布鲁氏菌的分种,又能实现定量快速检测,对于布鲁氏菌病的流行病学调查和防治都具有重要意义。     

1种布鲁氏菌微滴式数字PCR检测方法的建立

本研究旨在构建1种布鲁氏菌（Brucella）微滴式数字PCR方法（droplet digital PCR，ddPCR）。以布鲁氏菌BCSP31基因为靶基因，选取保守区域设计引物和探针，构建了布鲁氏菌微滴式数字PCR方法。然后优化了ddPCR反应中的引物、探针浓度及退火温度，并进行方法的灵敏度、特异性和重复性试验。结果表明，ddPCR的最佳引物和探针浓度分别为900 nmol·L^-1和250 nmol·L^-1，最佳的退火温度为58℃。ddPCR的线性良好，最低检测下限为1.12 copies·μL^-1，与大肠杆菌O：157菌株等其他4种细菌无交叉反应，而且批内重复性和批间重复性都较好。综上表明，本研究建立的ddPCR方法灵敏度高、特异性强，可对布鲁氏菌感染的临床样品进行定量检测。     

布鲁氏菌外膜蛋白16单克隆抗体的制备及初步应用

旨在制备布鲁氏菌外膜蛋白16(OMP16)单克隆抗体，建立OMP16抗体竞争ELISA方法，为布病临床防控提供免疫血清学检测手段。本研究选取保守性高、免疫原性良好的布鲁氏菌OMP16,经原核表达获得携带GST或His标签的重组OMP16(rOMP16)。利用杂交瘤技术筛选可稳定分泌OMP16特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株，经亚型鉴定、细胞核型分析和抗体交叉反应性试验分析单抗性质。制备小鼠腹水并纯化，方阵滴定法建立布鲁氏菌OMP16抗体竞争ELISA方法。结果表明，成功构建OMP16原核表达系统，经表达、纯化获得rGST-uOMP16和rHis-OMP16。筛选到1株遗传稳定的OMP16特异性杂交瘤细胞株，命名为B7;经鉴定，该抗体亚型为IgM-κ型，可识别目的蛋白，与标签蛋白无交叉反应。建立了布鲁氏菌OMP16抗体竞争ELISA方法，该方法与试管凝集试验检测结果相比总体符合率为90.53%,显示出良好的一致性。本研究有望为布鲁氏菌病的临床防控提供特异性高、敏感性好的免疫血清学检测方法。     

布鲁氏菌环介导等温扩增（LAMP）可视化检测方法的建立

应用环介导等温扩增(LAMP)技术建立了布鲁氏菌可视化快速检测方法。针对布鲁氏菌外膜蛋白OMP25基因保守区设计6条特异引物,反应前加入染料羟基萘芬蓝(HNB)作为LAMP扩增的指示剂,63℃恒温反应60min,根据HNB的颜色变化进行结果判定。分别评价所建立LAMP方法的特异性和灵敏性,并对60份牛布鲁氏菌病虎红平板凝集试验(RBT)阳性血清样本,经LAMP和B4/B5-PCR方法进行平行检测。结果显示,本方法最低检出限约为17fg布鲁氏菌基因组DNA。本方法特异性良好,布鲁氏菌反应管均出现特异性LAMP扩增反应,而猪大肠杆菌K99、巴氏杆菌C48-1、猪链球菌ST171、绿脓杆菌等对照组均未出现扩增。针对60份RBT阳性血清的平行检测结果显示,LAMP和B4/B5-PCR这两种方法间的结果符合率为85.0%。B4/B5-PCR检测为阳性的43份样品,经本方法检测全部为阳性;B4/B5-PCR检测为阴性的17份样品,经本方法检测,9份为阳性,8份为阴性。LAMP的敏感性高于B4/B5-PCR方法。实验表明,本文所建立的基于颜色判定的布鲁氏菌LAMP检测方法具有特异、灵敏、设备要求简单等特点,适用于基层兽医部门进行布鲁氏菌的快速检测。     

奶牛布鲁氏菌病的病原分离与鉴定

本试验对疑似布鲁氏菌病的样本进行了病原分离,采用血清学试验、染色镜检、PCR和基因克隆测序对分离菌株进行了鉴定。结果表明,4株分离菌株均为布鲁氏菌属细菌,与布鲁氏菌参考菌株的核苷酸同源性为99.52%~100%。采用AMOS PCR对4株分离菌株进行种特异性鉴定,结果显示,1株为猪种布鲁氏菌,3株为牛种布鲁氏菌。     

荧光原位杂交在布鲁氏菌和牛结核分枝杆菌检测中的应用

荧光原位杂交技术可快速鉴定病原菌,较传统病原分离鉴定方法具有明显优势。针对我国动物布鲁氏菌病和牛结核病这两个重要的人兽共患病,目前还没有标准的荧光原位杂交检测方法可供参考。为建立布鲁氏菌和牛结核分枝杆菌荧光原位杂交检测方法,快速诊断动物布鲁氏菌病和牛结核病,利用布鲁氏菌探针Bru-996和结核分枝杆菌探针MTB770,通过优化杂交温度、杂交时间和样品处理等关键条件,确定最佳检测程序;根据已知背景的菌株和临床样品,对Bru-996和MTB770探针的特异性和敏感性进行评价,最终建立了荧光复位杂交诊断方法。结果显示:反应条件优化后,该方法可在4h内完成布鲁氏菌检测;荧光标记Bru-996探针与布鲁氏菌待检菌株的杂交结果均为阳性,而与结核分枝杆菌、禽结核分枝杆菌和大肠杆菌杂交结果均为阴性,并从5个已知背景的组织病料中成功检出布鲁氏菌。牛结核分枝杆菌检测则需要6~8h,杂交前必须对样品用二甲苯和溶菌酶进行处理;MTB770探针可特异性识别并能从牛肺部结节中检出牛结核分枝杆菌。结果表明,荧光原位杂交方法快速、简便,而且Bru-996和MTB770探针分别在布鲁氏菌和牛结核分枝杆菌检测上具有较高的特异性,可替代传统的病原分离鉴定,作为动物布鲁氏菌病和牛结核病的实验室确诊方法。     

布鲁氏菌实时定量荧光PCR检测体系的建立及应用

本根据GenBank上公布的布鲁氏菌BCSP31基因保守区域序列设计合成一对特异性引物与TapMan探针,建立整套快速准确鉴定布鲁氏菌的实时定量荧光PCR检测体系。以实验室构建的克隆有布鲁氏菌目的片段的重组质粒为标准品,进行实时定量荧光PCR反应检测,通过优化反应条件,建立标准曲线。以标准品为模板,对该方法的特异性、敏感性与重复性进行检测与分析。并以临床样本进行检测的结果进行比较分析,结果表明,该检测体系的检测灵敏度高,重复性与特异性良好。本研究建立的实时定量荧光PCR可用于准确检测样本中的少量的布鲁氏菌,具有良好的应用前景和市场价值。     

布鲁氏菌病的检测方法

1病原学检测方法 布鲁氏菌及其种与生物型的检测鉴定，除直接进行病原分离和鉴定方法外，用过氧化物酶标记或荧光标记的特异性免疫染色检验方法也有报道。     

布鲁氏菌4种高通量抗体检测方法的比较研究

旨在科学选择和使用布鲁氏菌抗体检测方法,推动布病诊断试剂标准化。本研究用布病阳性血清标准品测定了国家/OIE布鲁氏菌病参考实验室开发的布鲁氏菌荧光偏振（FPA）抗体检测试剂盒、动物布鲁氏菌病竞争ELSIA （cELISA）抗体检测试剂盒、牛布鲁氏菌病间接ELISA （iELISA）抗体检测试剂盒和改进的微量补体结合试验（mCFT）等4种方法的灵敏度。通过对已知阴、阳性血清样品的检测,比较了各检测方法的敏感性和特异性,并用临床样本进一步比较了各种方法检测结果的吻合性。结果表明,4种方法检测的灵敏度基本一致,当布病阳性血清标准品按1∶20稀释（即50 IU·mL^-1）时均检测为阳性,1∶40稀释（即25 IU·mL^-1）时均检测为阴性。FPA、cELISA、iELISA和mCFT方法的敏感性分别为97.14%、100.00%、100.00%、98.57%,特异性分别为96.34%、95.12%、97.56%、100.00%。对315份临床样本的检测结果显示,各方法之间的符合率均高于90.00%,其中iELISA、FPA、cELISA与mCFT符合率分别为97.14%、96.83%、92.70%;FPA、cELISA与iELISA符合率分别为95.24%、93.65%;FPA与cELISA符合率为91.43%。iELISA、FPA、mCFT 3种方法之间吻合性最高,cELISA与其他3种方法之间的吻合性略低。     

特定病原引起的母犬繁殖障碍及应对措施

<正>1犬布鲁氏菌犬布鲁氏菌为革兰氏阳性菌,感染后可引起流产和不育,尤其给犬的饲养者造成严重的经济损失。犬布鲁氏菌是目前已知的唯一可特异性引起母犬不育的细菌,美国首先报道了犬布鲁氏菌不育症,随后也在其他国家发现。Barton(1977)发现,在美国约1.5%~6.6%的母犬经抗体反应诊断为感染本病,但英国没有犬布鲁氏菌病,只是Tayler等(1975)报道有一例母犬发生布鲁氏菌引起的流产。布鲁氏菌     

单重PCR鉴别犬4种布鲁氏菌检测方法的建立

为建立适合犬布鲁氏菌病临床检测的单重PCR方法,通过对比粗糙型（犬种）与光滑型（羊种、牛种和猪种）布鲁氏菌基因组DNA的序列差异,设计1对引物并优化反应条件,建立了可初步鉴别犬4种布鲁氏菌的PCR方法,然后对该方法的特异性和灵敏度进行评价,并对20份犬布鲁氏菌血清学阳性的血液样品进行临床检测。结果显示,利用建立的PCR反应体系对牛种、羊种和猪种布鲁氏菌均能扩增出717 bp的目的条带,对犬种布鲁氏菌能扩增出366 bp的目的条带;最低可检测到犬种、羊种、猪种和牛种布鲁氏菌基因组DNA浓度分别为5.07×10-2、6.20×10-2、7.80×10-3和5.50×10-2 ng/μL;20份血液样品中共检测到3份犬种布鲁氏菌阳性样品,与使用GB/T 18646—2018引物的PCR检测结果一致。结果表明,本试验建立的单重PCR方法简捷、特异、敏感,适合基层兽医实验室对犬布鲁氏菌病的检测与鉴定。     

两种诊断制品对临床样品中布鲁氏菌抗体的检测比较

本研究以国家标准《动物布鲁氏菌病诊断技术》(GB/T 18646-2018)中的试管凝集试验方法为确诊金标准,对353份临床牛、羊和猪血清样品进行确诊,然后分别采用虎红平板凝集试验抗原和抗体检测试纸条,对该353份临床血清进行检测,比较两种诊断制品在布鲁氏菌病初筛中的差异。经统计分析发现,虎红平板凝集试验抗原敏感性为100%(23/23),特异性为97.88%(323/330),与确诊结果间的Kappa值为0.86;布鲁氏菌抗体检测试纸条敏感性为100%(23/23),特异性为99.39%(328/330),与确诊结果间的Kappa值为0.95,两种方法的重复性试验结果均一致。试验结果证明,布鲁氏菌抗体检测试纸条和布鲁氏菌虎红平板凝集试验抗原都能满足布鲁氏菌病初筛的需求;由于布鲁氏菌抗体检测试纸条的储存、运输和操作的便捷性,在部分地区或特殊环境下可替代布鲁氏菌虎红平板凝集试验抗原用于布鲁氏菌病初筛。